Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne mitochondriale Ereignisse wie Superoxidblitze und Membranpotentialschwankungen in situ oder in vivo zu überwachen, um eine Echtzeitbewertung der mitochondrialen Funktion in einem physiologisch relevanten Kontext zu erreichen. Dazu wird zunächst der Skelettmuskel in der Hintergliedmaße der Maus freigelegt. Als nächstes werden konfokale Zeitrafferbilder der Skelettmuskulatur in vivo aufgenommen.

Anschließend wird das Mausherz perfundiert und mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Abschließend werden die Bilder verarbeitet und die Daten analysiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die einzelne mitochondriale Superoxid-Blitze und Membranpotentialfluktuationen in der Skelettmuskulatur, in vivo oder im perfundierten Herzen durch Zeitraffer und zweidimensionale konfokale Bilder zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Muskeln wie der Bewertung der Mitochondrienfunktion bei der Isolierung von Mitochondrien besteht darin, dass diese Technik die Echtzeitbewertung der einzelnen mitochondrialen Funktion in einem physiologisch relevanten Zustand ermöglicht. Wir demonstrieren diese Methode ist von entscheidender Bedeutung, da ein Messer, ein Tier oder ein Messergewebe Konfokale Bildgebung sind schwer zu erlernen, da es ein steileres und komplizierteres Verfahren ist. Nach der Herstellung von isotonischer balancierter Salzlösung oder IBSS, Krebs HENSEL Light Buffer oder KHB und chirurgischen Instrumenten gemäß dem Textprotokoll wird eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital anästhesiert und eine Zehenkneifung durchgeführt, um zu bestätigen, dass das Tier sediert ist.

Entfernen Sie mit einem Rasierer die Haare an einem der hinteren Gliedmaßen, bevor Sie die Stelle mit 70% Ethanol desinfizieren. Machen Sie als Nächstes einen Einschnitt in die Haut entlang der Außenseite der Extremität, um die Magenanämiemuskulatur freizulegen. Nehmen Sie dann mit einer scharfen Pinzette vorsichtig das Epimysium und schneiden Sie es mit einer Schere durch.

Präparieren Sie weiter, um das Epimysium zu entfernen und die darunter liegenden Muskelfasern freizulegen. Geben Sie 500 nanomolare Tetraethyle, Rod Domine Methylester oder TMRM zum IBSS und tauchen Sie den Muskel 30 Minuten lang in die Lösung. Nachdem Sie TMRM in den Muskel geladen haben, waschen Sie den Muskel mit TMRM-freiem IBSS mit einem 40-fachen Ölobjektiv

Legen Sie die Maus auf die Seite auf den konfokalen Mikroskoptisch und halten Sie die hintere Extremität so fest, dass sich der freiliegende Skelettmuskel in einer speziell angefertigten Kammer gegen das Deckglas befindet. Drücken Sie dann vorsichtig auf das Bein, um einen engen Kontakt zwischen dem Gewebe und dem Deckglas herzustellen, und tauchen Sie die freiliegenden Muskeln mit einer Pixeltiefe von acht Bit und einer Abtastrate von einer Sekunde pro Bild in IBSS ein. Nehmen Sie einen zweidimensionalen Serienscan des Muskels auf. Sammeln Sie sequenzielle Bilder, indem Sie zuerst bei 405 Nanometern anregen und bei mehr als 505 Nanometern sammeln.

Dann spannend bei 488 Nanometern beim Sammeln bei mehr als 505 Nanometern. Für die duale Wellenlängenanregung von MT. CCP YFP verwendet sequentielle Anregung bei 405, 488 und 543 Nanometern und sammelt Emission bei 505 bis 5, 45,505 bis 5, 45 bzw. mehr als 560 Nanometern. Für die Anregungsbildgebung mit drei Wellenlängen von M-T-C-P-Y-F-P und TMRM zur Abbildung des Mausherzens injizieren Sie dem Tier 200 Einheiten Heparin.

Nachdem Sie 10 Minuten gewartet und die Maus durch Thorakotomie eingeschläfert haben, entfernen Sie schnell das Herz, die Lunge und den daran befestigten Thymus. Übertragen Sie das implantierte Gewebe schnell auf eiskaltes IBSS. Identifizieren Sie dann die Lappen des Thymus und schälen Sie sie vorsichtig zurück.

Um die aufsteigende Aorta freizulegen, entfernen Sie die Lunge und den Thymus und isolieren Sie die Aorta, indem Sie vorsichtig das umgebende Gewebe entfernen. Machen Sie als nächstes einen Schnitt am oberen Ende der aufsteigenden Aorta vor dem ersten Ast des Aortenbogens. Halten Sie dann mit zwei Mikronahzetten vorsichtig die Wand der Aorta fest, um das Lumen freizulegen, und platzieren Sie es vorsichtig auf einer Kanüle.

Verwenden Sie eine Mikrogefäßklemme, um die Aorta an Ort und Stelle zu halten und schnell Nähte um sie herum zu binden. Entfernen Sie die Klemme und überprüfen Sie mit einer Pinzette sorgfältig, ob sich die Spitze der Kanüle über der Aortenwurzel befindet. Sichere bei Bedarf zusätzliche Bänder, um das Herz an Ort und Stelle zu halten.

Schalten Sie die Peristaltikpumpe ein und perfundieren Sie das Herz. Bei einem Milliliter pro Minute schlägt das Herz nach der Perfusion wieder weiter. Nach 10 Minuten Stabilisierung durchbluten Sie das Herz mit 10 mikromolaren BLEs-Statin und 100 bis 500 nanomolaren TMRM.

Der Herzschlag verlangsamt sich nach 10 Minuten. Stellen Sie anschließend die Position des Perfusionssystems ein und legen Sie das Herz auf den Mikroskoptisch, der mit einem Adapter ausgestattet ist, um die Kammer auf 37 Grad Celsius zu erhitzen. Geben Sie einen Milliliter KHB-Perfusionslösung in die Kammer, um das Herz teilweise einzutauchen.

Verwenden Sie eine Schlauchpumpe, um das Abwasser aus der Kammer zu entfernen. Erhöhen Sie allmählich die Geschwindigkeit der Pumpe, um einen ausreichenden Fluss zum Herzen zu gewährleisten, einen engen Kontakt des Herzens mit dem Deckglas zu gewährleisten und den Herzschlag weiter zu unterdrücken, und üben Sie sanften Druck auf das Herz aus. Stellen Sie sich das Organ so vor, wie es weiter oben in diesem Video für den Muskel beschrieben wurde, und passen Sie die Fokusebene an, um ein möglichst klares Bild zu erhalten.

Mit dem physiologischen Analysemodul der konfokalen Mikroskop-Software. Öffnen Sie zunächst die automatisch generierte Datenbank und anschließend die zu analysierende 2D-Bilddatei. Klicken Sie auf "Region of Interest" oder "ROI-Mittelwert".

Um in den Modus "Mittelwert der ROIs" zu wechseln. Schalten Sie die Anzeige der Kanäle mit Ausnahme von CP YFP bei 488 Nanometern aus, um die Blitze auszuwählen. Vergrößern Sie das Bild und bewegen Sie den Schieberegler manuell, um die seriellen 2D-Bilder abzuspielen.

Identifizieren Sie als Nächstes einzelne mitochondriale Superoxidblitze, indem Sie die Stelle lokalisieren, an der das Fluoreszenzsignal vorübergehend ansteigt. Verwenden Sie das entsprechende ROI-Tool, um die Blitze zu markieren, die Kurve mit der zeitabhängigen Fluoreszenzänderung jedes ROI wird neben dem Bild angezeigt. Nachdem Sie alle Blitze ausgewählt haben, schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle ein.

Wählen Sie einen ROI auf dem Bild außerhalb der Zelle für die Subtraktion des Hintergrundsignals aus. Geben Sie dann die durchschnittliche Fluoreszenz jedes ROI zusammen mit den Zeitmarkierungen aus. Notieren Sie die Anzahl der Blitze in jeder der seriellen Scan-Bilddateien zusammen mit der Scanzeit und dem Bereich der Zelle.

Verwenden Sie Excel, um die Blitzfrequenz als Anzahl der Blitze pro 100 Sekunden und pro 1000 Quadratmikrometer Zellfläche zu berechnen. Zur Berechnung der Amplitudenzeit bis zum Höhepunkt und der Abklingzeit für jeden Blitz. Verwenden Sie ein speziell entwickeltes Programm für die Flash-Parameteranalyse, das Teil eines benutzerdefinierten Programms ist, das in interaktiver Datensprache geschrieben ist.

Unter Verwendung dieses Protokolls kann die In-vivo-Bildgebung einzelner mitochondrialer Ereignisse in der Skelettmuskulatur von anästhesierten Mäusen durchgeführt werden, gefolgt von einer Insi-Bildgebung im perfundierten Herzen. Wie hier gezeigt. TMRM, ein Indikator für das mitochondriale Membranpotential, wird häufig verwendet, um die Lokalisation von M-T-C-P-Y-F-P zu verifizieren, und sollte ein vollständiges Überlappungsmuster mit dem M-T-C-P-Y-F-P-Signal zeigen.

Seine Spektren sind von denen von CP YFP unterscheidbar, und durch die Verwendung der sequentiellen Anregungsmethode werden sich die Emissionssignale von TMRM und M-T-C-P-Y-F-P nicht gegenseitig stören. Diese Bilder zeigen, dass ein einzelner mitochondrialer Superoxid-Blitz, der von Membrandepolarisation begleitet wird, in den seriellen 2D-Scanbildern identifiziert werden kann, die einen vorübergehenden Fluoreszenzanstieg über den Hintergrundsignalen sowohl im Skelettmuskelgewebe als auch im Myokard zeigten. Neben einer hohen Auflösung ist auch eine adäquate Fluoreszenzintensität erforderlich.

Dies kann durch Modulation der Laserintensität und der Verstärkung in den Sammelkanälen erreicht werden. Im Allgemeinen wird das basale Fluoreszenzsignal von der Zelle auf ein Drittel bis ein Viertel der maximalen Intensität des Kanals eingestellt. Da das Expressionsniveau von M-T-C-P-Y-F-P und die Beladung mit TMRM von Tier zu Tier variieren können, sollte für jedes Experiment eine Feinabstimmung der Bildgebungsbedingungen vorgenommen werden, sowohl physiologische als auch pathologische Störungen, wie z. B. metabolische Substrate.

Elektrische Stimulation, wie hier angedeutet, und ischämische Reperfusion wurden verwendet, um zu zeigen, dass die Superoxid-Flash-Aktivität auf Veränderungen des zellulären Stoffwechselstatus reagiert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine angemessene Anästhesie des Mundes und den korrekten Zustand des durchbluteten Herzens aufrechtzuerhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Ischämie und Fusion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie mitochondriale Dysfunktion bei Myokardleukämie und Reperfusionsschäden zu beantworten.