Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein experimentelles Mausmodell zu etablieren, mit dem die Auswirkungen der gleichzeitigen Infektion mit Tuberkulose und Malaria in vivo untersucht werden können. Dies wird zunächst dadurch erreicht, dass die Versuchstiere em ausgesetzt werden. Tuberkulose, die infektiöse Aerosoltröpfchen unter Verwendung eines Inhalationsexpositionssystems enthält.

Im zweiten Schritt wird die Aufnahme der gewünschten Anzahl an M-Tuberkulose durch eine KBE-Analyse des Lungengewebes verifiziert. Einen Tag nach der Aerosolinfektion, 40 Tage später, werden die Mäuse infektiösen Mücken zur natürlichen Übertragung von Plasmodium-Sporozoiten ausgesetzt, die sich während der Blutmahlzeit unter der ganzen Haut ablagern. Im letzten Schritt wird die Entwicklung des Malaria-Parasiten im Blutstadium durch die Analyse von Giemsa-Flecken und Blutausstrichen überwacht.

Letztlich lassen sich die Belastung durch Emtuberkulose in der Lunge und die Anzahl der Parasiten im Blut koinfizierter Tiere aufzählen, um den Verlauf von Tuberkulose bzw. Malaria zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Tuberkulose, der Malaria-Koinfektion, zu beantworten, wie z.B. Wie beeinflusst die Koinfektion mit dem Malariaparasiten die Pathogenese und Kontrolle der Mycobacterium tuberculosis-Infektion? Dieses Protokoll wurde entwickelt, um zu untersuchen, wie sich eine Koinfektion mit Odium buri auf die chronische Phase der Mikrobiumtuberkulose, einer immunkompetenten C 57 PL sechs Mäuse, auswirkt.

Es kann auch auf andere Mausstämme, einschließlich Knockout-Mäuse, oder auf andere Mykobakterien- oder Natriumarten angewendet werden. Beginnen Sie mit dem Erwärmen von Mycobacterium tuberculosis. Aktien mit einem bekannten KBE-Titer.

Wenn die Zellen aufgetaut sind, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um die Suspension fünfmal vorsichtig zu mischen, um die Bakterienklumpen zu verteilen und die Produktion von Aerosolen zu vermeiden. Übertragen Sie je nach gewünschter Infektionsdosis das erforderliche Volumen des Mykobakterienbestands in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sterilem PBS auf ein Endvolumen von sechs Millilitern. Anschließend werden die Versuchstiere einzeln in unterteilte Netzkörbe gelegt. Legen Sie die Körbe in die kreisförmige Aerosolkammer und schließen Sie den Deckel der Kammer.

Befestigen Sie die Venturi-Verneblereinheit an den drei Steckdosen aus Edelstahl. Aspirieren Sie die mykobakterielle Suspension in eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und tragen Sie die Spritze in einer geschlossenen Transportbox in die Aerosolkammer. Entfernen Sie nun den Vernebler-Schraubverschluss und injizieren Sie vorsichtig die Mykobakteriensuspension in das Gerät.

Achten Sie darauf, die Bildung von Aerosolen zu vermeiden. Entsorgen Sie die Spritze in einen Behälter mit 2 % Burton und verschließen Sie dann den Vernebler. Lassen Sie das Inhalationsgerät laufen, wenn der Zyklus abgeschlossen ist.

Vergewissern Sie sich, dass die Mykobakteriensuspension vollständig vernebelt wurde, bevor Sie die Aerosolkammer öffnen. Setzen Sie einen Atemschutzhelm für die Luftreinigung auf, bringen Sie die Tiere in ihre Käfige zurück, sterilisieren Sie die Verneblerkörbe und das Innere der Aerosolkammer einen Tag nach der Aerosolinfektion, platzieren Sie die ausgewiesenen euthanasierten Kontrolltiere auf saugfähigem Papier auf einem Präparierbrett in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse zwei und desinfizieren Sie die Mäuse mit 70 % Ethanol für jede Maus. Machen Sie zuerst einen kleinen Schnitt in der Mitte des Bauches und ziehen Sie dann die Haut über den Kopf des Tieres zurück.

Als nächstes öffnen Sie mit einer chirurgischen Schere den Bauch und den Brustkorb. Entfernen Sie die Brustwand, so dass die Lunge zugänglich ist, und entfernen Sie sie dann. Übertragen Sie die Lunge in ein 15-Liter-Röhrchen mit zwei Millilitern Homogenisierungspuffer und verwenden Sie dann den Kolben einer Fünf-Milliliter-Spritze, um das Gewebe durch 100-Mikrometer-Siebe in eine kleine Petrischale zu passieren.

Spülen Sie das Sieb mit einer Ein-Milliliter-Pipette, die mit einer Barrierespitze ausgestattet ist, mehrmals und verteilen Sie dann etwa 250 Mikroliter des Lungenhomogenats auf acht Agarplatten. Verwenden Sie Einweg-Spreader, um die Proben vorsichtig zu plattieren, wenn die Platten trocken sind. Versiegeln Sie jede Platte mit Perfil.

Wickeln Sie sie in Alufolie ein und inkubieren Sie sie aufrecht bei 37 Grad Celsius für mindestens vier Wochen. Um naive oder mit Mykobakterien infizierte Mäuse durch Mückenstiche mit Malaria zu infizieren, legen Sie betäubte Tiere auf das Netz der Mückenkäfige, so dass die infektiösen Mücken durch die Membran fressen können, um eine erfolgreiche Sporozoitenübertragung zu gewährleisten. Lassen Sie die Mäuse 10 bis 15 Minuten in den Käfigen.

Setzen Sie die Mäuse zurück in ihre Käfige auf ein Papiertuch und decken Sie sie mit einem Papiertuch ab, um sie warm zu halten, bis sie aus der Narkose aufwachen. Töten Sie die Mücken, indem Sie sie mit 70%igem Ethanol oder anderen Desinfektionsmitteln durch das Netz des Käfigs besprühen, und sterilisieren Sie die Käfige, indem Sie sie autoklavieren. Um den Para zu überwachen, stechen Sie mit einer Nadel in das äußerste Ende der Vene jedes infizierten Tieres und sammeln Sie einen Tropfen Blut.

Ziehe an jedem Ende eines Objektträgers mit einem anderen Objektträger einen Tropfen Blut über die Hälfte der Länge des unteren Objektträgers. Drehen Sie dann den Spreizschieber um und verwenden Sie die andere Kante für den zweiten Abstrich. Legen Sie die Objektträger in ein Färbegestell.

Die Blutausstriche kurz in absolutem Methanol fixieren und anschließend an der Luft trocknen lassen. Die Folien als nächstes, tauchen Sie die Abstriche in Gizeh ein. Tauchen Sie die Objektträger nach 10 Minuten einige Male in mit deionisiertem Wasser gefüllte Fleckenve, um den überschüssigen Fleck wegzuspülen.

Zum Schluss trocknen Sie die Objektträger in vertikaler Position an der Luft. Eine durch Sporozoiten induzierte Infektion von Versuchstieren durch Mückenstiche führt zu einer Infektionsrate von 100 %, die vier bis fünf Tage später durch das Vorhandensein von Parasiten im Blutstadium bestätigt wird. Wie in der Tabelle dargestellt, führt die Infektion sowohl von naiven als auch von m Tuberkulose-infizierten Mäusen mit Plasmodium buri durch Mückenstiche zu einer konsistenten und reproduzierbaren Infektion aller Tiere innerhalb einer Versuchsgruppe.

Durch den Vergleich der Präpatenz und der naiven Kontrollmäuse mit denen der mit Mycobacterium tuberculosis koinfizierten Tiere kann festgestellt werden, dass die Präpatenz leicht verzögert ist. Bei Mäusen, die mit Mycobacterium tuberculosis präinfiziert wurden, führt die Verwendung eines Inhalationsexpositionssystems zu einer erfolgreichen Ablagerung von Bakterien in die Lunge des Tieres mit relativ geringer Variabilität zwischen einzelnen Mäusen. Die mykobakterielle Belastung in der Lunge von infizierten C 57 black six-Mäusen ist in Gegenwart von p burga erhöht.

Im Gegensatz dazu weisen koinfizierte Mäuse im Vergleich zu einfach infizierten Mausen aus Plasmodium eine reduzierte Paraämie auf. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie Durchflusszytometrie, PCR, Eliza oder histologische Techniken an dem interessierenden Gewebe oder Körperflüssigkeiten durchgeführt werden, um die Immunantworten zu analysieren, die gleichzeitig gegen male Parasiten und Tuberkelbasi ausgelöst werden, und deren Wechselwirkungen im koinfizierten Wirt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem humanpathogenen Mikrobakterium tuberculosis äußerst gefährlich sein kann und Maßnahmen ergriffen werden sollten, um eine Exposition gegenüber infektiösen Aerosolen jederzeit zu vermeiden.

Alle experimentellen Arbeiten mit dem Mikrobakterium tuberculosis müssen in geeigneten Einrichtungen der Biosicherheitsstufe drei durchgeführt werden.