Name: Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Lernen Sie die Rettung rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA für Virologie und Impfstoffentwicklung. Diese Methode nutzt T7-Polymerase und Co-Kultivierung mit aviären Zellen zur Virusvermehrung.

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Autoren möchten Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder in den Labors von Dr. danken. Peter Palese und Adolfo García-Sastre für die Entwicklung von NDV Reverse Genetik Techniken und für die technische Unterstützung. Research in Newcastle-Disease-Virus in AG-S Labor wird teilweise finanziert durch NIAD R01AI088770 gewähren und durch das Department of Homeland Security Science &amp; Technology Center of Excellence für Schwellen-und Tierkrankheiten Zoonosen (CEEZAD, Verleihungsnummer 2010-ST-061-AG001). Forschung in der LM-S-Labor wird von den NIH RO1 Zuschüsse AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, die NIAID Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung (HHSN266200700008C), und der University of Rochester Zentrum für Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C) gefördert .

1. Herstellung von Säugerzellen (4A, Tag 1) Split HEp-2-Zellen oder A549 am Tag vor der Transfektion in 6-Well-Platten. Dichte der Zellen sollte 80-90% Konfluenz am nächsten Tag zu erreichen. Normalerweise kann eine konfluente 100-mm-Schale in 8 Vertiefungen aufgeteilt werden (ca. 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung). Für jedes Virus, gerettet zu werden, sollte 2-4 verschiedenen Vertiefungen enthalten sein, sowie 2 zusätzliche Bohrungen für die Kontrollen pCAGGS-GFP und GFP-pCITE 18, zielte darauf ab, Transfektion und MVA-T7-Infektion Effizienz zu überwachen sind. 2. Infektion von Säugerzellen mit dem rekombinanten Modified Vaccinia Ankara Virus, das Bakteriophagen T7 RNA-Polymerase (MVA-T7) (4A, Tag 2) <ol><li> Wärm dich PBS 1x/BA/PS und Medien bei 37 ° C </li><li> Zellen zu waschen, zweimal mit 1 ml PBS 1x/BA/PS. </li><li> Infizieren die kultivierten Säugerzellen, die mit dem MVA-T7-Virus mit einer Multiplizität der Infektion (moi) Von 1 pfu / Zelle in einem Gesamtvolumen von 200 ul in PBS / BA / PS für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Während der Virusinfektion Inkubationszeit, bereiten Sie die Transfektion Mischung wie in 3 beschrieben. </li></ol> 3. Transfektion von Säugerzellen (4A, Tag 2) <ol><li> Herstellung von Lipofectamine: Mix 1-2 ug LPF2000 mit 250 ul pro OptiMEM Rettungsversuch und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Herstellung von DNA: Machen Sie eine Plasmid-Cocktail für jeden Rettungs in 50 ul OptiMEM. Hinzufügen von 0,4 ug pTM1-NP, 0,2 ug pTM1-P und 0,2 ug pTM1-L pro Röhrchen. 1 &amp;mgr; g Volllängen-cDNA-Klon von NDV zu jedem Röhrchen gerettet werden. Auch bereiten zwei Kontrolltransfektionen, eines mit 2 ug pCAGGS-GFP (Transfektion Effizienz zu prüfen) und das andere mit 2 ug pCITE-GFP (um zu prüfen, T7-Polymerase angetrieben Expression durch die MVA-T7). </li><li> Nachdem die LPF2000-OptiMEM Lösung wurde für 5 min (Schritt 3.1) vorinkubiert worden, fügen Sie 250ul der Lösung mit den DNA-Rohre (Schritt 3.2) und Inkubation für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach Inkubation mit MVA-T7, entfernen Sie den Virus-Inokulum durch Aspiration und ersetzen mit der DNA-Transfektion LPF2000 Mix (Schritt 3.3). </li><li> 1 ml DMEM-10% FBS / PS zu jeder Schale. </li><li> Die infizierten / transfizierten Zellen für 6-8 Stunden (oder über Nacht) bei 37 ° C, 5% CO 2 und ersetzen Sie dann die Medien-Transfektion mit 1,5 ml frischem DMEM 10% FBS / PS. </li><li> Bei 24 Stunden nach der Transfektion können Steuerbohrungen unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um die Transfektionseffizienz (pCAGGS-GFP) und T7-Polymerase-Aktivität (pCITE-GFP) (5A) zu beurteilen. Fahren Sie mit der Co-Kultur der infizierten / transfizierten Zellen mit Vogelgrippe Fibroblasten wie unten beschrieben. </li></ol> 4. Co-Kultur von Säugerzellen mit Vogelzellen (4A, Tag 3) Üblicherweise wird eine konfluente 100 mm Gewebekulturschale von Huhn (CEF) or Ente (DEF) Embryo-Fibroblasten pro zwei transfiziert Brunnen verwendet. Achten Sie darauf vorbereiten, im Voraus, genug 100 mm Gewebekulturschalen der aviären Zellen pro aller Rettungsversuche. Für eine effiziente Rettung des Virus wird DMEM 10% FBS / PS-Medien mit 5% Allantoisflüssigkeit und 30 mM MgCl 2 ergänzt. An dieser Stelle, 24 Stunden pi, Säugetierzellen kann beginnen, welche zytopathischen Effekt (CPE) durch MVA-T7-Infektion, asevident in 5A. <ol><li> Wärm dich 1x PBS und Medien bis 37 ° C </li><li> Säugetierzellen zu waschen, 2x mit 1 ml PBS 1x. </li><li> Trypsinize Säugerzellen mit 0,2 ml Trypsin-EDTA, bis sie gelöst wird. Resuspendieren der Zellen in 1 ml DMEM-10% FBS / PS, 5% Allantoisflüssigkeit, 30 mM MgCl 2 und in einen 100-mm-Gewebekulturschale. 3 ml gleichen Medien. </li><li> Vogelzellen waschen, zweimal, mit 4 ml PBS 1x. </li><li> Trypsinize aviären Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA und Inkubation für 1-2 min bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen. Resuspendieren the Zellen Zugabe von 8 ml DMEM-10% FBS / PS, 5% Allantoisflüssigkeit, 30 mM MgCl 2 und 4 ml der Zellen mit Trypsin behandelt, um die Säugetierzellen in der co-kultivierten 100-mm-Gewebekulturschale mit einem Volumen von 8 ml (4 ml von Säugetieren, 4 ml Vogelzellen). </li><li> Schütteln Sie von Hand die co-kultivierten Zellen in der 100-mm-Schale, um eine gleichmäßige Verteilung zu haben und dann legen Sie sie in den Brutschrank bei 37 ° C für 3-4 Tage. Die Kriterien für die Infektion von Eiern 3 oder 4 Tage nach der Co-Kultivierung von Säugetier-und Vogelzellen abhängt, wie viel zytopathischen Effekt (Zellabrundung, Tod, Ablösen von der Oberfläche, usw..) In dem MVA-T7 Virusinfektion beobachtet. </li></ol> 5. Die Infektion von Hühner befruchteten Eiern (Abbildung 4A, Tag 6-7) <ol><li> Nach 3-4 Tagen der Co-Kultur von Säugetier-und Vogelzellen, entfernen, 1 ml des Zellkulturüberstands entnommen und in ein Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Gewebekulturüberstand für 1 min bei 12.000 rpm in einer TischZentrifuge, um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Candle die Eier mit einem Licht-Durchleuchtungsfeld, um die Schnittstelle zwischen dem Luftsack und die Allantoishöhle sehen. Machen Sie eine Markierung auf die Schnittstelle Grenze Vermeidung Blutgefäß-Lokalisierung. Spray 70% Ethanol über die Eier, um sterile Bedingungen zu schaffen. Ein Loch in der Eierschale leicht machen auf die markierte Stelle und impfen 500 ul des Überstandes mit einer Insulin (1 ml) Spritze, mit dem Ziel die Nadel vertikal und direkt in die Allantoishöhle. (Abbildung 4B). </li><li> Verschließen Sie den nick in der Eierschale mit geschmolzenem Wachs oder Paraffin. </li><li> Die Eier inkubieren 2-3 Tage bei 37 ° C. </li></ol> 6. Ernte der Allantoisflüssigkeit von infizierten Huhn befruchteten Eiern (Abbildung 4A, Tage 8-10) <ol><li> Inkubieren Sie die infizierte Eier für 2-4 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C, um die Hühnerembryo zu töten und das Blut gerinnen. </li><li> Sprühen Sie die Eier mit 70% Ethanol (um sterile Bedingungen zu erhalten). </li><li> Vorsichtig tippen Sie auf den apikalen Abschnitt des Eies, über die Lufthöhle, mit einem Löffel. Sobald die Eierschale geknackt wird, entfernen Sie die Bruchstücke mit einer Pinzette und voll setzen die Allantois-Membran. </li><li> Setzen Sie die Allantoishöhle durch Ausschneiden des Allantois-Membran mit einer Pinzette und Schere, Vermeidung von Schäden an den Blutgefäßen und das Eigelb. </li><li> Vorsichtig nach unten drücken, den Embryo mit einem Spatel und sammeln Sie die oben strömenden Allantoisflüssigkeit (8-12 ml pro Ei) mit einer 10 ml Pipette. Vermeiden Sie Beschädigungen des Dottermembran. Übertragung der Allantoisflüssigkeit, um ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis (Verwendung einer Röhre pro Ei). </li><li> Klärung der Allantoisflüssigkeit durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 UpM. Den Überstand in ein frisches Röhrchen, ohne das Pellet zu stören. </li><li> Proben bei 4 ° C für bis zu 1 Woche, bis sie für die Überprüfung der Anwesenheit von NDV Hämagglutinations-Assay. </li></ol> 7. Hämagglutination (HA)-Assay Das Vorhandensein des Virus in der allantoic Flüssigkeit aus infizierten Eiern makroskopisch durch ihre Fähigkeit, Truthahn roten Blutzellen (RBC) Hämagglutination bestimmt werden. Im Fall von NDV, sind etwa 10 6 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml erforderlich, um ein positives Signal in der HA-Assay zu ergeben. HA-Assays sind in V-Boden-96-Well-Platten durchgeführt. Negative (PBS 1x, nicht infizierten Allantoisflüssigkeit) als auch positive (Allantoisflüssigkeit von jedem NDV-Virus) Kontrollproben sollten immer in einer HA-Test zur Bestätigung enthalten sein. Um ein HA-Test durchzuführen: <ol><li> Je 50 ul PBS 1x pro Vertiefung in einer V-Boden 96-Well-Platte. </li><li> Je 50 ul der Allantoisflüssigkeit Proben in die Vertiefungen in der ersten Spalte der Platte. Führen Sie 2-fach serielle Verdünnungen durch den Rest der Platte und entsorgen Sie die letzten, extra 50 ul aus Brunnen in der letzten Spalte. </li><li> Geben Sie 50 ul 0,5% Puten RBC in PBS 1x pro Vertiefung. Schütteln Sie die Platte durch Antippen. </li><li> Die Platte bei 4 ° C (oder Eis) foder 30-45 min oder bis eine klare Pellet wird in den Negativkontrollen gebildet. </li></ol>

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</ol>

Adolfo García-Sastre ist ein Erfinder von Patenten auf rekombinanten Viren der Newcastle-Krankheit, die von der Icahn School of Medicine am Berg Sinai gehören.

Mehrere Faktoren sind zu berücksichtigen, um gute Ergebnisse zu erzielen, während die Rettung NDV werden. Zuerst wird die Volllängen-cDNA-Konstrukt verwendet werden muss, ausgelegt werden, um die funktionelle Einbindung der neuen Transgene / Änderungen in dem NDV-Genom zu ermöglichen. Dies bedeutet, wie oben angegeben, dass (i) entsprechende Gen Ende (GE), intergenen (IG) und Gen-Start (GS)-Sequenzen hinzugefügt werden, falls erforderlich, (ii) es gibt keine mutmaßlichen GE oder GS-Sequenzen in das Fremd Gen, und (iii) ...

Newcastle Disease Virus (NDV), ein Vogel-Paramyxovirus zu der Gattung Avulavirus 1 gehört, ist eine wirtschaftlich relevante und damit weit erforscht und überwachten Zoonoseerreger, die schwerwiegende Auswirkungen auf die Geflügelzucht in der ganzen Welt. Obwohl nicht ein menschlicher Krankheitserreger, NDV wurde auch gründlich über den Tierarzt Feld sowohl als Modell Paramyxovirus und aufgrund seiner höchst interessanten, Natur onkolytischen Eigenschaften 6 untersucht. Forschung auf NDV stark von der Entwicklung der Techniken reverser Genetik für einzelsträngige, nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren, zunächst für Tollwutvirus von Conzelmann und coleagues 2 beschrieben profitiert. Eine Vielzahl von gentechnisch veränderten NDVs, Trage fremde Gene oder Änderungen ihrer Wildtyp-Genoms wurden weitgehend seit sucht. Die Arbeit mit diesen rekombinanten Viren war entscheidend für verschiedene Virulenzfaktoren nicht nur von NDV, sondern auch von anderen relevanten huma charakterisierenn Krankheitserreger wie Influenza-A-Virus 7 - oder 8 emergent Nipah-Virus. Weiterhin wurden eine Reihe von verschiedenen Studien die Verwendung dieser Techniken, um die Antitumoraktivität von angeborenen NDV 6,9,10 verbessern, vor allem durch die Verstärkung der immunstimulierenden Eigenschaften des Virus untersucht. Andere relevante Bereich der Forschung auf rekombinante NDVs war die Erzeugung von Impfstoffkandidaten gegen andere Viruserkrankungen, wie Influenza 5,11,12, 13 HIV, Masern 14, SARS 15 oder die durch die Atem sincytial Virus (RSV) 16 verursacht wird. Unter den verschiedenen bemerkenswerten Vorteile, die durch NDV bereitgestellt sind der Mangel an bereits existierenden Immunität in menschlichen Populationen, die Stabilität der fremden genetischen Einsätze, einen rekombinatorischen Mangel an Aktivität und einer hohen Gesamtwirkungsprofil in Kombination mit den zuvor genannten natürlichen immunstimulierenden Eigenschaften 17. Es ist auch bemerkenswert, die mögliche Verwendung von rekombinanten Impfstoffen in bivalenten poultry, Schutz sowohl gegen NDV und hochpathogene aviäre Influenzaviren 11,12. Dies kann eine hervorragende Möglichkeit, um die Chancen des letzteren Verbreitung von wild bis domestizierte Tiere, also auch helfen, eine mögliche interspezifische Sprung der gefürchteten Vogelgrippe auf den Menschen zu verhindern, zu verringern. Schließlich Reportergen exprimierenden NDV Zur Beurteilung der angeborenen Immunantwort sowie der Identifizierung von Interferon-Antagonist durch mehrere Viren codiert 18-27 verwendet. Das Rettungsverfahren eines rekombinanten, nicht-segmentierten, besteht Negativstrang-RNA-Virus im wesentlichen zu erzwingen künstlich einen viralen Replikationszyklus in einer erzeugenden Zelle durch Transfektion von cDNA, die die minimale infektiöse molekulare Maschinerie, wie Ribonukleoprotein oder RNP bekannt (Fig. 2) codiert. Die RNPs aus der viralen Polymerase (P-und L-Proteine), das Nucleoprotein (NP) und das Volllängen-antigenomischen RNA des Virus. Diese RNA + Anti ist thzur Erzeugung der komplementären RNA-Genomen, die auch mit dem Rest der Proteine ​​der viralen RNP erforderliche zugehörigen E-Vorlage, rekapituliert die gleiche Infektionskomplex eine natürliche Virus würde auf das Zytoplasma der Zelle nach der Infektion (Fig. 2A frei ). Von diesem Schritt ab, kann das virale Zyklus selbst fort und rekombinanten Virionen enkapsidieren die modifizierten Genom, erzeugt (Fig. 2B). Bemerkenswert ist, Transfektion der genomischen cDNA anstelle der cDNA antigenomische stark beeinträchtigt oder ganz abschafft Rettungs Effizienz 2,28-30. Selbst wenn antigenomischen cDNA transfiziert ist die Effizienz der Einkapselung der rekombinanten RNA in RNPs in transfizierten Zellen vermutlich sehr gering. Dadurch Rettungs Protokolle für NDV umfassen häufig verschiedene Schritte zur Amplifikation der wenigen Viruspartikel von den ursprünglich transfizierten Zellen durch Co-Kultivierung mit ihnen permissiven Zellen und / oder das freiInfektion von bebrüteten Eiern. Vor der Rettungs kann die cDNA durch Standard Klonierungsverfahren, um die gewünschten Änderungen erzeugen manipuliert werden. Während spezifische Mutationen der verschiedenen Genprodukte und regulatorischen Sequenzen des Virus kann ohne weiteres auf diese Weise erreicht werden kann, hat viele der veröffentlichten Arbeiten mit rekombinanten NDV das Hinzufügen einer neuen Transkriptionseinheit in das NDV-Genoms erforderlich ist. Wie andere Mitglieder der Familie der Paramyxoviren, kodiert die NDV Genom acht verschiedene Proteine ​​in sechs Transkriptionseinheiten, die differentiell exprimiert werden je nach ihrer Lage in Bezug auf das 3&#39;-Ende in einer abnehmenden Gradienten kritisch für den viralen Lebenszyklus ein. Aus diesem Grund muss die Lage des neuen Transkriptionseinheit, innerhalb des Genoms sorgfältig ausgewählt werden, um ein Gleichgewicht zwischen der Expression des Transgens und die Beeinträchtigung der viralen Replikation zu erreichen. Einsetzen zwischen P-und M-Gene verwendet wurde den meisten, though anderen Websites wurden ebenfalls getestet 13,31. Was auch immer der Einsatz, die Klonierung in NDV cDNA muss einige Regeln zu befolgen, um eine rescuable Konstrukt zu generieren: (i) ein neues Gen in das Genom NDV aufgenommen werden muss unter der Kontrolle der entsprechenden Signale für die virale RNA-abhängigen RNA-sein Polymerase. Diese Sequenzen sind stromaufwärts des neuen offenen Leserahmen (ORF) zugegeben werden, so kann die Polymerase das Ende der vorherigen Gen (GE) und dem Beginn des neuen Transgen (GS) zu erkennen, um ein einziges Nukleotid intergenischen Sequenz (IG) beabstandet . Zugabe eines gültigen Kozak (K)-Sequenz an eukaryontische Ribosomen Übersetzung zu verbessern, wird auch eine bessere Fremdproteinexpression 32 empfohlen, (ii) eine effiziente Replikation von NDV, wie für die meisten Mitglieder der Familie Paramyxoviridae, ist abhängig von der Genomlänge, die ein mehr von sechs 33, daher das Einstecken in die NDV hat, um dieses &quot;rule of six&quot; zu folgen. Wenn nötig, required zusätzliche Nukleotide stromabwärts des ORF neue hinzugefügt werden, und (iii) die Sequenz des Transgens überprüft werden, um zu finden möglich GE und GS wie Rettungssequenzen, die Effizienz, die Transgen-Expression und / oder die Lebensfähigkeit des Virus beeinträchtigt. Falls vorhanden, müssen diese Sequenzen durch stille Mutagenese entfernt werden. Die Erzeugung von rekombinanten cDNA voller Länge folgenden genannten Regeln ist der erste Schritt, um effizient zu produzieren, eine genetisch modifizierte NDV wie hier beschrieben. In dem System sind alle DNA-Konstrukte unter der Kontrolle des T7-RNA-Polymerase-Promotor (Fig. 3). Das Zytoplasma-Polymerase in trans durch Koinfektion mit einem rekombinanten Vaccinia Ankara Virus verändert (MVA-T7) 34 vorgesehen. 3A zeigen die pNDV-B1 Plasmid, das in voller Länge cDNA antigenomische 5 kodiert. 3B zeigt pTM1 Plasmide NP kodiert, P und L ORFs. Plasmide pCITE-GFP, die codiert, under der T7-Promotor, dem Green Fluorescent Protein (GFP) und GFP pCAGGS 18, die die gleiche ORF unter dem Huhn beta-Aktin-Promotor 35 kodiert werden als Kontrollen verwendet. In diesem Protokoll zeigen wir das Verfahren zur rekombinanten NDV aus der cDNA der lentogenen NDV-Stamm Hitchner B1 5 (Abbildung 4) zu retten.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>CORNING Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Jeder Lieferant</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>35% Rinderalbumin (BA)</td><td>Sigma</td><td>232-936-2</td><td>Jeder Lieferant</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>CORNING Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>Jeder Lieferant</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td><td>CORNING Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>Beliebiger Lieferant</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Beliebiger Lieferant</td></tr><tr><td colspan="4"> Zelllinien A549-Zellen (Katalognummer CRL-185), HEp-2-Zellen (Katalognummer CRL-185), Hühnerembryo-Fibroblasten (Katalognummer CRL-12203) und Entenembryo-Fibroblasten (Katalognummer CCL-141) sind erhältlich in der American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Alle Zelllinien werden in einem 37 > C-Inkubator mit 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS, 1 % PS. Embryonated chicken eggs Embryonierte Hühnereier können von Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) und werden bei 37 °C gehalten. Die Lebensfähigkeit der Embryonen wird mit einem Egg Candler beurteilt. Eier sind infiziert, wenn sie 8-10 Tage alt werden. Sowohl die Infektion als auch die Entnahme der Allantoisflüssigkeit finden unter sterilen Bedingungen statt. Alle Eizellen werden autoklaviert und gemäß den Standard-Biosicherheitsprotokollen des Labors entsorgt. Turkey rote Blutkörperchen (RBC) Turkey RBC kann bei Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA) gekauft und bei 4 &/�C gelagert werden. Zur Vorbereitung von RBC für den HA-Assay waschen Sie 5 ml des handelsüblichen Stoffes mit 45 ml PBS 1x in einem konischen 50-ml-Röhrchen. 5 min bei 1.000 U/min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen. Verdünnen Sie pelletierte RBC 1:1.000 in PBS 1x für eine Endkonzentration von 0,5-1,0 %. Gewaschene Erythrozyten können bei 4 & Grad gelagert werden; C für mehrere Tage. Plasmides Plasmidpräparate werden mit jedem handelsüblichen Maxiprep-Kit gemäß Hersteller&#039; s Anweisungen, verdünnt in ddH20 auf eine Endkonzentration von 1 μmu; g/&mu; l und bei -20 °C gelagert. Die DNA-Konzentration und -Reinheit werden durch Spektrophotometrie bei 260 und 280 nm bestimmt. Präparate mit einem Verhältnis von 260/280 über 1,8 gelten als akzeptabel für die Rettung. Die Qualität der Plasmid-DNA wird auch routinemäßig durch die Agarose-Gelchromatographie überprüft. Viruses Das beschriebene Protokoll zur Rettung des lentogenen NDV-Stammes Hitchner B1 kann unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe (BSL) 2 durchgeführt werden. Die modifizierte Vaccinia Ankara, die die T7-RNA-Polymerase (MVA-T7) exprimiert, wurde beschrieben34 und von Dr. Bernard Moss erhalten. Dieses Virus wächst in konfluenten Monoschichten von Hühnerembryo-Fibroblasten und titriert in Säugetierzellen (A549 oder HEp-2). NDV-Bestände werden in embryonierten Hühnereiern gezüchtet und von der IFA unter Verwendung von polyklonalem Serum titriert, das gegen gereinigte Virionen aufgezogen wird. Alle kontaminierten Materialien sollten sicher sterilisiert und gemäß den Standardverfahren für biologische Sicherheit entsorgt werden. Gewebekulturmedien und -lösungen: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#039; s modifizierter Eagle&#039; s Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml DMEM, 50 ml hitzeinaktiviertes FBS, 5 ml 100x kommerzielle P/S-Lösung. Lagerung bei 4 μC. 10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. ddH2O bis zu 1 l zugeben. pH-Wert auf 7,3 einstellen. Im Autoklaven sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern. 1x PBS: 10x PBS 1:10 mit ddH2O verdünnen. Im Autoklaven sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern. 100x Ca/Mg : 1,327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O und dH2O bis zu 100 ml zugeben. Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. 1x PBS/BA/PS: 50 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoklav und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin, 3 ml 35% Rind und 5 ml 100x Ca/Mg. Bei 4 μC. </td></tr></tbody></table>

rettung von rekombinanten newcastle disease virus aus cdna

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle-Disease-Virus (NDV), dem Prototyp Mitglied der Avulavirus Gattung der Familie Paramyxoviridae 1, ist ein nicht-segmentierten Negativ-Sense-Einzelstrang, umhülltes RNA-Virus (Abbildung 1) mit potentiellen Anwendungen als Vektor zur Impfung und Behandlung von menschlichen Krankheiten. In eingehende Erforschung dieser Anwendungen hat erst nach der Gründung der reversen Genetik Techniken, um rekombinante Viren aus Plasmiden ihre vollständige Genome als cDNA 2-5 kodiert möglich zu retten. Virale cDNA bequem in vitro unter Verwendung von Standard-Klonierungsverfahren, um den Genotyp des Virus zu verändern und / oder neue Transkriptionseinheiten modifiziert werden. Rettung von genetisch modifizierten Viren stellt ein wertvolles Werkzeug, um Faktoren, die mehrere Stadien der Infektion, sowie ermöglicht die Entwicklung und Verbesserung von Vektoren für die Expression von Antigenen und Liefer verstehenImpfung und Therapie. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Rettung von rekombinanten NDVs.

Rettung von NDV ist ein gut etabliertes Verfahren, die routinemäßig in den Laboratorien, die den Zugriff auf die vollständige cDNA des Virus durchgeführt. Die intrinsische stochastischen Natur des Verfahrens macht es jedoch schwierig, 100% Rettungseffizienz. Die Überwachung der frühen Schritte des Prozesses, speziell die Transfektionseffizienz und die Infektion mit MVA-T7, hilft, mögliche Probleme. 5A zeigt Standard-Transfektion und Transfektion / Infektion Wirkungsgrade, die genug für einen erfolgreich...

Newcastle Disease Virus (NDV) wurde ausgiebig in den letzten Jahren, um neue Vektoren für Impfung und Therapie zu entwickeln, unter anderem untersucht. Diese Studien wurden durch Techniken, um rekombinante Virus aus cDNA zu retten, wie die, die wir hier beschreiben, möglich.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, rekombinante Newcastle-Disease-Viren (NDV) aus klonierter DNA zu retten. Dies wird erreicht, indem Säugetierzellen zuerst mit einem Helfervirus infiziert werden, das für die T-7-Polymerase kodiert, und dann diese Zellen mit Plasmiden durchtrennt werden, wobei die minimale Replikationsmaschinerie des Virus unter Kontrolle des T-7-Promotors kodiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die transfizierten Säugetierzellen mit Vogelzellen zu kultivieren, die von den natürlichen Wirten des Virus stammen.Die neu gebildeten Variane, die aus den Säugetierzellen freigesetzt werden, infizieren die Vogelzellen für eine erste Amplifikationsrunde. Als nächstes wird der Überstand der Co-Kultur in embryonierte Hühnereier für das weitere Wachstum des geretteten Virus geimpft, der letzte Schritt besteht darin, die LAN-toic-Flüssigkeit aus den inokulierten Eiern zu sammeln. Letztendlich wird ein einfacher Hämagglutinin-Nation-Assay verwendet, um das Vorhandensein von NDV in der LAN-Flüssigkeit und den Erfolg des Rettungsprozesses zu zeigen.Rekombinante Viren, die mit dieser Methode gerettet werden, können Einblicke in verschiedene Faktoren geben, die die Infektion beeinflussen, und können auch als Vektoren für die Verabreichung von Antigenen für die Impfung und antitumorale Therapie verwendet werden. Um mit der Teilung von zwei oder 5 49 Zellen am Tag vor der Transfektion in sechs Well-Platten zu beginnen, sollte die Dichte der Zellen am nächsten Tag eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Für jedes zu rettende Virus sollten zwei bis vier verschiedene Vertiefungen vorgesehen sein.Dazu gehören auch zwei zusätzliche Vertiefungen für die Kontrollen PCAs, GFP und Pite, GFP zur Überwachung der Transfektion und MVAT mit sieben Infektionseffizienzen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter erwärmtem PBS und infizieren Sie dann die kultivierten Säugetierzellen mit dem MVA T 7-Virus bei einer Infektionsmehrheit von einer PFU pro Zelle. Lassen Sie die Zellen in einem Endvolumen von 200 Mikrolitern PBS während der Inkubation der Virusinfektion eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren, bereiten Sie die Transfektionsmischung wie im schriftlichen Text beschrieben vor, nachdem die optimale Lösung für die Lipektomie hergestellt und fünf Minuten lang vorinkubiert wurde.250 Mikroliter der Lösung in die DNA-Röhrchen geben und nach der Inkubation mit MVAT 7 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, das Virusinokulum durch Aspiration entfernen und durch die DNA-Lipo-Transfektionsmischung ersetzen. Geben Sie einen Milliliter DMEM 10%FBS in jede Schale. Inkubieren Sie die infizierten transfizierten Zellen sechs bis acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid.Ersetzen Sie dann das Transfektionsmedium durch 1,5 Milliliter frisches DMEM 10 %FBS. 24 Stunden nach der Transfektion können Kontrollwells unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden, um die Transfektionseffizienz und die T-7-Polymeraseaktivität zu beurteilen, bevor mit der Co-Kultur der infizierten transfizierten Säugetierzellen mit aviären Fibroblasten fortgefahren wird. In der Regel wird eine konfluente 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit Hühner- oder Entenembryo-Fibroblasten pro zwei transfizierten Vertiefungen verwendet. Bereiten Sie sich rechtzeitig genug vor.100 Millimeter Gewebekulturschalen von Vogelzellen pro Rettungsversuch für eine effiziente Rettung des Virus. DMEM 10%FBS Medium wird mit 5%elan toic Flüssigkeit und 30 millimolar Magnesiumchlorid ergänzt. Nach dem zweimaligen Waschen der Säugetierzellen mit erwärmtem XPBS-Trypsin werden die Zellen mit 0,2 Millilitern EDTA-Trypsin beäugt, bis sie sich ablösen.Die Zellen werden in einem Milliliter des supplementierten DMEM resuspendiert und in eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit drei Millilitern desselben Mediums überführt. Nach zweimaligem Waschen der Vogelzellen mit erwärmtem XPBS-Trypsin werden die Zellen mit einem Milliliter EDTA-Trypsin besichtigt und ein bis zwei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis sich die Zellen ablösen. Die Vogelzellen werden durch Zugabe von acht Millilitern des vorbereiteten Mediums wieder suspendiert.Geben Sie dann vier Milliliter der tryps-inisierten Vogelzellen zu den Säugetierzellen in die 100-Millimeter-Gewebekulturschale in Co-Kultur, für ein Gesamtvolumen von acht Millilitern. Schütteln Sie die mitkultivierten Zellen in der 100-Millimeter-Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und legen Sie sie dann für drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Eizellen sind infiziert, wenn alle kokultivierten Zellen von der zytopathischen Wirkung aufgrund der MVAT-7-Virusinfektion betroffen sind.Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt einen Milliliter des Überstands der Gewebekultur und geben Sie ihn in eine Zentrifuge des DPH-Röhrchens. Der Gewebekulturüberstand wird eine Minute lang bei 12.000 U/min in einer Tischzentrifuge überstanden. Um Zelltrümmer zu entfernen, kerzen Sie die Eier mit einer leichten Durchleuchtungsbox, um die Grenzfläche zwischen dem Luftsack und dem Alan-Toic-Hohlraum zu sehen.Markieren Sie die Grenzfläche, um die Lokalisierung der Blutgefäße zu vermeiden. Sprühen Sie 70% Ethanol über die Eier, um sterile Bedingungen zu schaffen. An der markierten Stelle vorsichtig ein Loch in die Eierschale stechen.Impfen Sie dann 500 Mikroliter der Schlinge mit einer Ein-Milliliter-Spritze und zielen Sie mit der Nadel senkrecht und direkt in die Alan-Toic-Kavität. Versiegeln Sie den Kerb in der Eierschale mit geschmolzenem Wachs oder Paraffin. Inkubieren Sie die Eier zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius.Inkubieren Sie die infizierten Eier für zwei bis vier Stunden oder über Nacht bei vier Grad Celsius, um den Hühnerembryo abzutöten und das Blut gerinnen zu lassen. Besprühen Sie die Eier mit 70%igem Ethanol, um sterile Bedingungen zu erhalten. Den apikalen Teil des Eies vorsichtig mit einem Löffel über den Lufthohlraum klopfen.Sobald die Eierschale geknackt ist, entfernen Sie die Fragmente mit einer Pinzette und legen Sie die LAN-Membran vollständig frei. Legen Sie die LAN-Toic-Kavität frei, indem Sie die HNO-Membran mit Pinzette und Schere herausschneiden, um eine Beschädigung der Blutgefäße und der Eiche zu vermeiden. Drücken Sie den Embryo vorsichtig mit einem Spatel nach unten und fangen Sie die aufströmende LAN-Flüssigkeit mit einer 10-Milliliter-Pipette auf.Vermeiden Sie eine Beschädigung der Dottermembran. Übertragen Sie die LAN-Flüssigkeit in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Klären Sie die LAN-toic-Flüssigkeit, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugieren.Den Überstand in ein frisches Rohr umfüllen, ohne das Pellet zu stören. Lagern Sie die Proben bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius, bis sie mit dem Hämagglutinin Nation-Assay auf das Vorhandensein von NDV überprüft werden. Das Vorhandensein von Viren in der Alan-Toic-Flüssigkeit aus infizierten Eiern kann makroskopisch bestimmt werden, indem sie in der Lage sind, acht rote Blutkörperchen aus der Türkei zu hämagglutinieren, negative Kontrollproben wie eine XPBS- oder nicht infizierte Alan-Toic-Flüssigkeit sowie positive Kontrollproben wie Al-Toic-Flüssigkeit von NDV-Viren sollten immer in einen HA-Assay aufgenommen werden, um sie zu validieren.Um den HA-Assay durchzuführen, pipettieren Sie 50 Mikroliter eines XPBS pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte mit V-Boden und pipettieren Sie dann 50 Mikroliter der LAN-Toic-Flüssigkeitsproben in die Vertiefungen auf der ersten Säule der Platte. Führen Sie eine zweifache serielle Verdünnung durch den Rest der Platte durch und entsorgen Sie die letzten zusätzlichen 50 Mikroliter aus den Vertiefungen. Geben Sie in der letzten Säule 50 Mikroliter 0,5 % rote Blutkörperchen aus der Türkei in eine XPBS pro Vertiefung, schütteln Sie die Platte vorsichtig, indem Sie die Platte 30 bis 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren oder bis sich in den negativen Kontrollvertiefungen ein klares Pellet bildet.Frühe Schritte im NDV-Rettungsverfahren können überwacht werden, insbesondere die Transfektionseffizienz und die Infektion mit MVAT sieben, hier gezeigt. Ein repräsentatives Fluoreszenz- und Hellfeldbild von 5 49 Zellen, die mit PAGs GFP transfiziert oder mit MVAT sieben infiziert und mit P 8 GFP konstitutiv transfiziert wurden. Die durch PCAs gesteuerte GFP-Expression ist ein Indikator für die Transfektionseffizienz, während die durch T-7-Promotoren gesteuerte GFP-Expression durch die P-Stelle eine Kontrolle für die MVAT-7-Infektion und die T-7-Polymerase-Aktivität ist.Die Bilder zeigen die Effizienz der Transfektion und der Transfektionsinfektion, die für eine erfolgreiche NDV-Rettung ausreicht. Nach den Amplifikationsrunden in Vogelsäugetier-Cokulturen und embryonierten Eiern wird das Vorhandensein des geretteten Virus durch positive Vertiefungen im HA-Assay nachgewiesen. NDV induziert Hämagglutinin durch die Verknüpfung von Erythrozyten und verhindert so deren Sedimentation im Boden der V-förmigen Vertiefung. Daher kann ein Mangel an HA-Aktivität leicht durch die Bildung eines roten runden Kügelchens aus roten Blutkörperchen, wie hier in der Negativkontrolle gezeigt, und ein negatives Ergebnis aus drei unbekannten Proben, die nach der Rettung von Rescue gewonnen wurden, unterschieden werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie rekombinante Viren der Newcastle-Krankheit mit hoher Reproduzierbarkeit vor CDNA retten können.

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Die reverse Genetik für die Rift Valley-Fieber-Virus MP-12 Impfstamm ist ein nützliches Werkzeug für die Schaffung zusätzlicher MP-12-Mutanten mit erhöhter Dämpfung und Immunogenität. Wir beschreiben das Protokoll zu erzeugen und zu charakterisieren NSs Mutanten.

Mit Reverse-Genetics der NSS Gene des Rift Valley Fever Virus MP-12-Stamm zu Vaccine Safety und Wirksamkeit zu verbessern Manipulieren

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe...

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

In den letzten 15 Jahren haben vom caninen Adenovirus Typ 2 (CAV2) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit bei der Übertragung von Zellen in vitro und in vivo bewiesen und werden häufig für Impfungen und Gentherapien eingesetzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von CAV2-Vektoren, wodurch virale Suspensionen mit hohem Titer entstehen.

Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

Die jüngste Epidemie des Zika-Virus unterstreicht, wie wichtig es ist, umgekehrte genetische Ansätze zur Entwicklung von Impfstoffen und/oder therapeutischen Strategien zu entwickeln. Hier beschreiben wir das Protokoll zur Rettung eines infektiösen rekombinanten Zika-Virus aus einem cDNA-Klon in voller Länge, der in einem bakteriellen künstlichen Chromosom unter der Kontrolle des menschlichen Zytomegalievirus zusammengebaut wurde.

Rettung des rekombinanten Zika-Virus aus einem bakteriellen künstlichen Chromosom cDNA-Klon

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg &gt; 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Dieses Protokollpapier beschreibt die Methodik der Mikroinjektion eines RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinsen als Werkzeug zur Untersuchung der In-situ-Funktion und Expression von Proteinen während der Linsenentwicklung.

Mikroinjektion von rekombinantem RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinse

In diesem Artikel wird eine vereinfachte Methode zur Herstellung von 4 Hämagglutinationseinheiten Antigen für serologische Tests auf das Virus der Newcastle-Krankheit vorgestellt. Durch die genaue Bestimmung des Hämagglutinationstiters des Antigens, kombiniert mit einer strengeren Rücktitrationsmethode und einem genau definierten Anpassungsprozess, erhöht es die Testeffizienz, reduziert falsch positive Ergebnisse und verbessert die Krankheitsüberwachung bei Geflügel.

Optimierung der Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay der Newcastle-Disease-Virus-Serologie

Lernen Sie die Rettung rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA für Virologie und Impfstoffentwicklung. Diese Methode nutzt T7-Polymerase und Co-Kultivierung mit aviären Zellen zur Virusvermehrung.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

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