Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Zahnentwicklung über mehrere Tage zu verfolgen. In vitro wird dies erreicht, indem der sich entwickelnde Unterkiefer fötaler Mäuse in lebende Scheiben zerlegt wird, um die sich entwickelnden Zahnkeime in einem zweiten Schritt freizulegen. Die Scheiben werden ausgewählt, auf Filter über einem Kulturmedium platziert und inkubiert, um die Entwicklung zu ermöglichen.

Als nächstes werden die Schnitte mit einem Lineage-Tracer markiert, um die Zellbewegung während der Kulturperiode zu verfolgen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die dynamische Natur des Zahngewebes zeigen, wie es sich während der Explankultur entwickelt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der herkömmlichen Explantatkultur besteht darin, dass sich intern entwickelnde Organe wie Zahnschmuckstücke während ihrer gesamten Entwicklung im Kontext des umgebenden Gewebes beobachtet werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Hack- und Auswahlschritte schwierig sein können, wenn die Einrichtung der Maschine oder die Ausrichtung des Gewebes ungenau ist.

Bereiten Sie zunächst das Sezier- und Kulturmedium für die embryonalen Organe vor, indem Sie 1 % Glutamat und 1 % Penicillin-Streptomycin zu 500 Millilitern fortgeschrittenem ECCOs modifiziertem Adlermedium F 12 hinzufügen. Dann, wie in dem Videoartikel von Takahashi Sumi beschrieben, sezieren sie die Embryonen von Mäusen zwischen den Stadien E 11.5 und E 15.5 der Entwicklung und legen sie in eine Petrischale, die frisches Medium enthält. Als nächstes enthaupten Sie die Embryonen mit einer frisch geschärften sterilen Wolframnadel und geben die Köpfe in eine frische Schüssel mit vorgekühltem Medium auf Eis.

Isolieren Sie dann die Mandibeln von den Köpfen, indem Sie eine Nadel in die Mundhöhle stecken und vorübergehend in Richtung Hinterkopf schneiden. Lagern Sie die isolierten Mandibeln in vorgekühltem Medium auf Eis, bevor sie geschnitten werden. Reinigen Sie vor dem Schneiden des Unterkiefers die Montagescheibe und die Klinge des Gewebezerkleinerers mit 70 % Ethanol und stellen Sie sicher, dass die Klinge bündig mit der Montagescheibe abschließt.

Wenn sie herunterfällt, muss die Klinge nach dem Schneiden von ca. 200 Mandibeln ausgetauscht werden, der Schnittabstand wird auf 200 bis 400 Mikrometer je nach Alter der Probe eingestellt, und je nachdem, ob für einen E 14,5-Embryo, bei dem eine Isolierung des Zahnkeims erforderlich ist, der gesamte Zahnkeim erforderlich ist, wird ein Schnittabstand von 250 Mikrometern verwendet. Übertragen Sie dann einen Unterkiefer auf die Befestigungsscheibe aus Kunststoff und ordnen Sie ihn so an, dass sich die sich entwickelnde Zunge in frontaler Querausrichtung befindet. Wenn Sie Backenzähne präparieren, um Schneidezähne zu isolieren, nehmen Sie sagittale Schnitte durch den Unterkiefer.

Sobald es richtig ausgerichtet ist, entfernen Sie das überschüssige Medium aus der Umgebung des Gewebes. Bei Verwendung von Filterpapier wird ein Unterkiefer leicht eingetrieben, mit dem er auf der Montagescheibe befestigt ist. Unmittelbar nach dem Trocknen mit dem Filterpapier legen Sie die Scheibe auf den runden Edelstahltisch des Zerkleinerers.

Stellen Sie dann die Klingenkraft auf Maximum ein, schalten Sie die Maschine ein und drücken Sie Start. Der Tisch verfährt automatisch von links nach rechts, während gleichzeitig der Schneidarm, der das Messer trägt, mit bis zu 200 Hüben pro Minute angehoben und abgesenkt wird. Sobald das Taschentuch vollständig geschnitten wurde, schalten Sie die Maschine aus.

Vergewissern Sie sich, dass sich der Messerarm in der angehobenen Position befindet, und entfernen Sie dann die Scheibe. Achten Sie darauf, die Finger nicht unter den Messerarm zu legen oder die Maschine unbeaufsichtigt zu lassen. Nehmen Sie beim Zerkleinern des Gewebes die Eindeckscheibe und geben Sie sofort Medium zu den Scheiben auf der Scheibe, um ein übermäßiges Austrocknen zu verhindern.

Lösen Sie dann vorsichtig das geschnittene Gewebe mit einer Wolframnadel oder Pipette von der Unterseite der Scheibe und pipettieren Sie es in eine kleine Petrischale mit Medium. Trennen Sie anschließend die einzelnen Scheiben mit einer Nadel und wählen Sie dann unter einem Stereomikroskop die Gewebeschnitte mit dem interessierenden Bereich aus. Legen Sie ausgewählte Scheiben in Kulturschalen mit frischem, mittlerem Blatt, bereiten Sie Metallgitter für das Kultursystem vor, indem Sie Streifen mit einer Größe von vier Zentimetern x 1,5 Zentimetern aus Edelstahlblechen in Leinwandbindung schneiden.

Stanzen Sie dann mit einem handelsüblichen stationären Locher ein Loch in die Mitte und biegen Sie die Seiten so, dass das Gitter flach über die zentrale Vertiefung passt und parallel zum Boden der Schüssel liegt. Sobald die Gitter richtig geformt sind, sterilisieren Sie sie vor Gebrauch in einem Autoklaven. Bereiten Sie als Nächstes die Organkulturschalen der zentralen Vertiefung für die Kultur vor, indem Sie zwei Milliliter Autoklavenwasser in die äußere Vertiefung geben, um eine Austrocknung zu verhindern.

Positionieren Sie dann ein steriles Metallgitter in der Mitte der Schale. Schneiden Sie ein Stück transparente Polyethylenterephthalat-Membran mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometern so zu, dass es groß genug ist, um das Loch im Gitter zu verdecken. Legen Sie dann die geschnittene Membran mit einer ausgewählten Unterkieferscheibe in die Schale, wenn eine Abstammungsverfolgung gewünscht ist.

Bereiten Sie zunächst eine Glaskapillarnadel vor, indem Sie das Glas mit einem Nadelabzieher ziehen. Brechen Sie dann die Spitze der Nadel und legen Sie sie mit der Spitze nach unten in eine lipophile Farbstofflösung wie Dai Eye oder Dai O und ziehen Sie einen Teil der Farbstofflösung durch Kapillarwirkung auf. Legen Sie nach einigen Minuten die gefüllte Nadel in eine Halterung und befestigen Sie sie an einem Mundsauger.

Positionieren Sie die Spitze der Nadel so im Nährmedium, dass sie den zu markierenden Bereich berührt, wie z. B. den hier gezeigten Zahnfollikel. Verdränge dann eine kleine Menge Farbstoff auf das Gewebe. Übertragen Sie anschließend die Scheibe auf einen Fluoreszenzmikroskoptisch und überprüfen Sie, ob die Scheibe erfolgreich markiert wurde.

Heben Sie nach erfolgreicher Etikettierung die Scheibe vorsichtig auf die Membran und übertragen Sie die Membran dann mit abgeflachter Scheibe in der Mitte aus dem Medium. Platzieren Sie dann den Filter über dem kreisförmigen Loch in der Mitte des Gitters bei etwa einem Milliliter Kulturmedium in der Vertiefung, bis der Füllstand des Mediums auf Höhe der Membran liegt. Fügen Sie zu diesem Zeitpunkt alle Proteine oder niedermolekularen Inhibitoren in das Medium hinzu.

Fotografieren Sie auch die Schnitte, um die Morphologie am Tag Null mit einem Präpariermikroskop aufzuzeichnen, um die beste Fotografie zu erzielen, und betrachten Sie die Schnitte mit einer Lichtquelle von unten. Bewahren Sie das Geschirr in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius auf und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage in regelmäßigen Abständen. Machen Sie sich weiterhin ein Bild von den Kulturen, um den Fortschritt zu verfolgen.

Hier ist eine Reihe von Bildern zu sehen, die die Entwicklung des ersten molaren Zahnfollikels dokumentieren, der mit einem Farbstoff-Augenfluoreszenzfleck markiert ist. Bei der Scheibe handelt es sich um eine 250 Mikrometer dicke Frontalscheibe, die bei E 14,5 aus dem Unterkiefer einer Maus präpariert wurde. Der Zahn, der mit schwarzen Punkten umrandet ist, beginnt im Kappenstadium am Tag Null.

Am vierten Tag hat der Zahnkeim das Glockenstadium erreicht und man sieht, wie sich die Zahnfollikelzellen in einem Bogen um den sich entwickelnden äußeren Zahnschmelz ausbreiten. Epithel Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden vom Embryo bis zur endgültigen Kultur durchgeführt werden. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Entwicklung von Organen in der Kultur erfolgreich visualisieren können.