Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen
10. Januar 2014
Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.
Bei dieser dreidimensionalen Methode zur Vorbereitung von Objektträgern bleibt die 3D-Chromatinanordnung der Zellen erhalten, wie sie an Hodenkimzellen von Mäusen gezeigt wurde. Zuerst werden die ferösen Tubuli permiert, um die zytoplasmatischen Materialien zu entfernen und die Zugänglichkeit von Färbereagenzien wie Antikörpern und Fischsonden zu verbessern. Nach dem Fixieren des Kernmaterials werden die Keimzellen mit einer Pinzette mechanisch dissoziiert und die Proben auf Objektträger cytosiniert.
Erfassen Sie als Nächstes Daten mit mehreren Z-Schnitten, um einen Zellkern in 3D abzudecken, wenn sie strategisch auf Ergebnisse aus 3D-Objektträgervorbereitungen angewendet werden. Mit Hilfe von COT-1-RNA können Fische nukleäre naszierende RNAs zeigen, um die transkriptionell aktiven Regionen im Zellkern zu detektieren. Ich habe diese Methode entwickelt, als ich im Genlabor des Massachusetts General Hospital war.
Zu dieser Zeit optimierte ich die Methode zur Vorbereitung des Objektträgers für Baumwoll-RNA-Fluoreszenzeinblicke in die Hybridisierung, auch Fisch zum Nachweis von Nacent genannt. RNS. Cotton-Sonden können repetitive Sequenzen in Introns und TLS hybridisieren und den Ort der aktiven Transkription sichtbar machen. Baumwoll-RA-Fische benötigen die Erhaltung der nukleären RNA-Verteilung.
Der entscheidende Punkt dieser richtigen Vorbereitungsmethode ist, dass die Aktivierungsschritte mit dem Fixierungsschritt fortfahren müssen. Um den Cyto-Plasma-Hintergrund zu entfernen, entwirren Sie die OUS-Tubuli aus einem geplatzten Hoden in PBS auf Eis, übertragen Sie mehrere Stücke von Tubuli mit einer Länge von fünf bis 10 Millimetern auf 500 Mikroliter CSK-Puffer mit 0,5 % Tritton x 100 und inkubieren Sie sechs Minuten lang auf Eis. Übertragen Sie nun alle Tubuli in eine 4%ige P-F-A-P-B-S-Lösung in einer Vertiefung einer Vier-Well-Schale und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Inkubieren Sie anschließend alle Tubuli in PBS fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Richten Sie die Kammern für den Cytospin und den Cytospin während der Inkubationszeiten auf der Rückseite eines Objektträgers ein und überführen Sie alle Tubuli in 30 Mikroliter PBS. Reiße dann mit den Spitzen von zwei Pinzetten die Tubuli in Stücke.
Schneide die Tubuli in horizontaler Richtung, indem du die Tubuli zwischen die Spitzen von zwei Pinzetten klemmst und die Pinzette horizontal ziehst. Nachdem Sie 30 Mikroliter PBS hinzugefügt haben, mischen Sie die Suspension durch Pipettieren, übertragen Sie sie dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie PBS zu einem Gesamtvolumen von 1,3 Millilitern hinzu. Tragen Sie nun 100 Mikroliter der Suspension auf jede der Zytospinkammern auf. Zyto.
Schleudern Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2000 U/min. Trocknen Sie die Objektträger einige Minuten lang auf einem Labortisch bei Raumtemperatur mit einem Coplan-Glas, das PBS enthält. Waschen Sie die Objektträger fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Übertragen Sie dann die Objektträger für mindestens zwei Minuten auf 70%iges Ethanol. In einer 20-Mikroliter-Reaktion fügen Sie 100 abgefangene Nanogramm, eine 1D-NA-Sonde, einen 20-millimolaren Ribonukleotid-Vanadyl-Komplex und einen Hybridisierungspuffer hinzu. Mit einem PCR-Gerät 10 Minuten bei 80 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von Prea.
Kniender Schritt bei 42 Grad Celsius bis zur Einsatzbereitschaft. Dehydrieren Sie nun die Objektträger nacheinander zwei Minuten lang in 80 % Ethanol, gefolgt von 100 % Ethanol für zwei Minuten. Trocknen Sie die Objektträger vollständig auf dem Labortisch bei Raumtemperatur.
Legen Sie nun den Objektträger auf eine Kippbox-Kammer bei 42 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie anschließend kurz die Preneed-Sonden und pipettieren Sie sie direkt auf die dehydrierten Objektträger. Legen Sie vorsichtig einen Deckglas über den Objektträger für den Hybridisierungsschritt von mindestens sechs Stunden bei 42 Grad Celsius.
Die Waschlösungen in Coplan-Gläsern 30 Minuten lang im Wasserbad mit einer Rasierklinge auf 42 Grad Celsius vorwärmen, das Deckglas vom Rand des Objektträgers entfernen, ohne die Proben zu zerkratzen, die Objektträger nach und nach jeweils fünf Minuten in die Waschlösung tauchen. Beginnend mit dem ersten Coplan-Tiegel mit zwei XSSC und 50 % Form amid, gefolgt vom zweiten Coplan-Tiegel mit zwei XSSC und 50 % form amid. Und dann die letzten beiden Gläser mit zwei XSSC.
Geben Sie dann 20 Mikroliter DPI-Eindeckmittel zu den Proben und legen Sie ein Deckglas auf. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas und tupfen Sie das zusätzliche Eindeckmedium mit einem Reinigungstuch ab. In diesem Experiment wurde ein RNA-Fisch gefangen, um gleichzeitig die naszierende Transkription und Immunfärbung von Proteinen zu detektieren, die in der Immunhistochemie des XY-Körpers lokalisiert sind.
Auf dieser PACU wiesen die Spermatozyten das Heterochromatinprotein CCB X one und auch eine phosphorylierte Form der Histonvariante H zwei A X auf dem XY-Körper nach. Der resultierende Fisch fing ein Signal, das sich auf den e chromatischen Bereichen in Oberflächenspreizungen ansammelte, die mit hypotoner Lösung behandelt wurden. Die dreidimensionale Chromatinstruktur wird gestört und alle myotischen Chromosomenachsen können in einer einzigen Z-Ebene erfasst werden.
Bei der 3D-Objektträgervorbereitung bleibt jedoch die intakte Chromatinstruktur erhalten. Diese richtige Präparationsmethode ist anwendbar für Immunfluoreszenz-DNA- und RNA-Fische und die Kombination dieser Nachweismethoden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige dreidimensionale (3D) Objektträgerpräparationsmethode vor, die die Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen erhält. Die Methode verbessert die Empfindlichkeit bei der Detektion subnukleärer Strukturen und eignet sich für verschiedene Fluoreszenztechniken.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Das Verständnis der Chromatinstruktur ist entscheidend für die Untersuchung der Genexpression.
- Herkömmliche Methoden können die dreidimensionalen Chromatinanordnungen möglicherweise nicht ausreichend erhalten.
- Testikuläre Keimzellen dienen als Modell zur Untersuchung der Chromatindynamik.
- Immunfluoreszenz und FISH sind zentrale Techniken zur Visualisierung von Chromatin.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Erhaltung der dreidimensionalen Struktur von Chromatin in Keimzellen.
- Verbesserung der Detektion nukleärer Strukturen mithilfe fortschrittlicher Bildgebungsverfahren.
- Erleichterung der Untersuchung transkriptionell aktiver Regionen innerhalb des Zellkerns.
Verwendete Methoden
- Permeabilisierung der seminiferen Tubuli, um den Zugang für die Färbung zu verbessern.
- Mechanische Dissoziation von Keimzellen zur Präparation von Objektträgern.
- Anwendung mehrerer Z-Abschnitte für die 3D-Bildgebung von Kernen.
- Verwendung von COT-one-RNA-FISH zur Visualisierung neu synthetisierter RNAs.
Hauptergebnisse
- Die 3D-Slide-Methode bewahrt die Chromatinarchitektur effektiv auf.
- Es wurde eine verbesserte Empfindlichkeit zur Detektion subnukleärer Strukturen erreicht.
- Eine erfolgreiche Visualisierung transkriptionell aktiver Regionen im Zellkern gelang.
- Die Methode ist für verschiedene Fluoreszenztechniken anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Die 3D-Präparationsmethode für Objektträger stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Chromatin-Forschung dar.
- Diese Technik kann unser Verständnis der Genregulation verbessern.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Zelltypen und Forschungsbereiche erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erhaltung der nativen Chromatinarchitektur ermöglicht eine genaue Beurteilung der transkriptionellen Aktivität und der nukleären Organisation in Keimzellmodellen. Diese Methode unterstützt die Target-Validierung, indem sie die räumlichen Beziehungen zwischen DNA, RNA und Protein-Komplexen während der Differenzierung bewahrt. Sie bietet eine reproduzierbare Plattform für die mechanistische Entschärfung von Risiken in frühen Entdeckungsworkflows.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die 3D-Chromatin-Architektur erhalten bleibt, um eine genaue Beurteilung der Zielstrukturenbindung zu ermöglichen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Nachweis der räumlichen Übereinstimmung von neu gebildeter RNA und Protein in intakten Kernen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem chromatische Dynamiken aufgedeckt werden, die mit der transkriptionellen Regulation in krankheitsrelevanten Systemen verknüpft sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitschaft für Assays: Bereitet validierte biologische Systeme für die Immunfluoreszenz und FISH-basierte Screening von Chromatin-modulierenden Verbindungen vor.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt standardisierte Daten aus mehreren Z-Schnitten, die einen zuverlässigen Vergleich von nukleären Färbemustern ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Unterstützt die Wiederverwendung der Plattform für mehrere Zielstrukturen, indem die Empfindlichkeit gegenüber subnukleären Strukturen für nachgeschaltete Anwendungen erhalten bleibt.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Erhält die Chromatin-Kontinuität von Modellen der Keimzellen-Differenzierung bis zur präklinischen Validierung epigenetischer Zielstrukturen.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die translationale Entwicklung von Biomarkern, indem räumliche RNA-DNA-Interaktionen, die auf transkriptionelle Zustände hinweisen, erhalten bleiben.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht eine mechanistische Risikominimierung durch direkte Visualisierung von Veränderungen der nukleären Architektur als Reaktion auf Störungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in Entdeckungsbiologie-Arbeitsabläufe, indem sie die Chromatinstruktur zur Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in Keimzellenmodellen erhält.
- Entdeckungsbereich Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem native Chromatinanordnungen erhalten bleiben, was eine genaue Interpretation von Bildgebungsdaten ermöglicht.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher durch reproduzierbare Objektträgerpräparation, kompatibel mit multiplex Immunfluoreszenz und FISH-Nachweis.
- Analytik: Ermöglicht den quantitativen Vergleich nuklearer Strukturen mittels Z-Schnitt-Bildgebung und Messung der Signal-Kokomigration.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem chromatinbedingte Zustände erhalten bleiben, die für die Validierung epigenetischer Mechanismen relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, auf Cytospin basierende Plattform zur Erhaltung der Chromatinarchitektur über mehrere Keimzellenstadien hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Zuversicht bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in Studien zur nukleären Organisation reduziert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Permeabilisierungs-, Fixierungs- und Cytospin-Schritte.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem eine direkte Visualisierung der transkriptionellen Aktivität in intakten chromatinbasierten Kontexten ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung durch funktionelle, chromatinbasierte Validierung von Zielstrukturen in Modellen der Keimzellen-Differenzierung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Chromatinbiologie und Fluoreszenzmikroskopie für die korrekte Durchführung und Interpretation.
- Abhängig von einer Zentrifuge für Zytosin und optimierten Puffersystemen für eine konsistente Objektträgerpräparation.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams bei Permeabilisierung und Fixierung voraus, um die Verteilung nukleärer RNA zu bewahren.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf andere Zelltypen mit unterschiedlicher nukleärer Fragilität angewendet wird.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer sorgfältigen mechanischen Dissoziation, um eine Störung des Chromatins während der Tubulusverarbeitung zu vermeiden.
