Name: Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Click-Chemie die transkriptionelle Aktivität in mit Rift-Valley-Fieber-Virus infizierten Zellen messen. Diese nicht-radioaktive Methode ermöglicht die Visualisierung neu synthetisierter RNA.

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Wir bedanken uns bei RB Tesh für die Bereitstellung der Maus polyklonalen anti-RVFV Antiserum und M. Griffin des UTMB Durchflusszytometrie Core Facility für die Hilfe bei der Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde von 5 U54 AI057156 durch die Western Regional Center of Excellence, NIH R01 AI08764301 und Mittel aus dem Center for Vaccine Sealy Development bei UTMB.BK unterstützt wurde durch den James W. McLaughlin Fellowship Fund bei UTMB.OL wurde abgestützt durch eine Maurice R. Hilleman Frühe-Phase Karriere Investigator Award.

Analyse der Transkription durch Fluoreszenzmikroskopie 1. Zellen infizieren mit MP-12 und Label-Nascent RNA mit EU <ol><li> Platz 12-mm runde Deckgläschen in 12-Well-Gewebekulturplatte, ein Deckglas pro Well. </li></ol> Hinweis: Wenn Zellen haben Probleme Einhaltung Deckgläser, Mantel mit Poly-L-Lysin (MW ≥ 70.000), bevor sie in Brunnen. Zu diesem Zweck tauchen Deckgläser in einer sterilen 0,1 mg / ml in H 2 O aus Poly-L-Lysin für 5 min. Spülen Deckgläser mit sterilem H 2 O und der Luft trocknen für mindestens 2 Stunden. <ol start="2"><li> Um Saatgut 293 Zellen auf Deckgläser werden 5 x 10 4 Zellen in 1 ml Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin) pro Vertiefung. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 O / N. </li><li> Infect Zellen mit MP-12 mit einer Multiplizität der Infektion (moi) von 3. Mindestens zwei<html> infizierten Wells: eine der beiden Bohrungen werden als nicht infizierte Kontrolle zu dienen, wird die andere mit Actinomycin D (ActD) im Schritt 1.5 als Kontrolle für die transkriptionelle Unterdrückung behandelt werden. Entfernen Wachstumsmedium und verdünnen das Virus Lager, so dass das Gesamtvolumen in jede Vertiefung gegeben ist 200 ml. Inkubation für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> Hinweis: Anstelle Infizieren von Zellen, Zellen können auch mit Plasmid-DNA transfiziert werden oder in vitro synthetisierte RNA kodierend eine spezifische virale Protein. Zu diesem Zweck Transfektion von Zellen mit einem geeigneten chemischen Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers, und fahren bis 1,5 bei 16 Stunden nach der Transfektion Schritt. Es ist ratsam, die Transfektionsbedingungen und Inkubationszeit vor RNA-Markierung und Fixierung optimieren. <ol start="4"><li> Entfernen Inokulum und 1 ml frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung. Bei 37 ° C für 15 Stunden. </li></ol>ove_content &quot;&gt;. Hinweis: Wenn die Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, ist es ratsam, einen Zeitverlauf Experiment durchführen, um den optimalen Zeitpunkt für die RNA-Markierung und Fixierung bestimmen Richten Sie diese Zeit natürlich so, dass die Infektion Zeiten gestaffelt sind und alle Proben markiert, fixiert und gefärbt gleichzeitig. <ol start="5"><li> Bei 15 Stunden nach der Infektion (hpi), ersetzen Wachstumsmedium mit Medium mit 1 mM EU. Um eines der mock infizierten Brunnen, auch die 5 ug / ml ActD. Dies wird als Quelle für die transkriptionelle Unterdrückung dienen, wie ActD hemmt die DNA-abhängige RNA-Synthese. Zurück Zellen in den Inkubator. </li><li> Mit 16 hpi, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Deckgläschen einmal mit 1 ml PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) pro Vertiefung. Fix Zellen durch Zugabe von 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) pro Vertiefung und Inkubieren für 30 min bei RT. </li></ol>Hinweis: Um 4% PFA Fixierung Lösung vorzubereiten, löst 10 g Paraformaldehyd in 150 ml H 2 O auf 60 ° C auf einem beheizten Magnetrührer. In 500 ul 1 M NaOH und weiter rühren, bis die Lösung klar wird. Filter PFA-Lösung durch einen Papierfilter, um Partikel zu entfernen und hinzufügen 62,5 ml Phosphat-Puffer (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4). In H 2 O bis zu einem Gesamtvolumen von 250 ml. Einfrieren bei -20 ° C in Einzel-Portionen. <ol start="7"><li> Waschen einmal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. Keine Inkubationszeit für diese und alle nachfolgenden Waschschritte erforderlich. Fahren Sie direkt mit Schritt 2 fort. </li></ol> Anmerkung: Es ist wichtig, um sofort mit dem Click-Reaktion fortfahren, da die RNA degeneriert, wenn zu diesem Zeitpunkt für einen längeren Zeitraum gehalten werden, ein Verlust der RNA Fluoreszenzsignal bereits beobachtet, wenn die Zellen für 1 Stunde bei 4 ° C werden . Und falls probilden einen Zeitverlauf Experiment ist, lesen Sie Label, zu beheben, und färben alle Proben gleichzeitig. 2. Klicken Reaktion auf markierten RNA-Erkennung <ol><li> Durchdringbar Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Inkubieren für 10 min bei RT. </li></ol> Hinweis: Alle Lösungen in den Schritten 2.1 bis 2.3 müssen nucleasefreiem sein. <ol start="2"><li> Dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li><li> Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platte und Transfer in der feuchten Kammer. Cover jede Deckglas mit 50 - 100 ul Klick Färbelösung (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO 4, 20 uM fluoreszierenden Azid [Anregung / Emission maximal: 590/617 nm], 100 mM Ascorbinsäure) jeder. Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Zur Montage der feuchten Kammer, die untere Linie einer Zellkultur oder in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm mit Kunststoff-Folie Paraffin. Die die Innenseite des Randes des dish mit feuchten Papiertüchern. Legen Sie die Deckgläser auf die Kunststoff-Folie Paraffin. Hinweis: Achten Sie darauf, lassen Sie die Deckgläser austrocknen während diesem oder einem anderen Schritt in das Protokoll. Es ist am besten, um die Färbelösung jedem Deckglas direkt nachdem es in der feuchten Kammer platziert wurde hinzuzufügen. Hinweis: Bereiten Sie das Click Färbelösung frisch unmittelbar vor diesem Schritt. Stammlösungen von 1,5 M Tris, pH 8,5, 100 mM CuSO 4 und 500 mM Ascorbinsäure bei 4 ° C gelagert werden Allerdings verwerfen jede Ascorbinsäure stock Lösung, die gelb geworden ist. Hinweis: Achten Sie darauf, ein Fluorophor, die die Filter auf Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop passt zu wählen. <ol start="4"><li> Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und in einen frischen 12-Well-Platte und dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li></ol> Hinweis: Wenn kein deSchutz von viralen Proteinen gewünscht wird, Deckgläser montiert werden kann und abgebildet nach diesem Schritt (gehen Sie zu Schritt 3.3). 3. Immunfluoreszenz zu Expression viraler Proteine ​​erkennen <ol><li> 1 ml Blockierungspuffer (3% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS) in jede Vertiefung und Inkubieren für 30 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platte, Transfer in die feuchte Kammer und decken mit 50 - 100 ul primären Antikörper (anti-RVFV, eine Art Geschenk von Dr. RB Tesh, UTMB) in Blocking-Puffer (1:500) verdünnt. Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Bei der Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, bestimmen die optimale Verdünnung für Ihre primäre Antikörper zuerst. Hinweis: Alternativ kann dieser Schritt O / N bei 4 ° C durchgeführt werden, in der Dunkelheit. <ol start="3"><li> Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und Ort wieder in 12-Well-Platte und waschendreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li><li> Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platz, Platz in der feuchten Kammer und Deckel mit 50 - 100 ul sekundären Antikörper (anti-Maus-IgG konjugiert mit Fluoreszenzfarbstoff [Anregung / Emission maximal: 495/519 nm]) in Blocking-Puffer (1 verdünnt: 500). Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Achten Sie darauf, einen sekundären Antikörper, der Ihre primäre Antikörper erkennen und passt die Filter auf Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop zu wählen. Hinweis: Falls gewünscht, 200 ng / ml DAPI können an den sekundären Antikörper Verdünnung zugesetzt werden, um Kerne zu visualisieren. <ol start="5"><li> Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und Ort wieder in 12-Well-Platte und dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li><li> Montieren Deckgläser, indem ein Tropfen (ca. 15 ul) Fluoromount-G auf einen Objektträger. Tauchen Sie das Deckglas in H 2 O, entfernen überschüssiges H 2 O durch Berühren the Seite gegen ein Papiertuch und Ort Zell-Seite nach unten in den Tropfen Fluoromount-G. Air trocken für 5 min. </li></ol> Hinweis: Wenn Bildgebung auf einem inversen Mikroskop, ermöglichen Fluoromount-G bei 4 ° erstarren CO / N oder bringt die Deckgläser auf die Objektträger durch Abdichten der Kante mit transparenter Nagellack. Hinweis: Folien kann sofort abgebildet werden oder bei 4 ° C im Dunkeln bis zu einer Woche. 4. Erfassung von Daten <ol><li> Bild mit einem Fluoreszenz-Mikroskop. </li></ol> Hinweis: Achten Sie darauf, geeignete Fluorophore, die visualisiert werden können mit Ihrem Mikroskop zu wählen. Zum Vergleich sind die folgenden die Fluorophore und Filter-Sets verwendet werden, um die Bilder in dieser Veröffentlichung gezeigt erwerben. DAPI: Anregung Filter: BP 330-385 Dichromatic Spiegel: DM 400 Emission Filter: LP 420 Anregung Filter: BP 460-490 Dichromatic Spiegel: DM 505 Emission Filter: LP 510 Fluorophor mit einer Anregung / Emission maximal 590/617: Anregung Filter: BP 545-580 Dichromatic Spiegel: DM 600 Emission Filter: LP 610 Analyse der Transkription mittels Durchflusszytometrie 5. Zellen infizieren mit MP-12 und Label-Nascent RNA mit EU <ol><li> Seed 293-Zellen in 6-Well-Gewebekulturplatten in Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin). Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 bis 80 Zellen erreicht haben - 100% Konfluenz. </li><li> Infect Zellen mit MP-12 mit einer MOI von 3. Mindestens zwei nicht-infizierten Vertiefungen: eine der beiden Bohrungen als nicht infizierte Kontrolle dienen soll, wird die andere mit ActD in Schritt behandelt werden5.4. Entfernen Wachstumsmedium und verdünnen das Virus Lager, so dass das Gesamtvolumen in jede Vertiefung gegeben ist 400 ul. Inkubation für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Entfernen Inokulum und 2 ml frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung. Bei 37 ° C für 12 Stunden. </li></ol> Hinweis: Falls die Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, ist es ratsam, einen Zeitverlauf Experiment, um den optimalen Zeitpunkt für die Kennzeichnung und Ernte bestimmen durchzuführen. Richten Sie diese Zeit natürlich so, dass die Infektion Zeiten gestaffelt sind und alle Proben können markiert, geerntet werden, und gefärbt in der gleichen Zeit. <ol start="4"><li> Bei 12 hpi, ersetzen Wachstumsmedium mit Medium mit 0,5 mM EU. Um eines der mock infizierten Brunnen, auch die 5 ug / ml ActD. Dies wird als Quelle für die transkriptionelle Unterdrückung dienen, wie ActD hemmt die DNA-abhängige RNA-Synthese. Zurück Zellen in den Inkubator. </li><li> Mit 13 hpi, waschen Sie die Zellen einmal with PBS und Ernte durch Trypsinisierung von Zellen. Waschen geernteten Zellen dreimal mit PBS, enthaltend 1 mM EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Hinweis: Bei dieser und den folgenden Schritten, nicht schleudern Zellen schneller als 500 - 1.000 xg zu Zelle Bruch zu verhindern. Zentrifuge Zellen für 1 - 2 min zur Sedimentation. Hinweis: Wenn eine Oberfläche Immunfärbung wird nach dem Klick-Reaktion, Ernte mit einem Gummi-oder Einmalhandschuhe Polizist Zellenabstreifer statt geplant. <ol start="6"><li> Fix Zellen durch Resuspendieren in 1 ml 4% PFA und Inkubation für 30 min bei RT. Siehe 1.6 für Anleitungen zum 4% PFA vorzubereiten Schritt. </li><li> Waschen einmal mit 1 ml PBS-EDTA pro Vertiefung. Fahren Sie direkt mit Schritt 6 fort. </li></ol> Hinweis: Es ist wichtig, um sofort mit dem Klick-Reaktion gehen, da die RNA degeneriert, wenn in dieser Phase für längere Zeit gehalten. Und falls der Durchführung einer Zeit course Experiment, achten Sie darauf, zu beschriften, zu fixieren und färben alle Proben gleichzeitig. 6. Klicken Reaktion auf markierten RNA-Erkennung <ol><li> Durchdringbar Zellen durch Resuspension in 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Inkubieren für 10 min bei RT. </li></ol> Hinweis: Alle Lösungen in den Schritten 6.1 bis 6.3 müssen nucleasefreiem sein. Hinweis: Wenn Zellen nicht richtig Sediment während diesem Schritt erhöhen die Zentrifugationszeit bis 5 min. Sedimentationsverhalten einmal Zellen zu verbessern sind in FACS-Puffer (Schritt 6.4) suspendiert. <ol start="2"><li> Waschen Sie einmal mit 1 ml PBS. </li></ol> Hinweis: Verwenden Sie keine EDTA in diesem Schritt, da dies die Cu 2 +-Ionen, die für die Klick-Reaktion chelatisieren wird. <ol start="3"><li> Die Zellen in 200 ul Klick Färbelösung (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO 4, 200 nM Azid mit Fluoreszenzfarbstoff [exkl. beschriftetitation / Emissionsmaximum: 650/665 nm], 100 mM Ascorbinsäure). Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Bereiten Sie das Click Färbelösung frisch unmittelbar vor diesem Schritt. Stammlösungen von 1,5 M Tris, pH 8,5, 100 mM CuSO 4 und 500 mM Ascorbinsäure bei 4 ° C gelagert werden Allerdings verwerfen jede Ascorbinsäure stock Lösung, die gelb geworden ist. Hinweis: Wenn Zellen verklumpen bei diesem Schritt, durch Auf-und Abpipettieren mehrmals resuspendieren. Hinweis: Achten Sie darauf, ein Fluorophor, die von Ihrem Durchflusszytometer detektiert werden kann wählen. Hinweis: Daneben werden eine Probe der infizierten Zellen, die nicht mit dem Klick Färbeverfahren unterworfen werden, diese werden für die Kalibrierung des Durchflusszytometers erforderlich. Verwenden Sie entweder die Hälfte der infizierten Zellen oder eine zusätzliche gut bei Schritt 5.2 infiziert. Diese control-Zellen wird in Schritt 7.1 immungefärbt werden. <ol start="4"><li> Waschen zweimal mit FACS-Puffer (PBS, enthaltend 1 mM EDTA und 0,5% (w / v) BSA). </li></ol> Hinweis: Wenn keine Immunfärbung von viralen Proteinen gewünscht wird, Zellen analysiert werden sofort (Schritt 8 fortfahren). 7. Immunfluoreszenz zu Expression viraler Proteine ​​erkennen <ol><li> Die Zellen in 200 ul primären Antikörper (anti-RVFV) in FACS-Puffer (1:10.000) verdünnt und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li></ol> Hinweis: Alternativ kann dieser Schritt O / N bei 4 ° C durchgeführt werden, in der Dunkelheit. Hinweis: Auch Vorbereitung einer Probe von nicht infizierten Zellen, die an der Klick-Färbung unterzogen wurden aber nicht immungefärbt werden, werden diese für die Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt werden. Verwenden Sie entweder die Hälfte der Mock-infizierten Zellen oder eine zusätzliche nicht-infizierten und anSchritt 5.2. Hinweis: Bei der Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, bestimmen die optimale Verdünnung für Ihre primäre Antikörper zuerst. <ol start="2"><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer. </li><li> Die Zellen in 200 ul sekundären Antikörper (anti-Maus-IgG konjugiert mit Fluoreszenzfarbstoff [Anregung / Emission maximal: 495/519 nm]), verdünnt in FACS-Puffer (1:1000) und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal in FACS-Puffer. </li></ol> Hinweis: An dieser Stelle können Zellen O / N bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit. 8. Erfassung von Daten <ol><li> Die Zellen in 500 ul FACS-Puffer, Transfer in 5 ml Polystyrol-Röhrchen und Analyse mit einem Durchflusszytometer. Verwenden MP-12 infizierten Zellen (kein Klick-Reaktion, Anti-RVFV Färbung nur) und Mock-infizierten Zellen (klicken Reaktion nur), um das Gerät zu kalibrieren. </li></ol> Nichte: Achten Sie darauf, geeignete Fluorophore, die von Ihrem Gerät erkannt werden kann wählen. Zum Vergleich sind die folgenden die Laserlinien und Filter-Sets verwendet, um die Daten in dieser Veröffentlichung gezeigt erwerben. Fluorophor mit einer Anregung / Emissionsspektrum 495/519: Laser: 488 nm Filter: 530/30 Fluorophor mit einer Anregung / Emissionsspektrum 650/665: Laser: 640 nm Filter: 670/20

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die bereitgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Wirkung der viralen Infektion Wirtszelle die Transkription durch den Einbau des Uridin analoge EU in naszierenden RNA zu messen. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber früheren Verfahren: schnell, empfindlich, und es muss nicht auf die Verwendung von radioaktiven Isotopen verlassen. Darüber hinaus kann das Verfahren angepasst ist, um qualitative Daten durch Fluoreszenzmikroskopie oder quantitative Daten über Durchflusszytometrie unter Verwendung im ...

<html> Traditionell wurde Transkriptionsaktivität durch Einbau von entweder radioaktiv (3 H-Uridin) 1 gemessen worden oder halogenierte (BRU) 2 Nukleoside in entstehenden RNA. Diese Uridin Analoga werden von Zellen aufgenommen, umgewandelt in Uridin-Triphosphat (UTP) durch das Nukleosid Salvage Pathway, und anschließend in neu synthetisierte RNA eingebaut. 3 H-Uridin durch Autoradiographie, die sehr zeitaufwändig sein kann, oder Szintillations erkannt werden Zählen, das erfordert spezielle Ausrüstung. Darüber hinaus kann die Verwendung radioaktiver Isotope nicht in einer Reihe von Laboreinrichtungen praktisch, einschließlich High-Containment biologische Sicherheit Laboratorien. BrU durch Immunfärbung mit Anti-Bru Antikörper, die die harten Permeabilisierung erfordern können, um den Zugriff des Antikörpers an den Kern oder teilweise Denaturierung von RNA, wie RNA Sekundärstruktur kann eine sterische Hinderung für die Antikörperbindung zu gewährleisten detektiert werden. _content &quot;&gt; Das hier beschriebene Protokoll nutzt die kürzlich entwickelte klicken Chemie 3 bis transkriptionelle Aktivität in Zellen mit dem RVFV Stamm MP-12 infiziert zu messen. Klicken Chemie beruht auf einer sehr selektiven und effizienten Kupfer (I)-katalysierten Cycloaddition zwischen einem Alkin und einer Azid 4,5. In diesem Protokoll wird naszierenden RNA in infizierten Zellen zuerst durch Einarbeitung des Uridin analoge EU bezeichnet. In einem zweiten Schritt die inkorporierte EU durch Umsetzung mit einem Azid Fluoreszenz detektiert wird. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind (1), dass sie nicht die Verwendung von radioaktiven Isotopen und (2), dass es nicht erforderlich harten Permeabilisierung oder Denaturierung von RNA. mit einem Molekulargewicht von weniger als 50 Da der Zugang des fluoreszierenden Azid nicht ausreichend behindert Permeabilisierung oder RNA Sekundärstruktur. Darüber hinaus sind die Forscher nicht in der Wahl ihrer primären Antikörper begrenzt, wenn die Kombination der Detektion von RNA mit einer KlasseiCal Immunfärbung für virale Proteine. Zwei verschiedene Verfahren werden in diesem Protokoll beschrieben: eine für die Visualisierung Transkription über Fluoreszenzmikroskopie (Schritte 1-4) und eine zur Quantifizierung der Transkription durch Durchflusszytometrie (Schritte 5-8). Beide Methoden kombinieren entstehender RNA Markierung mit einem intrazellulären Immunfärbung für virale Proteine, die für eine Korrelation zwischen Transkriptionsaktivität und Virusinfektion einer Zelle-für-Zelle-Basis ermöglicht. Die Autoren haben sich erfolgreich verwendet das Protokoll hier beschriebenen transkriptionellen Aktivität in Zellen mit dem RVFV Stamm MP-12 6 Zellen mit verschiedenen MP-12-Mutanten 7,8, 9, und Zellen mit Toscana-Virus (TOSV) 10 infiziert infiziert zu bestimmen. Die hier beschriebene Protokoll kann leicht für die Verwendung mit verschiedenen Viren angepasst und hat das Potential, modifiziert Immunfluoreszenzfärbung spezifische virale oder zelluläre Proteine ​​umfassen werden.

<table><tbody><tr><td>5-Ethinyl-Uridin</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>lösen in DMSO für 100 mM Vorrat</td></tr><tr><td>12 mm runde Deckgläser</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrolröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>auflösen in DMSO für 10 mM Vorrat</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>auflösen in H2O für 100 mM</td></tr><tr><td>Stamm DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td><td>auflösen in H2O für 5 mg/ml Stamm</td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzazid (Alexa Fluor 594-gekoppelt)</td><td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzazid (Alexa Fluor 657-gekoppelt)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>löst sich in H2O für 500 mM </td></tr><tr><td>Papierfilter</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd </td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin (MW &#8805; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>auflösen in H2O für 1,5 M Stamm, pH 8,5</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td></td><td>z.B. Olympus IX71</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td></td><td></td><td>z.B. BD Biosciences LSRII Fortessa</td></tr></tbody></table>

mit klick-chemie, um die wirkung von viral infection auf host-zell-rna synthese messen

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Viele RNA-Viren haben die Fähigkeit, Transkriptions-Wirtszelle als ein Mittel, um zelluläre Abwehrmechanismen zu umgehen hemmen entwickelt. Zur Untersuchung dieser Viren ist es daher wichtig, eine schnelle und zuverlässige Methode zur Messung der Transkriptionsaktivität in infizierten Zellen. Traditionell wurde die Transkription entweder durch Einbau von radioaktivem Nukleoside wie 3 H-Uridin gemessen gefolgt von einem Nachweis über Autoradiographie oder Szintillationszählung oder Integrieren halogenierten Uridin-Analoga, wie 5-Bromuridin (BRU) durch Detektion mittels Immunfärbung gefolgt. Der Einsatz von radioaktiven Isotopen, erfordert jedoch spezielle Geräte und ist nicht in einer Reihe von Labor-Einstellungen durchführbar, während die Erkennung von BrU kann mühsam sein und können von niedriger Empfindlichkeit leiden. Die neu entwickelte Klick-Chemie, die eine Kupfer-katalysierten Triazol-Bildung aus einem Azid und einem Alkin beinhaltet, bietet jetzt eine schnelle und highly sensitive Alternative zu diesen beiden Methoden. Klick-Chemie ist ein zweistufiger Prozess, in dem im Entstehen begriffenen RNA zunächst durch den Einbau des Uridin analogen 5-Ethinyluridin (EU), durch Detektion der Markierung mit einem fluoreszierenden Azid gefolgt markiert ist. Diese Azide sind als verschiedene Fluorophore, so dass für eine breite Palette von Optionen für die Visualisierung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transkription Unterdrückung in Zellen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12 mit Klick-Chemie infiziert zu messen. Gleichzeitig wird die Expression der viralen Proteine ​​in diesen Zellen durch klassische intrazellulären Immunfärbung bestimmt. Schritte 1 bis 4 ausführlich eine Methode zur Unterdrückung Transkriptions über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, während die Schritte 5 bis 8 ausführlich eine Methode zur Unterdrückung Transkriptions via Durchflusszytometrie quantifizieren. Dieses Protokoll ist leicht an die Verwendung mit anderen Viren.

Die NSs Protein RVFV (Familie Bunyaviridae, Gattung Phlebovirus) 11 hemmt Wirtszelle allgemeine Transkription durch zwei verschiedene Mechanismen: (i) durch die Sequestrierung p44 Untereinheit des basalen Transkriptionsfaktor TFIIH 11 und (ii) durch die Förderung der proteasomalen Abbau des p62 Untereinheit TFIIH 6. Der MP-12 RVFV Impfstammes 13 hat für die Experimente in diesem Protokoll beschrieben verwendet, da MP-12-Stamm in einer Sicherheitsstufe 2 Labor...

Dieses Verfahren beschreibt die Verwendung von Klick-Chemie, um Änderungen in Wirtszelle Transkription nach der Infektion zu messen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12. Die Ergebnisse können qualitativ visualisiert werden über Fluoreszenzmikroskopie oder erhalten quantitativ durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ist zur Verwendung mit anderen Viren.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die transkriptionelle Aktivität in virusinfizierten Zellen zu analysieren. Infizieren Sie zunächst die 293-Zellen mit dem Rift-Valley-Fieber-Virus MP-12. Markieren Sie anschließend die Zellen mit dem Uridin-Analogon 5-Ethynyluridin, das in neu synthetisierte RNA eingebaut wird. Koppeln Sie danach das eingebaute 5-Ethynyluridin an eine fluoreszierende Azidverbindung, um die neu synthetisierte RNA sichtbar zu machen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, basierend auf fluoreszenzmikroskopischen Analysen oder Durchflusszytometrie, Unterschiede in der Menge der neu synthetisierten RNA zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen. Im Gegensatz zur Markierung mit tritiiertem Uridin oder 5-Brom-Uridin erfordert dieser Ansatz der Click-Chemie nicht die Verwendung radioaktiver Isotope. Er ist außerdem schneller und empfindlicher als die Immunfärbung mit Anti-Brom-Uridin. Die Idee für diese Methode ergibt sich aus unserem Bedarf an einer schnellen und zuverlässigen Möglichkeit, die Transkriptionsunterdrückung in Zellen zu messen, die mit verschiedenen Stämmen des Rift-Valley-Fieber-Virus, MP-12, infiziert sind. Geben Sie 12 mm runde Deckgläser in jede Vertiefung einer 12-Loch-Gewebekulturplatte. Säen Sie anschließend 293-Zellen in einem Milliliter vollständigem DMEM-Medium aus. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Verdünnen Sie entsprechend dem experimentellen Design den Virusstamm so, dass die Infektion der Zellen mit MP-12 bei einer Multiplizität der Infektion von drei in einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung erfolgt. Legen Sie eine Vertiefung als nicht infizierte Kontrolle und eine weitere als Kontrolle für die transkriptionelle Suppression fest. Entfernen Sie nun das Wachstumsmedium. Geben Sie das virale Inokulum hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang im befeuchteten Inkubator. Aspirieren Sie das Inokulum. Fügen Sie je Vertiefung ein Milliliter frisches Wachstumsmedium hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach 15 Stunden post-Infektion das Wachstumsmedium durch Medium, das ein Millimolar des Uridin-Analogs 5-Ethynyl-Uridin enthält. In eine der mock-infizierten Vertiefungen geben Sie zusätzlich fünf Mikrogramm pro Milliliter des Inhibitors der DNA-abhängigen RNA-Synthese, Actinomycin-D. Stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator. Entfernen Sie nach 16 Stunden post-Infektion das Medium und waschen Sie die Deckgläser einmal mit je einem Milliliter PBS pro Vertiefung. Fixieren Sie die Zellen mit je einem Milliliter 4 % Paraformaldehyd pro Vertiefung. Spülen Sie einmal mit je einem Milliliter PBS pro Vertiefung. Um die Feuchtkammer zusammenzubauen, legen Sie den Boden einer Zellkulturschale oder Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern mit einer Plastik-Parafilmfolie aus. Streichen Sie die Innenseite des Schalenrands mit feuchten Papiertüchern aus. Um die Zellen zu permeabilisieren, geben Sie nun ein Milliliter 0,2 % Triton X-100 in PBS hinzu. Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach drei Waschungen mit PBS übertragen Sie die Deckgläser in die Feuchtkammer. Um markierte RNA nachzuweisen, bedecken Sie jedes Deckglas mit 50 bis 100 Mikrolitern frisch zubereiteter Click-Färbungslösung. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Geben Sie ein Milliliter PBS in die Vertiefungen einer neuen 12-Loch-Platte und überführen Sie die Deckgläser in die Vertiefungen. Waschen Sie zwei weitere Male mit je einem Milliliter PBS pro Vertiefung. Um die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie zu präparieren, geben Sie einen Tropfen Fluoromount-G auf einen Objektträger. Tauchen Sie das Deckglas kurz in Wasser und entfernen Sie überschüssiges Wasser. Legen Sie das Deckglas mit der Zellseite nach unten in den Tropfen Fluoromount G und lassen Sie es fünf Minuten lang an der Luft trocknen.Entsprechend dem experimentellen Design infizieren Sie die 293-Zellen mit MP 12 bei einem MOI von drei. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und geben Sie verdünnten Virustock hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Inokulum durch zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für die optimale Zeit zur viralen Markierung und Gewinnung. Ersetzen Sie danach das Wachstumsmedium in einer der mock-infizierten Vertiefungen durch Medium, das 0,5 Millimolar 5-Ethynyl-uridin enthält. Fügen Sie außerdem fünf Mikrogramm pro Milliliter Actinomycin-D hinzu. Stellen Sie die Zellen für eine Stunde in den Inkubator zurück. Nach einem PBS-Spülgang gewinnen Sie die Zellen durch Trypsinisierung. Waschen Sie die gewonnenen Zellen dreimal mit PBS, das ein Millimolar EDTA enthält. Zum Fixieren der Zellen resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 4 % PFA und inkubieren 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie einmal mit je einem Milliliter PBS-EDTA pro Röhrchen. Permeabilisieren Sie anschließend die Zellen in 0,5 Milliliter 0,2 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie einmal mit einem Milliliter nukleasefreiem PBS. Für die Click-Reaktion resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter Click-Färbelösung, die den fluoreszierenden Farbstoff enthält. Falls die Zellen zusammenklumpen, resuspendieren Sie durch Pipettieren. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie zweimal mit FACS-Puffer.In diesem Experiment wurden 293-Zellen mit MP-12 und einem Deletions-Mutanten-Virus infiziert, das die Fähigkeit zur Unterdrückung der Wirtszelltranskription fehlt. In den mock-infizierten Zellen erscheinen die Kerne hellrot aufgrund der andauernden Transkription. Da die Zellen nur eine Stunde lang mit EU markiert und anschließend sofort fixiert wurden, verbleiben die meisten RNAs im Kern. Im Gegensatz dazu ist die rote Fluoreszenz der Kerne deutlich reduziert, wenn die Zellen mit Actinomycin-D behandelt wurden, um die Transkription pharmakologisch zu hemmen. Diese Fluoreszenz ist ebenfalls reduziert, wenn die Zellen mit MP-12 infiziert wurden, jedoch nicht mit dem Deletionsmutanten, der die Wirtszelltranskription nicht unterdrückt. Hier wurden die Zellen statt mit lebendem Virus mit in vitro synthetisierter mRNA transfiziert. Das rote fluoreszierende Signal in den Kernen zeigt an, dass sich im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen die transkriptionelle Aktivität in Zellen, die mit mRNA kodierend für grün fluoreszierendes Protein transfiziert wurden, nicht verändert hat. Nur die Transfektion mit mRNA, die für den Virulenzfaktor NSs des Rift-Valley-Fieber-Virus kodiert, führt zu einer verringerten roten Fluoreszenz. Bei quantitativer Auswertung können die erhaltenen Durchflusszytometriedaten als Streudiagramme dargestellt werden, wobei das fluoreszierende Signal für die EU-Inkorporation in neu synthetisierte RNA auf der Y-Achse und das für die Anti-Rift-Valley-Fieber-Virus-Färbung auf der X-Achse abgetragen ist. Die Quadrantengatter wurden so festgelegt, dass der Großteil der mock-infizierten Zellen im oberen linken Quadranten lag. Der Großteil der mit Actinomycin-D behandelten Zellen befand sich im unteren linken Quadranten, und der Großteil der infizierten Zellen lag in der rechten Hälfte des Diagramms. Bei Infektion mit MP-12 zeigten 81,5 % der Gesamtzellzahl bzw. 93 % der Anti-Rift-Valley-Fieber-Virus-positiven Zellen eine verminderte transkriptionelle Aktivität. Im Gegensatz dazu zeigten bei Infektion mit MP-12, Clone 13-Typ, 91,6 % der Gesamtzellzahl bzw. 97 % der Anti-Rift-Valley-Fieber-Virus-positiven Zellen eine transkriptionelle Aktivität, die mit der der mock-infizierten Zellen vergleichbar war. Diese Daten können auch als Histogramm der Fluoreszenz-RNA-Markierung mittels EU-Inkorporation dargestellt werden. Danach können weitere Methoden wie die intrazelluläre Immunfärbung durchgeführt werden, um die Expression viraler Proteine in diesen Zellen sichtbar zu machen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mithilfe der Click-Chemie die transkriptionelle Aktivität in virusinfizierten Zellen entweder mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie visualisiert werden kann.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit infektiösen Viren äußerst gefährlich sein kann. Daher sind Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA und das Vermeiden der Inhalation von Aerosolen erforderlich.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker...

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung von antiviralen Wirkstoffen, die auf bestimmte Schritte des viralen Eintritts in Wirtszellen und der Fusion mit dem Endosom abzielen. Die Zellen werden bei niedriger Temperatur inkubiert und dann mit HCV infiziert. Die niedrige Temperatur ermöglicht die Bindung des Virus an Wirtszellen, hemmt aber die Internalisierung über die Endozytose. Die antivirale Testverbindung wird zugegeben, und die Zellen werden bei physiologischer Temperatur inkubiert.

Ein Assay zur Bewertung der Wirkung von Testverbindungen auf den Eintritt und die Fusion von Viren in Wirtszellen

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen, die auf Postintegrationsschritte des HIV-1-Replikationszyklus abzielen, werden beschrieben. Diese Methoden sind nützlich, um neue Moleküle zu screenen und das Format bestehender Moleküle zu optimieren.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion-Analyse kombiniert mit reversen Transkription (RT-qPCR) wurde weithin zur Messung der RNA-Virusinfektionen. Hier präsentieren wir Ihnen einen direkten RT-qPCR-Assay, erfordern keine RNA Reinigungsstufe, entwickelt für die Quantifizierung von mehreren RNA-Viren, einschließlich Dengue-Virus.

Messung der Dengue-Virus RNA im Kultur Überstand der infizierten Zellen durch Echtzeit-Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

Erfahren Sie, wie Sie mit Click-Chemie die transkriptionelle Aktivität in mit Rift-Valley-Fieber-Virus infizierten Zellen messen. Diese nicht-radioaktive Methode ermöglicht die Visualisierung neu synthetisierter RNA.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

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