Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Konstruktion, Herstellung und Reinigung von caninen Adenoviren vom Typ 2. Dies wird erreicht, indem zunächst das interessierende Gen in ein Shuttle-Plasmid kloniert wird. Der zweite Schritt besteht darin, ein rekombinantes genomisches Plasmid durch homologe Rekombination zu erhalten.

Als nächstes das rekombinante defekte Kalb, zwei Viren, die in einer trans-komplementären Zelllinie produziert und amplifiziert wurden. Der letzte Schritt besteht darin, das resultierende rekombinante Virus für verschiedene Anwendungen in vivo und in vitro aufzureinigen und zu konzentrieren. Letztendlich wird die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um Beispiele für die Virustransduktion im Nagetiergehirn zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. Vektoren, die aus der menschlichen Ad-Neurose abgeleitet wurden, besteht darin, dass es in menschlichen Populationen keine bereits bestehende Immunität gegen Kalb zwei gibt. Diese Methode kann also helfen, wichtige Fragen im Bereich der Impfung oder Gentherapie zu beantworten, wie z. B. die Beurteilung der Rolle von Proteinen, die in bestimmten Hirnbereichen exprimiert werden. Dieses Verfahren wird also von May KY und Corin Bergeron demonstriert.

Zwei Postdoktoranden aus unseren Labors Bereiten Sie sich einen Tag vor der Transfektion auf dieses Verfahren vor, indem Sie DKE-1-Zellen auf einer Sechs-Well-Platte säen, züchten Sie Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in DMEM mit hohem Glukosegehalt, der 7 % Hitze enthält, inaktiviertem fötalem Kalb, Serumnatrium, Pyruvat, Penicillin und Streptomycin. Am folgenden Tag sollten die Zellen zu 70 bis 80 % konfluent für die Transfektion sein, verdauen Sie zwei Mikrogramm pcal GOI die rekombinante Cav zwei genomische Plasmide mit ASC eins, um die nicht-virale Sequenz des Plasmids freizusetzen, überprüfen Sie das resultierende Restriktionsmuster um 0,8 %. Der Verdau der Agro-Gel-Elektrophorese sollte ein etwa 31 Kilobasenpaar-Fragment ergeben, das das rekombinante Genom enthält, und ein Zwei-Kilobasen-Paar-Fragment, das dem Plasmidrückgrat entspricht. Mischen Sie die verdaute DNA mit 200 Mikrolitern Jet-Prime-Puffer und wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang ein.

Fügen Sie vier Mikroliter Jet Prime hinzu und mischen Sie, indem Sie es 10 Sekunden lang vortexen. Kurz drehen, um die Tröpfchen zu entfernen, und 10 Minuten inkubieren. Bei Raumtemperatur die Transfektionsmischung tropfenweise auf die DKE one Zellen geben.

Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius. Eine Woche nach der Transfektion werden Zellen und Kulturmedium in einem 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen gesammelt. Unterbrechen Sie die Zellen durch drei eingefrorene Gedankenzyklen.

Reinigen Sie das Lysat durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 1.800 mal G. Sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei minus 20 für die nachfolgende Virusvermehrung, um das Virus zu vermehren, infizieren Sie eine 80 bis 90 % konfluente Monoschicht von DKE-1-Zellen, die in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 0,5 Millilitern des Virus gezüchtet wurden, die Überstand enthalten. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubieren. Nach einer Stunde. Entfernen Sie das Inokulum und ersetzen Sie es durch 1,5 Milliliter vollständiges DMEM, das 5 % Hitzeinaktivierte FCS-Zellen enthält, inkubieren Sie sie drei bis vier Tage lang bei 37 Grad Celsius.

Die Zellen sollten täglich auf das Auftreten einer zytopathischen Wirkung oder CPE überwacht werden. Wenn kein eindeutiges CPE sichtbar ist. Ernten Sie Zellen nach vier Tagen Kultur und wiederholen Sie die virale Amplifikation, wenn ein klares CPE die Mehrheit der Zellen betrifft.

In der Regel werden nach zwei bis vier Virusamplifikationsrunden die Zellen mit Kulturmedium entnommen und dreimal eingefroren und aufgetaut, wie bereits gezeigt. Infizieren Sie 80 bis 90 % konfluent. DKE one Zellen, die in drei Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern unter Verwendung von 1,5 Millilitern Virus, das Überstand pro Schale enthält, nach drei bis vier Tagen, wenn CPE abgeschlossen ist, gezüchtet werden.

Ernten Sie Zellen aus diesen Schalen mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern, unterbrechen Sie sie durch drei Freestyle-Zyklen und reinigen Sie das Lysat durch Zentrifugation für 10 Minuten 1.800 Mal. G Überstand sammeln und bei minus 20 für großflächige Cav-Amplifikation lagern, um das Scale-up-Verfahren zu beginnen: Infizieren Sie 80 bis 90 % konfluente Monoschichten von DKE-1-Zellen, die in Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 40 bis 10 Zentimetern gezüchtet wurden. Für jede Schale werden 0,1 Milliliter virushaltiger Überstand verwendet, verdünnt in einem Milliliter vollständigem DMEM ohne FCS, inkubieren Sie die Zellen drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter leichter Bewegung. Nach drei bis vier Stunden fügen Sie fünf Milliliter vollständiges DMEM hinzu, das mit 5 % FCS ergänzt ist, und inkubieren Sie drei Tage lang.

Nach drei Tagen erntet man infizierte Zellen aus den 40 10-Zentimeter-Schalen in 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen, Pelletzellen bei 1.200 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Resus suspendiert sie in 15 Millilitern DMEM-Medium und zerstört die Zellen durch drei Gefrier-Tau-Zyklen. Entfernen Sie Zelltrümmer, indem Sie 10 Minuten lang bei 1.800 G zentrifugieren.

Der Überstand ist vor der Reinigung von Viruspartikeln zur Reinigung von Viruspartikeln bei minus 20 °C zu lagern. Bereiten Sie einen diskontinuierlichen Cäsiumchlorid-Gradienten in einem 14-Milliliter-UltraClear-Röhrchen vor. Gießen Sie zunächst zwei Milliliter der Cäsiumchloridlösung höherer Dichte in den Boden des Röhrchens.

Geben Sie dann langsam zwei Milliliter der Cäsiumchlorid-Lösung niedrigerer Dichte auf die erste Lösung. Laden Sie den Virusüberstand vorsichtig auf den Cäsiumchlorid-Gradienten. Füllen Sie das Röhrchen bis zu zwei bis drei Millimeter von der oberen Zentrifuge entfernt in einem schwingenden Rotor SW 40 für eine Stunde und 30 Minuten bei 130.000 g und 18 Grad Celsius nach der Zentrifugation mit Mineralöl.

An der Grenzfläche zwischen den beiden Cäsiumchlorid-Lösungsschichten sind zwei weiße Streifen deutlich sichtbar. Mit einer 21-Gauge-Nadel und einer Spritze wird das untere Band, das die reifen Cavs enthält, durch Seitenpunktion zwei Partikel aufgefangen. Versuchen Sie so weit wie möglich, das obere Band zu vermeiden, das leeren Viruspartikeln entspricht.

Bereiten Sie einen kontinuierlichen Cäsiumchlorid-Gradienten in einem transparenten 14-Milliliter-Röhrchen vor, indem Sie die kollektiven Viruspartikel mit einer Cäsiumchlorid-Lösung mischen. Füllen Sie das Rohr bis zu zwei bis drei Millimeter von der oberen Zentrifuge entfernt in einem schwingenden Rotor SW 40 für 18 Stunden bei 130.000 mal G und 18 Grad mit Mineralöl. Nach der Zentrifugation wird das weiße Kalb zwei mit einer Band-by-Side-Punktion mit einer Spritze entnommen, wie zuvor gezeigt.

Versuchen Sie auch hier zu vermeiden, das verbleibende obere Band zu sammeln. Dies sollte in diesem kontinuierlichen Gradienten, der die beiden Bänder besser trennt, einfacher sein. Das Gesamtvolumen der aufgefangenen Suspension sollte zwei Milliliter nicht überschreiten.

Als nächstes äquilibrieren Sie eine cidex G 25 PD 10 Säule mit 30 Millilitern PBS. Laden Sie die Virussuspension auf die Säule und verwerfen Sie den Durchfluss durch die Eluierung mit 500 Mikroliterfraktionen PBS, sammeln Sie die Fraktionen fünf bis sieben, die normalerweise die entsalzte Cav zwei Partikel enthalten. Die virushaltigen Fraktionen können leicht identifiziert werden, da sie mit Duft gesegnet sind.

Zum Schluss fügen Sie 150 Mikroliter Glycerin zu den 1,5 Millilitern der CAV 2-Suspension hinzu und lagern Sie es in Eloqua bei minus 80 Grad Celsius, um Cav zwei durch Endpunktverdünnung zu titrieren, tauen Sie ein Aliquot des gereinigten Virus auf Eis auf und führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung von 10 bis minus zwei bis 10 bis minus 12 in serumfreiem DMEM durch. Geben Sie 50 Mikroliter jeder Virusverdünnung in fünf Vertiefungen einer 96-Well-Platte, geben Sie 1,5 mal 10 zu der vierten DKE, eine Zelle in jede Vertiefung, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für fünf Tage am fünften Tag. Überwachen Sie das Auftreten von CPE nach der Infektion durch mikroskopische Beobachtung.

Infektiöse Titer werden als mediane infektiöse Dosen von Gewebekulturen unter Verwendung der statistischen Methode read and men vor der Produktion viraler Vektoren bestimmt. Ein rekombinantes CAV-Zwei-Genom mit einer Expressionskassette für das Transgen wird unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken konstruiert. Zunächst wird das interessierende Gen in einem Shuttle-Plasmid als Expressionskassette mit einem frühen Promotor des Cytomegalievirus und einem Polyadenylierungssignal kloniert, flankiert von zwei abgeleiteten genomischen CAV-Sequenzen, die die Upstream- und Downstream-Rekombinationszielsequenzen repräsentieren.

In einem zweiten Schritt wird die Expressionskassette aus dem Shuttle-Plasmid durch homologe Rekombination in das CAV-2-Genom eingefügt. Die Insertion der GOI-Expressionskassette führt zur Deletion des EA und eines Teils des E one B-Gens im rekombinanten Genom. Sobald das rekombinante genomische Plasmid erhalten wurde, werden Viruspartikel unter Verwendung von CAV zwei E eins komplementären DKE eins-Zellen hergestellt.

Ein eindeutiger zytopathischer Effekt aufgrund der großen Menge an Viruspartikeln, die in infizierten Zellen produziert werden, kann leicht durch Hellfeldmikroskopie oder durch Transgenexpression sichtbar gemacht werden. Dieses Beispiel zeigt einen A-GFP-Vektor, der den CAV-Vektor zwei exprimiert. Nach mehreren viralen Amplifikationsrunden mit frischen DKE one Zellen werden die Viruspartikel durch Ultrazentrifugation auf Cäsiumchlorid-Gradienten aufgereinigt.

Konzentrierte Viruspartikel erscheinen als zwei opaleszierende Banden innerhalb des Cäsiumgradienten. Die untere Bande entspricht der reifen rekombinanten Cav zwei, die gesammelt werden soll. Während das obere Band leere, nicht infektiöse Partikel enthält, die vermieden werden sollten.

Der resultierende rekombinante Kälber-Zwei-Vektor kann verwendet werden, um nahezu alle Zelltypen in einer Vielzahl von Spezies zu transduzieren, entweder in vitro oder in vivo. Hier ist ein Anwendungsbeispiel zu sehen, in dem GFP, das CAV zwei exprimiert, durch Stereotaxii in verschiedene Bereiche des Zentralnervensystems der Maus injiziert wurde. Da dieses Protokoll einen hohen Titer und reine, reine Virusstämme liefert, führt die Injektion von nur einem Mikroliter PBS-verdünntem GFP, das den CAV-Zwei-Vektor im Gyrus dentatus oder DG exprimiert, zu einer neuronalen Transduktion von 40 bis 50 %.

Darüber hinaus ermöglicht die Injektion von zwei Mikrolitern PBS-verdünntem GFP, der den CAV-Vektor im Striatum exprimiert, aufgrund der Fähigkeit von C zwei, retrograd transportiert zu werden, die Transduktion von fast 80% der Nigro stri AAL-Neuronen in den Subs, Nigra pars compacta Nach seinen Entwicklungen. Diese Techniken ebnen Forschern aus den Bereichen Vakzinologie oder Neurowissenschaften den Weg, um neuartige Antigene und Genfunktionen im Gehirn in vielen verschiedenen Tiermodellen zu erforschen. Vergessen Sie also nicht, dass die Arbeit mit CAF zwei abgeleiteten Vektoren äußerst gefährlich und vorsichtig sein kann, wie z. B. ordnungsgemäße Eindämmungs- und Abfallbehandlungsmaßnahmen, einschließlich persönlicher Schutzausrüstung und Arbeiten in Laminar-Flow-Hauben in BSL zwei Laboratorien, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer berücksichtigt werden.