Name: Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Erfahren Sie eine 3D-Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der Chromatinarchitektur in Hodenkeimzellen. Diese Technik verbessert die Sensitivität für subnukleäre Strukturen und eignet sich für Immunfluoreszenz sowie FISH-Anwendungen.

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Ich danke Jeannie T. Lee für die Betreuung dieses Projekts, als ich im Lee-Labor war, und Tyler Broering für die Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch den Basil O'Connor Starter Scholar Award der March of Dimes Foundation und den NIH Grant GM098605 unterstützt.

1.3D Slide-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor:<ol>
<li>CSK Puffer: 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. PH auf 6,8 mit 1 M NaOH einstellen. Bewahren Sie den CSK-Puffer bei 4 °C auf.</li>
		<li>CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100: Fügen Sie 200 l Triton X-100 bis 40 ml CSK-Puffer hinzu. Mischen Sie die Lösung mit Magnetrührer, bis Triton X-100 vollständig aufgelöst ist. Bewahren Sie den CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100 bei 4 °C auf.</li>
		<li>4% Paraformaldehyd (PFA)-PBS, pH 7,4: 4 g PFA in ca. 70-80 ml Wasser auflösen. Um den Auflöseprozess zu beschleunigen, fügen Sie ca. 20 l 4 N NAOH hinzu und halten Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 60 °C, bis sich die PFA vollständig aufgelöst hat und die Lösung transparent ist. Dieser Vorgang dauert ca. 1 Std. Nachdem PFA vollständig aufgelöst hat, 10 ml 10x PBS hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen mit Wasser auf 100 ml ein und kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur (25 °C) ab. Verwenden Sie für jedes neue Experiment eine frisch vorbereitete Lösung. Hinweis: Erhalten Sie eine institutionelle Genehmigung für alle Tierarbeiten und halten Sie sich an die einschlägigen Tierpflegerichtlinien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanisieren männliche Mäuse. Mit Zangen und Schere, verbrauchen Sie die Hoden von der Maus. Legen Sie die Hoden in PBS (oder RPMI 1640) auf. Führen Sie nach der Entfernung von Hoden schnell die folgenden Schritte 1.3-1.4 aus, um den Abbau der RNA zu verhindern.</li>
	<li>Rupture die Hoden auf einer kleinen Petrischale und entfernen Sie die Tunika albuginea. Entwirren Sie die seminiferous tubulies in PBS auf Eis mit Zangen.</li>
	<li>Mit Zangen mehrere Tubuli (mehrere Tubules ca. 5-10 mm lang) in einen Brunnen einer 4-Well-Schale mit 500 ml CSK-Puffer + 0,5% Triton X-100 auf Eis übertragen und 6 min brüten. Eine Überexposition gegenüber dem CSK-Puffer kann zu einer Unterbrechung der Zellen führen.</li>
	<li>Mit Zangen, übertragen Sie alle Tubuli auf einen Brunnen einer 4-Well-Schale mit 4% PFA-PBS-Lösung. Dieser Schritt kann ohne Stereomikroskop vorgeformt, aber optional verwendet werden. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Gleichzeitig beginnen Sie mit der Vorbereitung von 12 Zytospinkammern während der Inkubationszeiten.</li>
	<li>Mit Zangen, übertragen Sie alle Tubuli auf einen Brunnen einer 4-Well-Schale, die PBS enthält. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Auf der Rückseite einer Glasrutsche alle Tubuli in 30 l PBS übertragen (die Oberseite der Rutsche sollte aufgrund kationischer Ladung vermieden werden). Mit den Spitzen von zwei Zangen, reißen Sie die Tubuli in Stücke. Schneiden Sie die Tubuli in horizontaler Richtung, indem Sie Tubules zwischen den Spitzen zweier Zangen schneiden und die Zangen horizontal ziehen. Fahren Sie mit diesem Schritt für ca. 10-20 Sek. fort.</li>
	<li>Mischen Sie die Suspension durch Pipettieren mit einer P20 Pipette.</li>
	<li>Die Suspension in ein Mikrozentrifugenrohr geben, mit PBS auf ca. 1,3 ml verdünnen. Tragen Sie 100 l Suspension auf jede der 12 Zytospinkammern auf (insgesamt 1,2 ml). In diesem Schritt muss die Konzentration der Zellen nicht bestimmt werden.</li>
	<li>Cytospin die Proben bei 2.000 U/min für 10 min bei Raumtemperatur. Nach dem Zytospinnen, trockene Dias auf Laborbank für ein paar Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem die Rutschen für einige Minuten vollständig trocknen durften, gehen Sie zum nächsten Schritt.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias mit einem Coplin-Glas, das PBS enthält, 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Dias in ein Coplin-Glas mit 70% Ethanol übertragen und mindestens 2 min vor Beginn der RNA FISH warten. Die Rutschen sind für einige Wochen in 70% Ethanol bei 4 °C stabil. Zur Langzeitlagerung dehydrieren Sie Dias mit serieller Behandlung mit 80% und 100% Ethanol in Coplin-Gläsern für je 2 min und lufttrocken die Dias vollständig dehydrieren. Bei -80 °C in einer Schiebebox aufbewahren.</li>
</ol>2. Cot-1 DNA Probe Vorbereitung durch Zufällige Primierung
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor:<ol>
<li>Hybridisierungspuffer: Mischen Sie die verfahrenen Komponenten, um 900 ml Hybridisierungspuffer zu erstellen; diese Lösung wird verwendet, um Sonden zu lagern. Dieser Hybridisierungspufferbestand ermöglicht die Zugabe von 10% Volumen der RNase-Inhibitorlösung (Ribonucleosid Vanadyl Complex) vor der Hybridisierung.<table><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
					<td>Menge (l)</td>
					<td>Endgültige Konzentration</td>
				</tr>
<tr>
<td>Formamid</td>
					<td>500</td>
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>50% Dextran</td>
					<td>200</td>
					<td>10% (mit/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>1% BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>Vor der Hybridisierung 1/10 Vol von 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Complex oder Wasser in den Hybridisierungspufferstock geben, um der endgültigen Konzentration zu entsprechen. Bei -20 °C ist diese Mischung seit mehr als einem Jahr stabil.</li>
		<li>20x SSC: 88,2 g Natriumcitrat und 175,3 g NaCl in ca. 800 ml Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit ein paar Tropfen von 1 M HCl ein. Fügen Sie Wasser hinzu, um die endige Lautstärke auf 1 L einzustellen. Sterilisieren durch Autoklavieren. Nach der Zubereitung kann 20x SSC bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
		<li>50% (w/v) Dextran: Wasser rühren und langsam 50 g Dextransulfat hinzufügen. Halten Sie das Rühren über Nacht bei Raumtemperatur. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 100 ml einzustellen. Bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie die unten aufgeführten Bestandteile zu einer PCR-Röhre hinzu. Mit einer PCR-Maschine die Lösung 5 min bei 95 °C mischen und inkubieren.<table><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
				<td align="center">Menge pro Reaktion (l)</td>
				<td align="center">Finale</td>
			</tr>
<tr>
<td>Kinderbett-1 DNA: 1 mg/ml</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 g</td>
			</tr>
<tr>
<td>Random 9mer Primer (aus Kit)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Wasser</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie kurz und legen Sie auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie die folgenden Komponenten hinzu. Mit einer PCR-Maschine 30 min bei 37 °C mischen und inkubieren. (Einzelheiten zum verwendeten Kit finden Sie in der Tabelle der Reagenzien und Ausrüstungen).<table><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
				<td align="center">Menge pro Reaktion (l)</td>
				<td align="center">Endgültige Konzentration</td>
			</tr>
<tr>
<td>Mischung aus Schritt 2.2</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>5x Nukleotidpuffer (vom Kit)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 M</td>
			</tr>
<tr>
<td>Klenow (ab Kit)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Fügen Sie 2 l Stop-Puffer (vom Kit) hinzu, um die Reaktion abzubrechen.</li>
	<li>Reinigen Sie die gestoppte Reaktion mit Mikrospinsäulen.</li>
	<li>Fügen Sie der gereinigten Fraktion 50 g Hering-Sperma-DNA (50-fache Überschuss an Schablonen-Cot-1-DNA) hinzu.</li>
	<li>Messen Sie das Gesamtvolumen mit einer Pipette. 0,7x Volumen von 100% Ethanol und 0,1x Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,2), gut mischen und Zentrifuge für 15 min bei maximaler Geschwindigkeit (17.000 x g) mit einer Mikrozentrifuge bei 4 °C mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Flüssigkeit, und fügen Sie 200 l 70% Ethanol, gut mischen und Zentrifuge für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit. Trocknen Sie den Niederschlag für 10-30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Lösen Sie das Pellet in 20 l Hybridisierungspuffer. Da das Pellet oft schwer aufzulösen ist, Pipette wiederholt. Alternativ kann ein Wirbelmischer auch verwendet werden, um das Pellet effizient aufzulösen. Sonden können bis zum Gebrauch bei -20 °C aufbewahrt werden.</li>
</ol>3. Kinderbett-1 RNA FISH
<ol><li>Fügen Sie die unten aufgeführten Komponenten zu einer PCR-Röhre hinzu. Mit einer PCR-Maschine 10 min bei 80 °C inkubieren, gefolgt von einem Vorglühen von ca. 10-30 min bei 42 °C. Bei 42 °C bis zur Hybridisierung aufbewahren. Ribonucleoside Vanadyl Complex ist optional; es kann durch Wasser ersetzt werden.<table><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
				<td align="center">Menge pro Reaktion (l)</td>
				<td align="center">Finale</td>
			</tr>
<tr>
<td>Cot-1 DNA-Sonde (50 ng/l)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>Ribonukleosid Vanadyl Komplex (200 mM)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 mM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Hybridisierungspuffer</td>
				<td align="center">hinzugefügt zu 20</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Dehydrieren gleitet in einem Coplin-Glas mit 80% Ethanol für 2 min, gefolgt von einem Coplin-Glas mit 100% Ethanol für 2 min. Trockenrutschen komplett auf der Laborbank bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Eine Spitzenboxkammer (gefüllt mit 2-3 cm Wasser) in einem 42 °C Inkubator im Voraus vorheizen. Legen Sie die Rutsche auf die Spitzenboxkammer. Kurz zentrifugieren Sie die vorannealed Sonden und Pipette direkt auf die dehydrierten Dias. Vermeiden Sie Blasen zu machen. Bedecken Sie die Rutsche vorsichtig mit einem Deckelschlupf.</li>
	<li>Hybridisieren Sie für 6 Stunden bis über Nacht (14-15 Std.) bei 42 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie Waschlösungen in Coplin-Gläsern vor (zwei Gläser mit 2x SSC und 50% Formamid und zwei Gläser mit 2x SSC). Bei 42 °C 30 min im Wasserbad vorheizen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Deckelschlupf vom Rand des Schlittens zu entfernen. Vermeiden Sie Kratzproben. Schlitten in einem Coplin-Glas mit 2x SSC und 50% Formamid für 5 min bei 45 °C waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
	<li>Schlitten in einem Coplin-Glas mit 2x SSC für 5 min bei 45 °C waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
	<li>Fügen Sie den Dias 20 l DAPI-Montagemedien hinzu und decken Sie sie mit einem Deckbedeckungsbeleg ab. Drücken Sie das Abdeckungsglas vorsichtig, um zusätzliche Montagemedien zu entfernen. Blot zusätzliche Montagemedien mit Reinigungsgewebe. Die Dias sind für die Mikroskopie-Evaluierung bereit.</li>
</ol>

<ol><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li>
<li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li>
<li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li>
<li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li>
<li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+imprinted+X+inactivation%3A+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li>
<li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li>
<li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li>
</ol>

Der Autor hat nichts zu verraten.

Bei der 3D-Folienvorbereitung geht der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt voraus. Diese Schritte werden direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt, wodurch die dreidimensionale Chromatinstruktur erhalten bleibt. Eine alternative Möglichkeit zur Erhaltung der Chromatinstruktur für RNA/DNA FISH besteht darin, den Permeabilisationsschritt und den Fixierungsschritt gleichzeitig durchzuführen. Diese alternative Technik wurde in Beuteltierkeimzellen und in Mauspräimplantationsembryonen7,8durchgeführt. We...

In Hoden unterscheiden sich Keimzellen von diploider Spermatogonie durch Meiose zu reifem, haploiden Spermatozoen. Dabei wird die Kernchromatinstruktur von Keimzellen kontinuierlich und dynamisch umgestaltet. Oberflächenbreiten werden häufig für die zytologische Untersuchung einzelner spermatogener Zellen verwendet. Eine vorherrschende Methode der Oberflächenausbreitung verwendet hypotonische Behandlung, durch die einzelne spermatogene Zellen verteilt und abgeflacht werden1. Diese Bedingungen sind optimal für die detaillierte Analyse meiotischer Chromosomen. Chromosomale Merkmale wie synaptische Status und Rekombinationsschwerpunkte sind mit dieser Methode leicht zu beobachten. Die hypotonische Behandlung stört jedoch die subnukleare Chromatinarchitektur, so dass diese Technik nicht für die strukturelle Analyse von Kernen geeignet ist. Daher wurde eine verbesserte Methode entwickelt, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet (Abbildung 1). Die 3D-Diamethode hat den Nachweis der entstehenden RNA-Lokalisierung in Kernen ermöglicht, da sie ursprünglich optimiert wurde, um Genexpression und Chromatinzustände während der Differenzierung von Hokulären Keimzellen durch RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)2,3zu untersuchen. Diese 3D-Methode ist auch auf die Kombination von Immunfluoreszenz, DNA und RNA FISH anwendbar. Zusätzlich hat diese Methode bei der Entdeckung von postmetiotischem Sexchromatin (PMSC) unterstützt, einem stillen Fach der Geschlechtschromosomen, die in postmetiotischen Spermaatiden gefunden werden2.
Die 3D-Folienmethode wurde ursprünglich durch die Kombination von zwei wesentlichen Schritten der Gleitvorbereitung optimiert, die häufig für die Kernfärbung verwendet werden: der Befestigungsschritt zur Fixierung von Kernmaterialien und der Permeabilisierungsschritt zur Entfernung von zytoplasmatischen Materialien, um die Zugänglichkeit von Färbereagenzien wie Antikörpern und FISH-Sonden zu verbessern. Wie bereits in einer anderen Publikation3beschrieben, wurde festgestellt, dass der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt vorausgehen muss, um optimale Ergebnisse mit niedrigem zytoplasmatischen Hintergrund zu erzielen. Bei dieser 3D-Diamethode werden der Permeabilisierungsschritt und der nachfolgende Fixierungsschritt direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt und es folgt die mechanische Dissoziation von Keimzellen mit Zangen vor dem Zytospinnen auf Dias. Eine alternative Methode für RNA FISH von spermatogenen Zellen wurde in einem anderen Labor entwickelt4. Bei dieser Methode muss der Permeabilisierungsschritt im Einklang mit der 3D-Methode dem Fixierungsschritt vorausgehen, um optimale Ergebnisse von RNA FISH zu erhalten.
Das folgende Protokoll beschreibt die 3D-Diamethode und liefert ein Beispiel für eine mögliche Anwendung, Cot-1 RNA FISH zum Nachweis von kernimimten RNAs. Cot-1 DNA besteht aus sich wiederholenden Elementen im Genom. Hierbei wird eine Cot-1-DNA-Sonde zu einem Intron und UTR der entstehenden Transkripte hybridisiert, wodurch die transkriptionsaktiven Regionen im Kern5,6erkannt werden. 3D-Dias sind vielseitig und können auf eine Kombination von Immunfluoreszenz-, DNA- und RNA-FISH-Techniken angewendet werden, um eine detaillierte Untersuchung der räumlichen Beziehungen zwischen Chromatinarchitektur zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Cot-1 DNA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene Prime-It Fluorfluoreszenz-Markierungskit</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>Heringssperma DNA-Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol. 200 proof (absolut)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Formamid deionisiert</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat tribasisches Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat-Natriumsalz aus Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Ribonukleosid-Vanadyl-Komplex</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 Säulen</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Schale</td><td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Druckluft-Inkubator</td><td>Revolutionäre Wissenschaft</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

folienvorbereitungsmethode zur erhaltung der dreidimensionalen chromatinarchitektur von hodenkeimzellen

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Bei der Differenzierung der Hokulären Keimzellen ändert sich die Struktur des Kernchromatins dynamisch. Im Folgenden wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die dreidimensionale Chromatinanordnung von Hodenkeimzellen bei Mäusen erhalten werden soll; Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Bei dieser Methode werden Hodentubuli direkt mit einem Permeabilisierungsschritt behandelt, der zytoplasmatisches Material entfernt, gefolgt von einem Fixierungsschritt, der Kernmaterialien fixiert. Tubules werden dann dissoziiert, die Zellsuspension ist zytospun, und Zellen haften an Dias. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit gegenüber dem Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und die Kombination dieser Nachweismethoden anwendbar. Als Beispiel für eine mögliche Anwendung der 3D-Diamethode wird gezeigt, dass ein Cot-1-RNA-FISH entstehende RNAs erkennt. Die 3D-Diamethode wird die detaillierte Untersuchung räumlicher Zusammenhänge zwischen Chromatinstruktur, DNA und RNA während der Differenzierung von Hodenkeimzellen erleichtern.

Abbildung 2zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer 3D-Folie . In diesem Experiment wurde Cot-1 RNA FISH durchgeführt, um eine aufkommende Transkription zusammen mit Derimmunostainierung mit Anti-CBX1- und H2AX-Antikörpern zu erkennen. Um RNA FISH und Immunostaining zu kombinieren, wurde zunächst eine Immunfärbung durchgeführt, gefolgt von RNA FISH, wie in3beschrieben. CBX1 ist ein Heterochromatin-Protein, das pericentromer Heterochromatin und stille Geschlechtschromosomen in der Meiose, einem...

Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.

Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Bei dieser dreidimensionalen Methode zur Vorbereitung von Objektträgern bleibt die 3D-Chromatinanordnung der Zellen erhalten, wie sie an Hodenkimzellen von Mäusen gezeigt wurde. Zuerst werden die ferösen Tubuli permiert, um die zytoplasmatischen Materialien zu entfernen und die Zugänglichkeit von Färbereagenzien wie Antikörpern und Fischsonden zu verbessern. Nach dem Fixieren des Kernmaterials werden die Keimzellen mit einer Pinzette mechanisch dissoziiert und die Proben auf Objektträger cytosiniert.Erfassen Sie als Nächstes Daten mit mehreren Z-Schnitten, um einen Zellkern in 3D abzudecken, wenn sie strategisch auf Ergebnisse aus 3D-Objektträgervorbereitungen angewendet werden. Mit Hilfe von COT-1-RNA können Fische nukleäre naszierende RNAs zeigen, um die transkriptionell aktiven Regionen im Zellkern zu detektieren. Ich habe diese Methode entwickelt, als ich im Genlabor des Massachusetts General Hospital war.Zu dieser Zeit optimierte ich die Methode zur Vorbereitung des Objektträgers für Baumwoll-RNA-Fluoreszenzeinblicke in die Hybridisierung, auch Fisch zum Nachweis von Nacent genannt. RNS. Cotton-Sonden können repetitive Sequenzen in Introns und TLS hybridisieren und den Ort der

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video-Protokoll zeigt die Squash-Technik in der Johansen-Labor dient zur...

Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung

Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten, runden Spermaatien und lästigen Spermaatiden aus erwachsenen Maushoden mit einem diskontinuierlichen Rinderserum-Albumin-Dichtegradienten mit Standard-Laborgeräten.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zellteilung im intakten Gewebe durch lebende und feste Zellmikroskopie mit Drosophila meiotischen Spermatozyten zu analysieren. Das Protokoll zeigt, wie ganze, intakte Hoden von Drosophila-Larven und frühen Pupas isoliert und wie man sie für die Mikroskopie verarbeitet und montiert.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Meiotische Fehler in Synapsen und Rekombination sind bei Säugetier-Eizellen üblich. Eine rigorose Analyse der Proteine, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist unerlässlich, um zu verstehen, wie und warum die Oogenese oft schief geht. Die hier vorgestellten Techniken ermöglichen ein umfassendes Monitoring von Rekombination und Synapsen, um die Eizellqualität bei Mäusen zu bewerten.

Präparation meiotischer Chromosomenspreizungen aus Maus-Eizellen zur Beurteilung von Synapse und Rekombination

Erfahren Sie eine 3D-Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der Chromatinarchitektur in Hodenkeimzellen. Diese Technik verbessert die Sensitivität für subnukleäre Strukturen und eignet sich für Immunfluoreszenz sowie FISH-Anwendungen.

Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen

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