Name: Hefe und luminometrischer Xenopus Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung der Mechanosensitivität von TRPV4-Kanälen mittels luminometrischer Hefe- und elektrophysiologischer Xenopus-Eizell-Methoden. Diese Techniken ermöglichen quantitative Analysen der Ionenkanalfunktion.

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Wir möchten Andrea Kremsreiter für hervorragende technische Unterstützung danken. Madison - Die Arbeit in unserem Labor wird von NIH GM096088 und Vilas Vertrauen der Universität von Wisconsin unterstützt.

1. Hefe Luminometrie Methoden Verwenden BYYT Stamm von Saccharomyces cerevisiae. Es ist ein yvc1-TOK1-Derivat von BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, TOK1 :: kanMX4). Trans Zellen mit den leu-wählbar Aequorin-exprimierenden Plasmid pEVP1/Aeq und ura wählbare rat-TRPV4-exprimierenden Plasmid p416GPDV4, wie in Batiza et al. Loukin 26 und et al. Beschrieben 24 Verwenden Sie Standard-Methoden von Plasmid-Bau und Umbau 27 . Hefestamm und Plasmide sind auf Anfrage erhältlich. <ol><li> 2 ml Kultur von Hefe-Zellen über Nacht auf post-logarithmischen Phase in ein 30 º C-Schüttler in leu-ura-&quot;DCD&quot; Dropout-Medium 28 (a Sulfat abgereicherte Variante der CMD-Leu-ura-Medium 29), ergänzt mit 1 M Sorbitol . Beimpfen von 200 &amp;mgr; l dieser Kultur in 1,8 ml frisches Medium mit 2 &amp;mgr; M des luciferi ergänztn Coelenterazins. Wachsen in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für weitere 24 h ohne Schütteln. </li><li> Messung der Osmolarität der Kultur (typischerweise bei 1400 mOsM) und andere Lösungen (unten) mit Hilfe eines Dampfdruck-Osmometer. </li><li> Aliquot 20 ml frisches Kultur in ein 12 mm Luminometerröhrchen für ein einzelnes Rohr Luminometer. </li><li> Für die hypotonischen Schock, 200 ul einer Lösung, enthaltend 25 mM NaEGTA (pH 7,2) oder Namen (pH 7,2) und 500-100 mM NaCl (insgesamt Osmolarität 1,200-400 mOsM), je nach dem Grad der gewünschten Schlag. Die Lumineszenz vor kontinuierlich zu überwachen und mindestens 120 Sekunden nach dem osmotischen downshock, unterbrochen nur von der kurzen Verdünnungsbetrieb. Registrieren Luminometer Ausgang auf einem Desktop-Computer als relative Lumineszenz-Einheiten (RUL). </li></ol> Obwohl nicht für die Untersuchung von transgenen TRPV4 haben wir eine Variante des obigen Protokolls in einem automatisierten System verwendet werden, um die Antworten von einer Vielzahl von Hefestämmen zu untersuchen. Studie of die Antworten auf die hypo-30 oder 31 hyperosmotische Reize der Hefe deletome (die Sammlung von 4.906 Hefe-Single-Gen Deletanten) mit Hilfe eines Mikroplatten-Luminometer und mit entsprechender Software ausgewertet war erfolgreich. 2. und 3. Eizellenelektrophysiologie Methoden Elektrophysiologie hat grundlegende Methoden 32. PCR verstärken die offenen Leserahmen von Wildtyp-oder mutierten TRPV4 mit High-Fidelity-Polymerase und PfuUtra in pGH19 33 integriert. Dies erfordert eine genaue Insertion des ORFs zwischen den 5 &#39;und 3&#39;-UTR des Xenopus-β-Globin-Gens und stromabwärts von einem T7-RNA-Polymerase-Promotor. Linearisieren der Konstruktion stromabwärts der 3&#39;-UTR und als Template in einem in vitro T7-RNA-Polymerase-Reaktion verwendet. Verwenden Sie Standard-molekularbiologische Techniken 34. Verwenden Stadium V-VI Oozyten von X. laevis. Tierhaltung, Teil ovariectomy, defolliculation und Dotter Umschlag Entfernung folgen Standardverfahren 32,33,35. Inject 2-40 ng cRNA-Lösung pro Eizelle mit einem Drummond Nanoinject II Automatik Mikroinjektor. Injizieren ~ 30 Oozyten für jeden Satz von Experimenten. Nach TRPV4-cRNA Injektion, Inkubation der Oozyten in der ND96 Medium mit Gentamicin (100 ug / ml) und 1 uM Ruthenium Red 14. 2. Zweielektroden-Spannungsklemmen <ol><li> Ziehen Borosilikatglas Aufnahme Präzisionspipetten von Einweg-Mikropipetten 100 ul einzeln mit einer Pipette Magnet. </li><li> Ziehen sowohl Spannungs-Mess-und Strominjektionspipette Elektroden werden gezogen, um eine Spitzenöffnung von ~ 1 Mikrometer Durchmesser haben. </li><li> Backfill-Elektroden mit 2 M KCl was 0,1-0,2 mOhm Widerstand. Montieren Sie sie auf HS2A headstages, die zusammen mit einem VG-2Ax100 virtuelle geerdete Bad Klemme, werden zu einem Verstärker Geneclamp 500 Schnittstelle über eine Digidata 1440 Digitalisierer verbunden. Erwerben<html> Daten mit pClamp10 Software. </li><li> Zeigen die Eizelle in einem 1 ml Bad in einer vorgefertigten Kunststoffkammer auf der Stufe eines Binokular mit 20-facher Vergrößerung montiert getestet werden. Die Badlösung virtuell geerdet durch eine 3 M KCl-Agar-Brücke und einem chlorierten Silberdraht in der Nähe der Eizelle eingebracht und an einem VG-2A virtuellen Masse Stufe verbunden. </li><li> Konstruieren Sie die Kammer für die kontinuierliche Perfusion mit Kunststoffschläuche als Ein-und Auslauf Lösung. Verbinden der Einlaßleitung ist mit einem vorgefertigten Perfusionssystem, die eine Mannigfaltigkeit von sechs 50-ml-Spritze Schalen, jede mit einer anderen Lösung gefüllt ist, verbunden. Gravity Feed Raten einer beliebigen Lösung gesteuert wird, um ~ 3.2 ml / min mit &quot;Keck&quot; Rampe Schellen an den Schläuchen. </li><li> Montieren Sie beide Elektroden mit ihren headstages auf Mikromanipulatoren. Führen Elektrodendurchführungen der Eizelle durch Mikromanipulation. </li></ol> 3. Patch-Clamp-Untersuchung der Direkt Mechanosensitivität &quot;&gt; Die grundlegenden Methoden der Patch-Clamp-Pipette einschließlich Vorbereitung, GOhm-Dichtung Bildung und die Bildung von Ein-Zelle herausgeschnitten oder Betriebsarten sind die in Hamill et al. Conn 36 und 32. <ol><li> Füllen Borosilikat-Glaspipetten mit einem ~ 1 um Durchmesser Öffnung an der Spitze (Blasenzahl 5-6) mit 98 mM KCl, 1 mM MgCl 2 und 10 mM K +-HEPES, pH 7,2. </li><li> Befestigen der Patch-Clamp-Pipette durch einen Kunststoffschlauch mit einer 5 ml Spritze durch eine T-Verbindung, die auch mit einem Manometer. Verwenden Sie einen Computer, um sowohl die Elektrode und die Manometer Ausgänge verarbeiten. Erwerben Daten bei 10 kHz, und spielen dann wieder durch einen achtpoligen Bessel-Filter bei 1 kHz für die Analyse. </li><li> Verschiedenen Patches aus demselben Eizelle wiederholt ausgeschnitten werden. Diese Praxis macht die Untersuchung der molekularen TRPV4 Tätigkeit effizienter und zuverlässiger. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wie in der Einleitung erwähnt, die häufig verwendet, um Funktionen zu studieren TRPV4 Methoden führte manchmal in Widersprüche und Kontroversen. Die zwei Sätze von hier beschriebenen Methoden bieten einige Vorteile und kann die vorhandenen Methoden zu ergänzen. Während wir nur die Studien zu TRPV4 beschreiben, können die Verfahren auch auf andere Ionenkanäle als auch studieren. 1. Hefe Luminometrie Methoden Angehende Hefe hat eine native Ca 2 +-Einstrom ...

TRP (transient receptor Potenziale) aus sieben Unterfamilien der Kationenkanäle, 1,2 sensorischen Funktionen dienen. Bei Säugetieren TRPV die Vanilloid Unterfamilie der TRP, sechs Sorten. TRPV4 (Typ 4) 3,4 reagiert auf Wärme, bestimmte Chemikalien, osmotische Schwellung oder Scherbeanspruchung. Das TRPV4-Gens wurde wiederholt von Kandidaten-Gen und / oder Expression Klonen 5-8 isoliert. Die letztere Methode folgte die Antwort des Genprodukts zu Hypo-Osmolarität. TRPV4 in fast allen Organen und Funktionen in der Entwicklung, Physiologie und Pathologie von vielen unterschiedlichen Zelltypen 3,4 ausgedrückt. Auffällig sind die&gt; 50 menschliche autosomal dominant TRPV4 Mutationen, wodurch periphere Neuropathien und / oder Skelettdysplasien (Anomalien in der Skelettentwicklung) 11.09. Die Skelettdysplasien reichen von leichten brachyomia Typ 3 (Typ-3-Zwergwuchs), Dysplasie, spondylometaphysäre Kozlowski-Typ, um SeveWieder Dysplasien, einige verursachen neonatalen oder embryonale Tod. Obwohl alle Arten der Mechanismen möglich scheint, erklärt keiner die Vielfalt, Komplexität, Variabilität und gelegentliche Überschneidungen dieser Krankheiten 4. Wie andere TRP-Kanäle 1, ist TRPV4 ein Tetramer. In Ratten-oder Menschen TRPV4 wird jede Untereinheit von 871 Resten bestand. Zentrales Element ist ein sechs Transmembran-Helices (S1-S6), die geeignet in einer Weise ähnlich zu spannungsabhängigen K +-Kanäle angeordnet sind. Dort S1 bis S4 bilden eine Umfangs Domäne und die S5 und S6 bilden die Permeation Porendomäne. Zwischen S5 und S6 von TRPV4 ist eine kurze Porenhelix gefolgt von der Sequenz LDLFKLTIGMGDL, von denen vier vermutlich konvergieren, um die Kationenfilter bilden. Die 470-Rest N-terminalen cytoplasmatischen Segment enthält 6 Ankyrin Wiederholungen bekannt, Proteine ​​oder kleine Liganden zu binden. Die C-terminale 152-Rückstand cytoplasmatischen Segment eine Calmodulin-Bindungssequenz unter anderen möglichen Seiten, ot bindenihr Elemente 3. TRPV4 ist ein Kationenkanal, der im Wesentlichen schließt Anionen ein. Während seiner physiologischen Funktion ist um Stimuli an Ca 2 +-Einstrom zu transduzieren, ist es auch durchlässig für andere Kationen mit einer Eisenman-Sequenz IV Durchlässigkeit, bei einer Begünstigung zweiwertiger P Ca: P Na ~ 7 12. Einzelkanalleitfähigkeit richtet bei ~ 90 pS nach außen und nach innen ~ 40 pS 6,13,14. Heterolog exprimiert Strom (unten) kann durch hypo-osmotischen Schwellung, Schubspannung, Wärme oder 15 aktiviert werden. Es wird auch von mehrfach ungesättigten Fettsäuren 16,17 und das synthetische Ester phorbal 4αPDD 18 aktiviert. Derzeit ist die potenter Agonist GSK1016790A 19 und Antagonist GSK2193874, wirksam bei 10 -9 bis 10 -8 M-20, die beide von Hochdurchsatz-, Kleinmolekülbild entdeckt. Zwei Schlüsselbereiche der Forschung zu bleiben verwirrend TRPV4: (1) Schon als TRPV4 ist weitgehend für seine Mechanosensitivität studiert, ist seine molekulare Basis umstritten. Ein Modell beschreibt Hypo-Osmolarität irgendwie aktiviert Phospholipase A2 (PLA2), die mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA) Arachidonsäure (AA), die umgewandelt Säure (EET) von einem Epoxygenase Epoxyeicosatrienoide ist zu produzieren, und die Bindung von EET aktiviert TRPV4 16, 17. Doch selbst TRPV4 wurde gezeigt, direkt an Membran Strecke 14 (unten) zu reagieren, um eine einfachere Erklärung. (2) Die TRPV4 Mutante Pathologien sind verwirrend. Die Grundlage, muss man wissen, ob die Erkrankungen, die durch den Verlust, der Verringerung oder die Erhöhung der Kanalaktivitäten. Auch hier ist die Literatur alles andere als klar. Während mehrere Skelett-Dysplasie-Allele wurde berichtet, dass höhere Aktivitäten haben, (Gain-of-function, GOF) 4,21, mehrere wurden gemeldet, Aktivitäten (Loss-of-function, LOF) 10,22 reduziert. Eine systematische Untersuchung von 14 Allele gefunden, sie zuAlle GOF werden Mutationen (unten) 23. Die Behauptung, dass einige sind LOFs scheint den Phänotyp des TRPV4-/ widersprechen - Knockout-Maus, die lebensfähig oder fruchtbar sind, mit nur geringfügigen Mängeln, trotz einem vollständigen Verlust des TRPV4-Funktion. Ein Teil dieser Kontroversen methodische Herkunft. Laboratories verwenden unterschiedliche Methoden oder Varianten einer Methode und verwenden unterschiedliche Beurteilungsstandards. Am häufigsten wird TRPV4 transient in kultivierten Säugerzellen exprimiert (HEK, CHO, HeLa) und der Anstieg des Innen [Ca 2 +] auf Agonisten oder hypotonen Stimulation mit Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 eingetragen. Die übermäßige Abhängigkeit von dieser fluorimetrischen Test ist kritisiert worden, ein. Das Expressionsniveau in verschiedenen Populationen, die Verteilung darin sowie die wirksame Farbstoffkonzentration, müssen kontrolliert und dokumentiert werden. Zuverlässiger ist die direkte elektrophysiologische Untersuchungen. Auch dieser, wie commonly praktiziert wird, ist auch nicht ohne Probleme. Da die Expressionsmengen in einzelnen kultivierten Zellen sind schwierig zu steuern, Ganzzellströme großen Schwankungen. Da ferner die Ströme klein sind, werden zuverlässige Statistiken müssen auf große Stichproben, die oft nicht praktisch verlassen. Patch-Clamp-Untersuchungen nur selten durchgeführt. Einige dieser Aufnahmen zeigen Gruppen von Aktivität Bursts statistische Auswertung anspruchs 16,17 zu machen. Um die molekularen Mechanosensitivität besser zu verstehen, haben wir zwei weitere Systeme entwickelt, um TRPV4 zu untersuchen. (1) Um TRPV4 weg von seiner üblichen Säugetier Partner zu isolieren, haben wir Ratten TRPV4 in Bäckerhefe 24 ausgedrückt. Die funktionelle Expression von TRPV4 in diesem evolutionär entfernten Zusammenhang zeigte, dass es noch osmotische Kraft zu reagieren, ohne seinen üblichen Partnern. Da Hefe macht keine PUFA wie AA oder EET, und sein Genom hat keine PLA2 oder Epoxygenase Gene, die diese expression zeigt auch, dass sie nicht erforderlich sind, um für TRPV4 Kraft zu spüren. Mit TRPV4 in den molekularbiologisch am ehesten zugänglich Eukaryonten ermöglicht auch eine effiziente zukunfts oder Reverse-25 genetische Manipulationen. (2) Für umfassende Analysen der biophysikalischen TRPV4, ausgedrückt wir TRPV4 in Xenopus-Oozyten. Anders als kultivierte Zellen, die Unter nA nA (10 -10 bis 10 -9 A) Ströme ergeben, eine Oozyte exprimiert Ströme in uA ist (10 -6 bis 10 -4 A). Viel größere Rauschsignal über eine bessere Quantifizierung und selbstbewusster Vergleich. TRPV4, so ausgedrückt, kann auch als Einzelmoleküle unter Verwendung eines Patch-Clamp sucht werden. Eine einzige Eizelle ermöglicht wiederholte Patch Probenahme, wieder machen Quantifizierung zuverlässiger. Solche Studien haben gezeigt, dass TRPV4 Kanal selbst kann direkt durch Membran Strecke Kraft 14 aktiviert werden. Die Analysen zeigten, dass 14-Dysplasie repräsentativen Skelett Allele sind alle gain-of-function-Mutationen. Ferner ist die degree des konstitutiven Ca 2 + Leck Parallelen der Schwere der Erkrankungen der Skelett 23. Aufgrund ihrer Neuheit und Nützlichkeit sind die detaillierten Verfahren dieser beiden Methoden hier versammelt, um Wiederholungen in Zukunft Forschung auf TRPV4 oder ähnliche Kanäle ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Dampfdruckosmometer</td><td>Wescor</td><td>Wescor 5500</td><td>Logan, UT, USA</td></tr><tr><td>Sirius Einröhren-Luminometer&nbsp;</td><td>Titertek-Berhold</td><td>Sirius</td><td>Huntsville, LA, USA</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Luminometer</td><td>Titertek-Berthold</td><td>Mithras LB940</td><td>Huntsville, LA, USA</td></tr><tr><td>Luminometrie-Software</td><td>Titertek-Berthold</td><td>MikroWin2000</td><td>Huntsville, LA, USA</td></tr><tr><td>Patch-Klemme und Software</td><td>Axon Instrument</td><td>HS2A Kopftisch, VG-2Ax100 virtuelle geerdete Badklemme, GeneClamp 500 Verstärker, Digidata 1440 Digitizer, pClamp10 Software</td><td>Union City, CA, USA</td></tr><tr><td>Manometer</td><td>Bio-Tec</td><td></td><td>Winooski, VT, USA</td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Modell P-97</td><td>Novata, CA, USA</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoinject II</td><td>Broomall, PA, USA</td></tr><tr><td>Luciferin Coelenterazin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>T7 RNA-Polymerase Reaktion</td><td>Ambion</td><td>mMessage mMachine</td><td>Austin, TX, USA</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ruthenium rot&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipetten&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>100 Mikroliter Mikropipetten</td><td>Broomall, PA, USA</td></tr><tr><td>High-Fidelity PfuUtra Polymerase&nbsp;</td><td>Stratagene</td><td></td><td>La Jolla, CA, Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr></tbody></table>

hefe und luminometrischer xenopus eizelle elektrophysiologische untersuchungen des molecular mechanosensitivität von trpv4

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentiale, Vanilloid-Familie, Typ 4) ist weit verbreitet in Wirbel Geweben exprimiert und wird von mehreren Stimuli, unter anderem durch mechanische Kräfte aktiviert. Bestimmte Mutationen verursachen TRPV4 komplexe erbliche Knochen oder neuronalen Erkrankungen in Menschen. Wildtyp-oder mutierten TRPV4 Transgene werden üblicherweise in kultivierten Säugerzellen exprimiert und durch Fura-2-Fluorometrie und Elektroden untersucht. In Bezug auf den Mechanismus der Mechanosensitivität und der molekularen Grundlagen von Krankheiten, ist die gegenwärtige Literatur verwirrend und umstritten. Um bestehende Methoden zu ergänzen, beschreiben wir zwei zusätzliche Methoden, um die molekularen Eigenschaften des TRPV4 zu untersuchen. (1) Rat TRPV4 und ein Aequorin Transgen in Hefezellen transformiert. Ein Hypo-osmtic Schock der Trans Bevölkerung ergibt eine luminometrische Signal aufgrund der Kombination von Aequorin mit Ca 2 + durch die TRPV4 Kanal veröffentlicht. Hier TRPV4 wird von seiner üblichen Säugetierpartnerproteine ​​isoliertund offenbart seine eigene Mechanosensitivität. (2) von TRPV4 cRNA in Xenopus-Oozyten injiziert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die makroskopische TRPV4 Strom mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme sucht. Der aktuelle Anstieg bei der Entfernung von inerten Osmotikums aus der Eizelle Bad ist bezeichnend für Mechanosensitivität. Die Mikroampere (10 -6 bis 10 -4 A) Ströme von Oozyten sind viel größer als die subnano zu Nanoampere (10 -10 bis 10 -9 A) Ströme aus kultivierten Zellen, was zu klareren und Quantifizierungen sicherer Abschätzungen. Mikroskopische Ströme reflektieren die Aktivitäten der einzelnen Kanalproteine ​​können auch direkt unter einer Patch-Clamp-registriert werden, auf der Zelle herausgeschnitten oder-Modus. Das gleiche Eizelle bietet mehrere Patch-Proben, die eine bessere Datenreplikation. Ansaugung zu den Patches können TRPV4 aktivieren, um direkt beurteilen Mechanosensitivität. Diese Verfahren sollten auch bei der Untersuchung anderer Arten von TRP-Kanälen sein.

In einem typischen Experiment Luminometrie, wird ein Bereich von 400-1200 mOsM hypotone unten Schocks durch Zugabe von 200 ul von Schock-Lösungen unterschiedlicher niedrigen Osmolarität zu 20 ul Kultur bei 1.400 mOsM erreicht. Die TRPV4 Aktivität ist offensichtlich, wenn die RLU der experimentellen wird, daß von zwei negativen Kontrollen verglichen: Hefezellen mit leeren p416GPDV4 Plasmid oder eine, die die TRPV4 Gen mit einer Mutation an der Ionenfilter (Fig. 1) 24 enthält, transfor...

Um häufigsten verwendeten Methoden, um zu studieren TRPV4 ergänzen, werden zwei Methoden beschrieben: Seine Mechanosensitivität kann durch Ca 2 +-Aequorin Luminometrie in transgenen Hefe auf hypo-osmotischen Herausforderung untersucht werden. Es kann auch in TRPV4-RNA untersucht werden injizierten Xenopus Oocyten durch Ganzzell-Zweielektroden-Spannungsklemmen-oder Patch-Clamp in Ein-Zelle oder entfernten Modus.

Hefe und luminometrischer Xenopus Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Mechano-Empfindlichkeit des Auslöse-V-Vier-Ionen-Kanals zu untersuchen. Dies kann erreicht werden, indem Hefezellen mit dem trip-V-Gen transformiert und der hypothetisch induzierte Kalziumeintrag durch transgene Fremdkörper mit Hilfe eines Luminometers untersucht wird. Auch dies kann mit dem elektrophysiologischen Ansatz untersucht werden.Trip V vier CRNA wird zuerst erzeugt und nach der Inkubation in Xenopus-Zyten injiziert. Die Zyten werden mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme auf die hypotone Herausforderung untersucht. Um die Mechano-Empfindlichkeit auf Einzelkanalebene zu untersuchen, werden die aus den Zyten herausgeschnittenen Membranpflaster abgesaugt.Ich bin Professor Jin Kung. Zuvor wurden die Aktivitäten von TRIP B vier Ionenkanälen weitgehend von URA gezeigt, um den hier entwickelten Fluoreszenzmythos zu entwickeln, der leistungsstarke und quantitative Alternativen bietet, um die mechanische Empfindlichkeit von TRIP B vier zu untersuchen. Die erste Methode, die wir bei der Verwendung von Lum Lum angewendet haben, ist transgenes Aqua, um die mechanische Empfindlichkeit von Trip V vier in knospenden Hefen zu untersuchen.In der zweiten Methode mit elektrophysiologischem Ansatz werden die Eigenschaften von Trip V vier untersucht, die geeignet sind, die Expression von Tribut V vier CRNA in XUS-Zyten zu treffen. Die grundlegende Methode der Cyten-Elektrophysiologie, wie die Entfernung der Vilin-Membran und die Bildung einer eigenen Dichtung, wurden bereits in einer Arbeit von Brown und Mitarbeitern in dieser Zeitschrift im Jahr 2008 demonstriert. Hier werden zusätzliche Schritte gezeigt, die erforderlich sind, um die mechanische Empfindlichkeit von Triv vier zu untersuchen. Das ist mein Kollege, Dr. Jin Fcon.Sie demonstriert die Verwendung der T-Lum-Geometrie sowie die Herstellung der Injektionspipetten, das Befüllen der Pipetten mit CRNA-Lösung und das Injizieren der Lösung in die alten Stellen. Darüber hinaus demonstriert sie die Aufzeichnung von Patch-Muscheln in der Zelle und im Cutped-Inside-Out-Modus. Sie wird auch die Aktivierung des mechano-sensitiven Kanals zeigen, der in der O-Site-Membran nativ ist, sowie die Ergebnisse der Aktivierung von heterolog.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie zwei Milliliter Hefezellen über Nacht kultivieren, um die logarithmische Phase in DCD Lu Yura Dropout-Medium zu postieren, ergänzt mit einem molaren Sorbit in einem 30 Grad Celsius Shaker. Am nächsten Tag impfen Sie 200 Mikroliter der Kultur in 1.800 Mikroliter frisches Medium, ergänzt mit zwei mikromolaren Luzifer. Risine wachsen dann im Dunkeln bei Raumtemperatur für weitere 24 Stunden ohne Schütteln direkt vor der Verdünnung.Messen Sie die Osmolarität der mit einem molaren Sorbit angereicherten Kultur und des Natriumchlorids mit einem Dampfdruck-OSM-ter. Als nächstes aliquotieren Sie 20 Mikroliter frische Kultur in ein 12-Millimeter-Luminometerrohr für ein Einzelröhren-Luminometer. Für den hypotonen Schock fügen Sie 200 Mikroliter Lösung hinzu, die 25 Millimolar Natrium-EGTA bei pH 7,2 oder Natrium-MES bei pH 7,2 und 500 bis 100 Millimolar Natriumchlorid enthält, zu 20 Mikrolitern der Kultur bei 1.400 Milli Osmo überwachen kontinuierlich die Lumineszenz vor, während und mindestens 120 Sekunden nach dem osmotischen Abwärtsschock, unterbrochen nur durch den kurzen Verdünnungsvorgang, registrieren Sie die Luminometerausgabe auf dem Computer als relative Lumineszenzeinheiten.Ziehen Sie bei diesem Verfahren eine Mikropipette mit einem Pipettenabzieher. Die Mikropipette sollte unter einem Präpariermikroskop einen langen Schaft haben. Drücken Sie den Schaft der gezogenen Mikropipette vorsichtig an der entsprechenden Stelle zusammen, um eine Öffnung zu schaffen.Die Öffnung der Mikropipette sollte einen Durchmesser von etwa 30 Mikrometern haben, um das Befüllen und Ausstoßen der CRNA-Lösung zu erleichtern. Hier sind der Mikroinjektor und der Pipettenhalter. Dabei handelt es sich um die Steuerung, bei der die Aufnahme- und Auswurffunktionen deutlich gekennzeichnet sind.Nachdem Sie die Pipette wieder mit Mineralöl gefüllt haben, das auf dem Halter montiert ist, senken Sie es in einen Tropfen CRNA-Lösung. Anschließend die Pipette mit dem Mikroinjektor automatisch unter dem Präpariermikroskop befüllen, eine Eizelle auswählen. Senken Sie dann die gefüllte Mikropipette ab, um in die Eizelle einzudringen.Nachdem die Mikropipette eingeführt wurde, beginnen Sie mit der CRNA-Injektion. Nachdem etwa 30 Zyten injiziert wurden, übertragen Sie sie auf das ND 96-Medium, das Rutheniumrot und Gentamycin enthält. Übertragen Sie sie anschließend einzeln auf eine 96-Well-Platte, die am Ende das ND 96-Medium enthält.Legen Sie sie für mehrere Tage in den Inkubator, um den Ausdruck der Reise V mit vier Kanälen zu ermöglichen. Zwei elektrophysiologische Methoden werden verwendet, um die Empfindlichkeit des Mechanismus der Auslösung V vier zu untersuchen. Die erste Methode ist die Zwei-Elektroden-Spannungsklemme, und dies ist der Aufbau in diesem Schritt.Ziehen Sie die Aufzeichnungspipetten für die Spannungsmessung und Strominjektion mit einem Pipettenzug aus dem 100-Mikroliter-Bolicglas. Die Pipettenelektroden sollten eine Spitzenöffnung von etwa einem Mikrometer Durchmesser haben. Als nächstes füllen Sie die Elektroden mit zwei molaren Kaliumchlorid auf, was zu einem Widerstand von 0,1 bis 0,2 Mega führt.Montieren Sie sie auf den HS two a Head Stufen. Bei diesen beiden handelt es sich um die Mikromanipulatoren, die die Spannungssteuerelektrode und die Strominjektionselektrode halten, die zusammen mit einer VG zwei x 100 virtuell geerdeten Badklemme über einen digit 1440 Digitizer mit einer Genklemme 500 Verstärkerschnittstelle verbunden sind. Und die Datenerfassung erfolgt mit der Software P clamp 10.Auf der Bühne des inversen Mikroskops befindet sich die Aufnahmekammer, in der eine Aufzeichnung durchgeführt wird, in die ein Xenopuszyt gelegt wird und in den die beiden Elektroden durch Mikromanipulation eingeführt werden. Die Lösung, die den Zyten in der Aufnahmekammer badet, wird in einem kontinuierlichen Fluss durch die Schwerkraft geführt. Nach der Zuführung wird der Einlass in die Kammer durch einen Schlauch mit einem Verteiler verbunden, der aus einer Reihe von Spritzenschalen besteht.Jede Schale wird mit einer anderen Lösung gefüllt. Der Inhalt der Badewanne wird durch das Schließen oder Öffnen verschiedener Klemmen am Schlauch verändert. Der Wechsel des Bades von einer hohen auf eine niedrige Osmolarität liefert eine Form der mechanischen Stimulation.Füllen Sie nun die gezogenen Glaspipetten mit der inneren Lösung. Der Aufbau für die Patch-Klemme ist ähnlich wie für die Spannungsklemme, bei der die Elektrode auf dem Kopftisch montiert und dann auf dem Mikromanipulator befestigt wird. Befestigen Sie die Patch-Klemmpipette an einer Fünf-Milliliter-Spritze und einem Manometer.Die Patch-Clamp-Elektrode wird auf die Oberfläche der Eizelle manipuliert. Nach dem Entfernen der Vitale-Membran wird das Pflaster durch kontinuierliches Saugen auf die Pipettenspitze geklebt, wodurch der elektrische Widerstand gegen den Prüfstromimpuls erhöht wird. Wenn der Widerstand groß genug ist, um die erfolgreiche Bildung eines Giga-Siegels anzuzeigen, wird die Elektrode mit dem Pflaster aus der Eizelle entfernt, um den Cutped-Inside-Out-Aufnahmemodus einzurichten.Wenden Sie dann Saugimpulse in das herausgeschnittene Pflaster an. Es gibt einen mechano-sensitiven Kanal von Siemens mit 40 Pico, der in der Xenopus-Eizelle nativ ist. Diese Abbildung zeigt die Aktivierung dieser Kanäle, wenn ein Saugimpuls in der Membran angelegt wird, wobei Pflaster aus Eizellen herausgeschnitten werden, die die vierte Auslösung erfolgreich exprimieren.Die Aktivierung der einheitlichen Siemens-Leitfähigkeit von 90 Pico der Auslösung V vier kann auf ähnliche Weise beobachtet werden. Hier ist der Rattentrip V four, exprimiert in Hefe, die auf einen hypotonen Schock reagiert. Ein hypotonischer Schock mit 750 Milliosmolen löst eine starke Lumineszenzerhöhung der Auslöseleistung V vier T aus, nicht jedoch der T-Leistung eines leeren Plasmids oder Plasmids, das eine Auslösung V vier mit einer Mutation in seinem Ionenfilter trägt.Und hier ist die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen dem hypotonen Schock und der Spitzenreaktion. Die makroskopischen Stromreaktionen der gesamten Eizelle auf hypotonische Reize wurden mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme untersucht. Die Spitzenströme einer Eizelle, die sehr hohe Niveaus der Wildtyp-Auslösung V exprimiert, betragen vier bis 100 Millisekunden Spannungsschritte als Reaktion auf die Entfernung von 100 millimolarem Sorbit aus der 250 Milli Osmo Badlösung und die Zugabe von drei mikromolaren Rutheniumrot.Der wiederholte Spitzenstrom nimmt bei hypotonischen Reizen zu und nimmt bei der Rückkehr zur isotonischen Lösung oder der Zugabe des Kanalblockers ab. Diese Abbildung zeigt die direkte Aktivierung des Wildtyp-Trips V vier durch eine Membrandehnung, die unter der Patch-Klemme zu sehen ist, einer Probe von Rohspuren von durchschnittlicher Qualität aus einem Pflaster, das aus einer exprimierenden Eizelle des Trips V vier herausgeschnitten wurde, die eine Aktivierung durch 60 Millimeter Quecksilbersog zeigte, die auf ein exzidiertes Inside-Out-Pflaster angewendet wurde, das bei positiven 50 Volt gehalten wurde. Die oberste Kurve wird auf einer schnelleren Zeitbasis angezeigt, um den einheitlichen Stromübergang zwischen geschlossenem und offenem Niveau anzuzeigen.Dieses Video soll Ihnen ein konkreteres Verständnis dafür vermitteln, wie Hefelumin, Geometrie und elektrophysiologische Methoden der O-Stelle auf die Untersuchung der mechanischen Empfindlichkeit von triv vier Kanälen angewendet werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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