Name: Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Konstruktion, Produktion und Aufreinigung von CAV2-Vektoren für Gentherapie und Impfung. Diese Methode ermöglicht effiziente Transduktion von Zellen in vitro und in vivo.

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch Zuschüsse von INSERM, dem CNRS, der Fondation pour la Recherche Médicale und der Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) an D.G-D; das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Kommission für Bosnien und Herzegowina; M.S. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der FRM (Programm "Equipe FRM 2009") unterstützt; C.B. wurde durch ein Postdoc-Stipendium der UE unter der Fördernummer 245266 (Orbivac) unterstützt.

1. Konstruktion eines nicht-replikativen CAV2-Genomplasmids
Hinweis: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Plasmide wurden bereits7 beschrieben und sind auf Anfrage erhältlich.
<ol>
	<li>Klonieren Sie den GOI unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme in das pShuttle-Plasmid, um pShuttle-GOI zu erzeugen (Abbildung 1A).</li>
	<li>2 μg pShuttle-GOI durch AscI/PacI verdauen. Durch den Aufschluss wird das Shuttle-GOI-Fragment (~2,9 kbp + GOI-ORF-Sequenz) aus dem Plasmidrückgrat (2,8 kbp) freigesetzt.</li>
	<li>Reinigen Sie das Shuttle-GOI-Fragment nach der Agarose-Gelelektrophorese mit NucleoSpin Gel und PCR-Clean-up-Kit.</li>
	<li>Verdauen Sie parallel dazu 1 μg pCAV2-Genomplasmid durch SwaI. Das pCAV2-Plasmid enthält eine einzigartige SwaI-Stelle, die sich in der E1-Region befindet (Abbildung 1B). Inaktivieren Sie dieses Restriktionsenzym bei 65 °C für 20 min.</li>
	<li>Transformieren Sie kompetente E. coli BJ5183-Bakterien mit 500 ng gereinigtem Shuttle-GOI-Fragment und 100 ng linearisiertem pCAV2-Plasmid für die homologe Rekombination (Figure 1B). Auf LB-Amp Platten verteilen. Die Platten mindestens 20 Stunden lang bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Durchführung der PCR-Analyse direkt an Bakterienkolonien unter Verwendung von EmeraldAmp Mastermix mit Vorwärts- (5'-CACGAGGCCCTCTCGTCGTCTTCAA-3') und Rückwärtsprimern (5'-GCGGGGTAGTTTATCAGTTAAATTGC-3') unter den folgenden Zyklusbedingungen: 10 min bei 95 °C (für einen Zyklus), 95 °C für 1 min; 58 °C für 1 min; 72 °C für 1 min/kbp (für 39 Zyklen), und schließlich 5 min bei 72 °C. Ein Produkt mit einer ORF-Sequenz von 1 kbp + GOI wird aus pCAV-GOI-positiven Klonen amplifiziert, während mit negativen Klonen kein PCR-Produkt nachgewiesen werden kann.</li>
	<li>Mindestens zwei positive Kolonien über Nacht in je 5 ml LB-amp Medium bei 37 °C in einem Shaker (220 U/min) impfen.</li>
	<li>Extrahieren Sie Plasmid-DNAs mit dem Nucleospin-Plasmidkit. Transformieren Sie kompetente E. coli DH5α-Bakterien mit einem Aliquot jeder DNA-Präparation. Bakteriensuspension auf LB-Amp Platten verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Zwei Kolonien jedes positiven Klons werden über Nacht in 3 ml LB-amp Medium bei 37 °C in einem Shaker (220 U/min) beimpft. Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit dem Nucleospin-Plasmid-Kit.</li>
	<li>Verdauen Sie die resultierende DNA und das elterliche pCAV2-Plasmid (als Kontrolle) mit NdeI. Das Einschränkungsmuster des elterlichen pCAV2 beträgt 14,8 kbit/, 9 kbit/, 7,9 kbit/s und 1,6 kbit/s. Die Expressionskassette der indischen Regierung wird in das 7,9-kbit/-Fragment eingefügt und enthält mindestens eine NdeI-Stelle, d. h. eine in der Kassette und die potenziellen Stellen in der indischen Regierung.</li>
	<li>Wählen Sie positive Konstruktionen aus und fahren Sie mit Schritt 2 mit mindestens 2 unabhängigen Klonen fort.</li>
</ol>
2. Transfektion von rekombinantem CAV2-Genomplasmid in DK-E1-Zellen
Hinweis: CAV2-abgeleitete nicht-replikative Vektoren sind gentechnisch veränderte Organismen, die als Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) eingestuft sind, während ihre Verwendung in Tiermodellen als BSL-1 eingestuft ist. Bitte verwenden Sie geeignete Maßnahmen zur Eindämmung und Abfallbehandlung, einschließlich persönlicher Schutzausrüstung, und arbeiten Sie unter BSL-2-Laminar-Flow-Hauben.
<ol>
	<li>Einen Tag vor der Transfektion säen Sie DK-E1-Zellen auf einer 6-Well-Platte. Züchten Sie Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, das 7 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS), 1 mM Natriumpyruvat und 100 U/ml Penicillin/100 μg/ml Streptomycin enthält. Die Zellen sollten für die Transfektion zu 70-80 % konfluent sein.</li>
	<li>2 μg pCAV-GOI-Plasmid werden mit AscI verdaut, um die nichtvirale Sequenz des Plasmids freizusetzen. Überprüfen Sie das resultierende Restriktionsmuster durch 0,8% Agarose-Gelelektrophorese. Der Aufschluss sollte ein ~31 kbp großes Fragment ergeben, das das rekombinante Genom enthält, und ein 2 kbp großes Fragment, das dem Plasmidrückgrat entspricht.</li>
	<li>Mischen Sie die verdaute DNA mit 200 μl Jet Prime Puffer, indem Sie es 10 Sekunden lang vortexen. Fügen Sie 4 μl Jet Prime hinzu und mischen Sie es, indem Sie es 10 Sekunden lang vortexen. Schleudern Sie es kurz, um die Tröpfchen zu entfernen, und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Geben Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Zellen. Schütteln Sie die Platten vorsichtig, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie bei 37 °C.</li>
</ol>
3. Ausbreitung von rekombinantem CAV2
<ol>
	<li>Eine Woche nach der Transfektion werden Zellen und Kulturmedium in einem 15-ml-Röhrchen aus Polypropylen gesammelt. Die Zellen werden durch drei Gefrier-Tau-Zyklen (-80 °C/37 °C) aufgebrochen und das Lysat durch Zentrifugation für 10 min bei 1.800 x g geklärt</li>.
	<li>Überstand auffangen und bei -20 °C für die spätere Virusvermehrung lagern.</li>
	<li>Infizieren Sie eine 80-90 % konfluente Monoschicht von DK-E1-Zellen, die in einer Vertiefung oder 6-Well-Platte gezüchtet wurde, mit 0,5 ml des virushaltigen Überstands. 1 Stunde lang bei 37 °C unter leichtem Rühren inkubieren. Entfernen Sie das Inokulum und ersetzen Sie es durch 1,5 ml vollständiges DMEM, das 5 % hitzeinaktiviertes FCS enthält.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen 3-4 Tage lang bei 37 °C. Die Zellen sollten täglich auf das Auftreten einer zytopathischen Wirkung überwacht werden (CPE, Abbildungen 2A-B). Wenn kein eindeutiges CPE sichtbar ist, entnehmen Sie die Zellen nach 4 Tagen Kultur und wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.4.</li>
	<li>Wenn ein klares CPE die Mehrheit der Zellen betrifft, in der Regel nach 2-4 viralen Amplifikationsrunden, sammeln Sie die Zellen mit Kulturmedium und frieren und auftauen Sie 3x wie oben beschrieben. Infizieren Sie 80-90 % konfluente DK-E1-Zellen, die in drei Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm gezüchtet wurden, wobei jeweils 0,5 ml virushaltiger Überstand verwendet werden.</li>
	<li>Nach 3-4 Tagen (wenn CPE abgeschlossen ist) entnehmen Sie Zellen aus diesen 10-cm-Schalen, unterbrechen Sie sie erneut durch drei Gefrier-Tau-Zyklen, reinigen Sie das Lysat durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 1.800 x g, sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei -20 °C für eine großflächige CAV2-Amplifikation.</li>
</ol>
4. Großflächige CAV2-Reinigung
<ol>
	<li>Infizieren Sie 80-90 % konfluente Monoschichten von DK-E1-Zellen, die in Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm gezüchtet wurden. Für jede Schale werden 0,1 ml virushaltiger Überstand verwendet, verdünnt in 1 ml vollständigem DMEM ohne FCS. Die Zellen werden bei 37 °C für 3 bis 4 Stunden unter leichtem Rühren inkubiert. Fügen Sie 5 ml vollständiges DMEM hinzu, das mit 5 % FCS ergänzt wird.</li>
	<li>3 Tage inkubieren. Ernten Sie infizierte Zellen aus den vierzig 10 cm großen Schalen in 50 ml Polypropylen-Röhrchen. Pelletzellen bei 1.200 x g für 10 min bei 4 °C und resuspendieren Sie diese in 15 ml DMEM-Medium.</li>
	<li>Brechen Sie die Zellen durch drei Gefrier-Tau-Zyklen (-80 °C/37 °C) auf. Entfernen Sie Zelltrümmer, indem Sie 10 Minuten lang bei 1.800 x g zentrifugieren und den Überstand vor der Reinigung der Viruspartikel bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie einen diskontinuierlichen CsCl-Gradienten in einem 14-ml-Ultra-Clear-Röhrchen vor. Gießen Sie zunächst 2 ml CsCl-Lösung (1,40 g/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) auf den Boden des Röhrchens. Geben Sie dann langsam 2 ml CsCl-Lösung (1,25 g/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) auf die erste Lösung.</li>
	<li>Laden Sie den Virusüberstand vorsichtig auf den CsCl-Gradienten. Füllen Sie das Rohr bis zu 2-3 mm von oben mit Mineralöl. Zentrifugieren Sie 1,5 Stunden bei 130.000 x g und 18 °C in einem schwingenden SW40-Rotor.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation sind zwei weiße Banden an der Grenzfläche zwischen den 2 CsCl-Lösungsschichten deutlich sichtbar (Abbildung 2C). Mit einer 21-G-Nadel und einer Spritze wird das untere Band, das reife CAV2-Partikel enthält, durch seitliche Punktion aufgefangen. Versuchen Sie so weit wie möglich, das obere Band, das leeren Viruspartikeln entspricht, zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie einen kontinuierlichen CsCl-Gradienten in einem transparenten 14-ml-Röhrchen vor, indem Sie die gesammelten Viruspartikel mit einer CsCl-Lösung (1,34 g/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) mischen. Füllen Sie das Rohr bis zu 2-3 mm von oben mit Mineralöl. Zentrifugieren Sie 18 Stunden bei 130.000 x g und 18 °C in einem schwingenden SW40-Rotor.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation wird das weiße CAV2-haltige Band durch Seitenpunktion mit einer Spritze wie oben beschrieben entnommen. Versuchen Sie auch hier zu vermeiden, das verbleibende obere Band zu sammeln. Dies sollte in diesem kontinuierlichen Gradienten, der die beiden Bänder besser trennt, einfacher sein. Das Gesamtvolumen der aufgefangenen Suspension sollte 2 ml nicht überschreiten.</li>
	<li>Eine Sephadex G-25 PD-10-Säule wird mit 30 ml PBS äquilibriert.</li>
	<li>Laden Sie die Virussuspension und verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>Eluieren Sie mit Fraktionen von 500 μl PBS. Sammeln Sie die Fraktionen 5-7, die normalerweise die entsalzten CAV2-Partikel enthalten. Die virushaltigen Fraktionen sind leicht zu identifizieren, da sie opaleszierend sind. 150 μl Glycerin zu den 1,5 ml CAV2-Suspension geben und in Aliquoten bei -80 °C lagern.</li>
</ol>
5. Titration von CAV2 durch Endpunktverdünnung
<ol>
	<li>Tauen Sie ein Aliquot des gereinigten Virus auf Eis auf und führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen (im Bereich von 10-2-10-12) in serumfreiem DMEM durch.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl jeder Virusverdünnung in 5 Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Geben Sie 1,5 x 104 DK-E1-Zellen in jede Vertiefung. Die Platte wird 5 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.</li>
	<li>Am Tag 5 nach der Infektion ist das Auftreten von CPE durch mikroskopische Beobachtung zu überwachen (Abbildungen 2A-B). Die infektiösen Titer werden als mediane infektiöse Dosen von Gewebekulturen (TCID50) unter Verwendung der statistischen Methode von Reed und Muenchbestimmt 13.</li>
</ol>

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<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene einfache Verfahren, adaptiert von der gut dokumentierten Ad5-Technologie, ermöglicht die effiziente Herstellung von nicht-replikativen CAV2-Vektoren mit einer typischen Klonierungskapazität von ~4,2 kbp. Aus Zeitgründen wird ein rekombinantes CAV2-Genom in der Regel in zwei Wochen erzeugt, während es weitere 5 Wochen dauert, um virale Suspensionen zu amplifizieren, zu reinigen und zu titern.
Obwohl die Herstellung der ersten Charge von CAV2-abgeleiteten Vektoren zeitaufwä...

In den letzten Jahrzehnten haben von Adenoviren (Ads) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit in der Gentherapie und Impfung sowie in der onkolytischen Virotherapie bewiesen 1. Ads sind unbehüllte ikosaedrische Viren aus der Familie der Adenoviridae, die aus Säugetieren, Vögeln, Reptilien, Amphibien und Fischen isoliert wurden. Seit ihrer Entdeckung im Jahr 1953 wurden Anzeigen als Modelle zur Untersuchung von Virus-Zell-Interaktionen und in jüngerer Zeit als vektorbasierte Genverabreichungssysteme intensiv untersucht 2. In der Tat bieten ads-basierte Vektoren viele Vorteile, wie z. B. ihr breites Wirtsspektrum und ihre gut charakterisierte Biologie, zusammen mit der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipuliert und für die Produktion in großem Maßstab amplifiziert werden können.
Um klinische Schwierigkeiten im Zusammenhang mit bereits bestehender Immunität in menschlichen Populationen gegenüber Vektoren, die von menschlichem Ads 3 abgeleitet wurden, zu überwinden, haben wir und andere begonnen, Vektoren aus nicht-menschlichem Ads 4 abzuleiten. Darüber hinaus scheinen nicht-humane adenovirale Vektoren für Massenimpfungen in der Veterinärmedizin besser geeignet zu sein als das klassisch verwendete Adenovirus Typ 5 (Ad5), da sie bei der Risikobewertung durch die nationalen Zulassungsbehörden besser den Sicherheitsanforderungen entsprechen sollten. In den späten 1990er Jahren beschrieben wir das erste rekombinante CAV2 als nicht-humane Alternative zu Vektoren, die von Ad5 5 abgeleitet wurden. Seitdem haben zahlreiche Studien das Potenzial von CAV2-Vektoren für den therapeutischen oder antigenen Gentransfer bestätigt (für Übersichtsarbeiten 6,7). Wie andere Ads-Produkte sind CAV2-abgeleitete Vektoren stabil und können bei hohen Titern hergestellt werden, was ihre Verwendung in vivo erleichtert. Sie sind auch sicher, da sie nicht integrativ sind, obwohl sie eine lang anhaltende Transgenexpression in vivo (>1 Jahr) ermöglichen 8. Bemerkenswerterweise und besser als humane Ads-Serotypen haben sich CAV2-Vektoren als hochgradig neurotrop erwiesen, mit einem sehr effizienten retrograden Transport in den Axonen 9,10. Diese intrinsische Eigenschaft brachte die Idee auf die Idee, rekombinante CAV2-Vektoren zu verwenden, um Neuronen bestimmter Hirnareale zu transduzieren, die für lentivirale Vektoren kaum zugänglich sind, die bisher häufig für den Gentransfer in das zentrale Nervensystem verwendet werden 11.
Hier beschreiben wir ein einfaches und klassisches Protokoll zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von nicht-replikativen CAV2-Vektoren, die vom Manhattan-Stamm abgeleitet sind. Rekombinante CAV2-Genome werden durch Klonierung des gewünschten Gens von Interesse (GOI) in einer Kassette stromabwärts des frühen Promotors des Cytomegalievirus (CMV) konstruiert, der eine ubiquitäre Expression bietet. CAV2-Vektoren haben eine Klonierungskapazität von ~4,2 kbp, was die Expression großer cDNA ermöglicht. In einem zweiten Schritt wird diese Expressionskassette durch homologe Rekombination anstelle der E1-Region des CAV2-Genoms eingefügt, was zu einem nicht-replikativen Virus (dlE1) führt, wie es ursprünglich von Chartier et al. beschrieben wurde. 12 Schließlich werden virale Partikel nach Transfektion des genomischen Plasmids in eine CAV2-E1-exprimierende canine Nierenzelllinie (DK-E1) produziert und vor der Konzentration und Reinigung der Virusstämme seriell amplifiziert. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine zweistufige Ultrazentrifugation in Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradienten, die eine Anreicherung von infektiösen Partikeln mit einem hohen Endtiter (in der Regel über 1010 infektiöse Partikel pro ml) ermöglicht. Die Virussuspension wird dann durch Chromatographie durch Einweg-Sephadex G-25-Säulen entsalzt, so dass sie letztendlich rein genug ist, um direkt in vivo verwendet zu werden.

<table><tbody><tr><td>Restriktionsenzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Jet Prime Transfektionskit</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BJ5183 Bakterien</td><td>Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Entsalzungssäule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>EmeraldAmp Polymerase</td><td>Takara</td><td>RR320A</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel und PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Röhrchen, Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

produktion und aufreinigung von nicht-replikativen vektoren des caninen adenovirus typ 2

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) abgeleitete Vektoren wurden häufig für kurz- oder langfristigen Gentransfer verwendet, sowohl für Gentherapie- als auch für Impfstoffanwendungen. Aufgrund der häufigen vorbestehenden Immunität gegen das klassisch verwendete humane Adenovirus Typ 5 wurde das canine Adenovirus Typ 2 (CAV2) als alternativer Vektor für den humanen Gentransfer vorgeschlagen. Die gut charakterisierte Biologie von CAV2 bietet zusammen mit seiner einfachen genetischen Manipulation große Vorteile, insbesondere für den Gentransfer in das zentrale Nervensystem oder für die Induktion einer breiten Palette von schützenden Immunreaktionen, von der humoralen bis zur zellulären Immunität. Heutzutage stellt CAV2 eines der attraktivsten nichtmenschlichen Adenoviren für den Einsatz als Impfstoffvektor dar. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Konstruktion, Herstellung und Titer rekombinanter CAV2-Vektoren. Nach der Klonierung der Expressionskassette des interessierenden Gens in ein Shuttle-Plasmid wird das rekombinante genomische Plasmid durch homologe Rekombination im Bakterienstamm E. coli BJ5183 erhalten. Das resultierende genomische Plasmid wird dann in Nierenzellen des Hundes transfiziert, die die komplementären CAV2-E1-Gene (DK-E1) exprimieren. Eine virale Amplifikation ermöglicht die Herstellung eines großen Virusbestandes, der durch Ultrazentrifugation durch Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt und durch Dialyse entsalzt wird. Die resultierende Virussuspension hat routinemäßig einen Titer von über 10bis 10 infektiösen Partikeln pro ml und kann direkt in vivo verabreicht werden.

Die Herstellung rekombinanter CAV2-Vektoren beruht auf grundlegenden, aber wichtigen Methoden der Molekularbiologie. Vor der Produktion viraler Vektoren ist es in der Tat notwendig, ein rekombinantes CAV2-Genom zu konstruieren, das ein Expressionskassetten für das Transgen trägt. Diese Konstruktion umfasst zwei Schritte: Zunächst wird das Gen von Interesse (GOI) als Expressionskassette in ein Shuttle-Plasmid kloniert (das heißt mit Promotor und Polyadenylierungssignal). Dieses funktionelle Element ist von zwei g...

In den letzten 15 Jahren haben vom caninen Adenovirus Typ 2 (CAV2) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit bei der Übertragung von Zellen in vitro und in vivo bewiesen und werden häufig für Impfungen und Gentherapien eingesetzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von CAV2-Vektoren, wodurch virale Suspensionen mit hohem Titer entstehen.

Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Konstruktion, Herstellung und Reinigung von caninen Adenoviren vom Typ 2. Dies wird erreicht, indem zunächst das interessierende Gen in ein Shuttle-Plasmid kloniert wird. Der zweite Schritt besteht darin, ein rekombinantes genomisches Plasmid durch homologe Rekombination zu erhalten.Als nächstes das rekombinante defekte Kalb, zwei Viren, die in einer trans-komplementären Zelllinie produziert und amplifiziert wurden. Der letzte Schritt besteht darin, das resultierende rekombinante Virus für verschiedene Anwendungen in vivo und in vitro aufzureinigen und zu konzentrieren. Letztendlich wird die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um Beispiele für die Virustransduktion im Nagetiergehirn zu zeigen.Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. Vektoren, die aus der menschlichen Ad-Neurose abgeleitet wurden, besteht darin, dass es in menschlichen Populationen keine bereits bestehende Immunität gegen Kalb zwei gibt. Diese Methode kann also helfen, wichtige Fragen im Bereich der Impfung oder Gentherapie zu beantworten, wie z. B. die Beurteilung der Rolle von Proteinen, die in bestimmten Hirnbereichen exprimiert werden. Dieses Verfahren wird also von May KY und Corin Bergeron demonstriert.Zwei Postdoktoranden aus unseren Labors Bereiten Sie sich einen Tag vor der Transfektion auf dieses Verfahren vor, indem Sie DKE-1-Zellen auf einer Sechs-Well-Platte säen, züchten Sie Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in DMEM mit hohem Glukosegehalt, der 7 % Hitze enthält, inaktiviertem fötalem Kalb, Serumnatrium, Pyruvat, Penicillin und Streptomycin. Am folgenden Tag sollten die Zellen zu 70 bis 80 % konfluent für die Transfektion sein, verdauen Sie zwei Mikrogramm pcal GOI die rekombinante Cav zwei genomische Plasmide mit ASC eins, um die nicht-virale Sequenz des Plasmids freizusetzen, überprüfen Sie das resultierende Restriktionsmuster um 0,8 %. Der Verdau der Agro-Gel-Elektrophorese sollte ein etwa 31 Kilobasenpaar-Fragment ergeben, das das rekombinante Genom enthält, und ein Zwei-Kilobasen-Paar-Fragment, das dem Plasmidrückgrat entspricht. Mischen Sie die verdaute DNA mit 200 Mikrolitern Jet-Prime-Puffer und wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang ein.Fügen Sie vier Mikroliter Jet Prime hinzu und mischen Sie, indem Sie es 10 Sekunden lang vortexen. Kurz drehen, um die Tröpfchen zu entfernen, und 10 Minuten inkubieren. Bei Raumtemperatur die Transfektionsmischung tropfenweise auf die DKE one Zellen geben.Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius. Eine Woche nach der Transfektion werden Zellen und Kulturmedium in einem 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen gesammelt. Unterbrechen Sie die Zellen durch drei eingefrorene Gedankenzyklen.Reinigen Sie das Lysat durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 1.800 mal G. Sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei minus 20 für die nachfolgende Virusvermehrung, um das Virus zu vermehren, infizieren Sie eine 80 bis 90 % konfluente Monoschicht von DKE-1-Zellen, die in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 0,5 Millilitern des Virus gezüchtet wurden, die Überstand enthalten. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubieren. Nach einer Stunde. Entfernen Sie das Inokulum und ersetzen Sie es durch 1,5 Milliliter vollständiges DMEM, das 5 % Hitzeinaktivierte FCS-Zellen enthält, inkubieren Sie sie drei bis vier Tage lang bei 37 Grad Celsius.Die Zellen sollten täglich auf das Auftreten einer zytopathischen Wirkung oder CPE überwacht werden. Wenn kein eindeutiges CPE sichtbar ist. Ernten Sie Zellen nach vier Tagen Kultur und wiederholen Sie die virale Amplifikation, wenn ein klares CPE die Mehrheit der Zellen betrifft.In der Regel werden nach zwei bis vier Virusamplifikationsrunden die Zellen mit Kulturmedium entnommen und dreimal eingefroren und aufgetaut, wie bereits gezeigt. Infizieren Sie 80 bis 90 % konfluent. DKE one Zellen, die in drei Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern unter Verwendung von 1,5 Millilitern Virus, das Überstand pro Schale enthält, nach drei bis vier Tagen, wenn CPE abgeschlossen ist, gezüchtet werden.Ernten Sie Zellen aus diesen Schalen mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern, unterbrechen Sie sie durch drei Freestyle-Zyklen und reinigen Sie das Lysat durch Zentrifugation für 10 Minuten 1.800 Mal. G Überstand sammeln und bei minus 20 für großflächige Cav-Amplifikation lagern, um das Scale-up-Verfahren zu beginnen: Infizieren Sie 80 bis 90 % konfluente Monoschichten von DKE-1-Zellen, die in Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 40 bis 10 Zentimetern gezüchtet wurden. Für jede Schale werden 0,1 Milliliter virushaltiger Überstand verwendet, verdünnt in einem Milliliter vollständigem DMEM ohne FCS, inkubieren Sie die Zellen drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter leichter Bewegung. Nach drei bis vier Stunden fügen Sie fünf Milliliter vollständiges DMEM hinzu, das mit 5 % FCS ergänzt ist, und inkubieren Sie drei Tage lang.Nach drei Tagen erntet man infizierte Zellen aus den 40 10-Zentimeter-Schalen in 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen, Pelletzellen bei 1.200 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Resus suspendiert sie in 15 Millilitern DMEM-Medium und zerstört die Zellen durch drei Gefrier-Tau-Zyklen. Entfernen Sie Zelltrümmer, indem Sie 10 Minuten lang bei 1.800 G zentrifugieren.Der Überstand ist vor der Reinigung von Viruspartikeln zur Reinigung von Viruspartikeln bei minus 20 °C zu lagern. Bereiten Sie einen diskontinuierlichen Cäsiumchlorid-Gradienten in einem 14-Milliliter-UltraClear-Röhrchen vor. Gießen Sie zunächst zwei Milliliter der Cäsiumchloridlösung höherer Dichte in den Boden des Röhrchens.Geben Sie dann langsam zwei Milliliter der Cäsiumchlorid-Lösung niedrigerer Dichte auf die erste Lösung. Laden Sie den Virusüberstand vorsichtig auf den Cäsiumchlorid-Gradienten. Füllen Sie das Röhrchen bis zu zwei bis drei Millimeter von der oberen Zentrifuge entfernt in einem schwingenden Rotor SW 40 für eine Stunde und 30 Minuten bei 130.000 g und 18 Grad Celsius nach der Zentrifugation mit Mineralöl.An der Grenzfläche zwischen den beiden Cäsiumchlorid-Lösungsschichten sind zwei weiße Streifen deutlich sichtbar. Mit einer 21-Gauge-Nadel und einer Spritze wird das untere Band, das die reifen Cavs enthält, durch Seitenpunktion zwei Partikel aufgefangen. Versuchen Sie so weit wie möglich, das obere Band zu vermeiden, das leeren Viruspartikeln entspricht.Bereiten Sie einen kontinuierlichen Cäsiumchlorid-Gradienten in einem transparenten 14-Milliliter-Röhrchen vor, indem Sie die kollektiven Viruspartikel mit einer Cäsiumchlorid-Lösung mischen. Füllen Sie das Rohr bis zu zwei bis drei Millimeter von der oberen Zentrifuge entfernt in einem schwingenden Rotor SW 40 für 18 Stunden bei 130.000 mal G und 18 Grad mit Mineralöl. Nach der Zentrifugation wird das weiße Kalb zwei mit einer Band-by-Side-Punktion mit einer Spritze entnommen, wie zuvor gezeigt.Versuchen Sie auch hier zu vermeiden, das verbleibende obere Band zu sammeln. Dies sollte in diesem kontinuierlichen Gradienten, der die beiden Bänder besser trennt, einfacher sein. Das Gesamtvolumen der aufgefangenen Suspension sollte zwei Milliliter nicht überschreiten.Als nächstes äquilibrieren Sie eine cidex G 25 PD 10 Säule mit 30 Millilitern PBS. Laden Sie die Virussuspension auf die Säule und verwerfen Sie den Durchfluss durch die Eluierung mit 500 Mikroliterfraktionen PBS, sammeln Sie die Fraktionen fünf bis sieben, die normalerweise die entsalzte Cav zwei Partikel enthalten. Die virushaltigen Fraktionen können leicht identifiziert werden, da sie mit Duft gesegnet sind.Zum Schluss fügen Sie 150 Mikroliter Glycerin zu den 1,5 Millilitern der CAV 2-Suspension hinzu und lagern Sie es in Eloqua bei minus 80 Grad Celsius, um Cav zwei durch Endpunktverdünnung zu titrieren, tauen Sie ein Aliquot des gereinigten Virus auf Eis auf und führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung von 10 bis minus zwei bis 10 bis minus 12 in serumfreiem DMEM durch. Geben Sie 50 Mikroliter jeder Virusverdünnung in fünf Vertiefungen einer 96-Well-Platte, geben Sie 1,5 mal 10 zu der vierten DKE, eine Zelle in jede Vertiefung, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für fünf Tage am fünften Tag. Überwachen Sie das Auftreten von CPE nach der Infektion durch mikroskopische Beobachtung.Infektiöse Titer werden als mediane infektiöse Dosen von Gewebekulturen unter Verwendung der statistischen Methode read and men vor der Produktion viraler Vektoren bestimmt. Ein rekombinantes CAV-Zwei-Genom mit einer Expressionskassette für das Transgen wird unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken konstruiert. Zunächst wird das interessierende Gen in einem Shuttle-Plasmid als Expressionskassette mit einem frühen Promotor des Cytomegalievirus und einem Polyadenylierungssignal kloniert, flankiert von zwei abgeleiteten genomischen CAV-Sequenzen, die die Upstream- und Downstream-Rekombinationszielsequenzen repräsentieren.In einem zweiten Schritt wird die Expressionskassette aus dem Shuttle-Plasmid durch homologe Rekombination in das CAV-2-Genom eingefügt. Die Insertion der GOI-Expressionskassette führt zur Deletion des EA und eines Teils des E one B-Gens im rekombinanten Genom. Sobald das rekombinante genomische Plasmid erhalten wurde, werden Viruspartikel unter Verwendung von CAV zwei E eins komplementären DKE eins-Zellen hergestellt.Ein eindeutiger zytopathischer Effekt aufgrund der großen Menge an Viruspartikeln, die in infizierten Zellen produziert werden, kann leicht durch Hellfeldmikroskopie oder durch Transgenexpression sichtbar gemacht werden. Dieses Beispiel zeigt einen A-GFP-Vektor, der den CAV-Vektor zwei exprimiert. Nach mehreren viralen Amplifikationsrunden mit frischen DKE one Zellen werden die Viruspartikel durch Ultrazentrifugation auf Cäsiumchlorid-Gradienten aufgereinigt.Konzentrierte Viruspartikel erscheinen als zwei opaleszierende Banden innerhalb des Cäsiumgradienten. Die untere Bande entspricht der reifen rekombinanten Cav zwei, die gesammelt werden soll. Während das obere Band leere, nicht infektiöse Partikel enthält, die vermieden werden sollten.Der resultierende rekombinante Kälber-Zwei-Vektor kann verwendet werden, um nahezu alle Zelltypen in einer Vielzahl von Spezies zu transduzieren, entweder in vitro oder in vivo. Hier ist ein Anwendungsbeispiel zu sehen, in dem GFP, das CAV zwei exprimiert, durch Stereotaxii in verschiedene Bereiche des Zentralnervensystems der Maus injiziert wurde. Da dieses Protokoll einen hohen Titer und reine, reine Virusstämme liefert, führt die Injektion von nur einem Mikroliter PBS-verdünntem GFP, das den CAV-Zwei-Vektor im Gyrus dentatus oder DG exprimiert, zu einer neuronalen Transduktion von 40 bis 50 %.Darüber hinaus ermöglicht die Injektion von zwei Mikrolitern PBS-verdünntem GFP, der den CAV-Vektor im Striatum exprimiert, aufgrund der Fähigkeit von C zwei, retrograd transportiert zu werden, die Transduktion von fast 80% der Nigro stri AAL-Neuronen in den Subs, Nigra pars compacta Nach seinen Entwicklungen. Diese Techniken ebnen Forschern aus den Bereichen Vakzinologie oder Neurowissenschaften den Weg, um neuartige Antigene und Genfunktionen im Gehirn in vielen verschiedenen Tiermodellen zu erforschen. Vergessen Sie also nicht, dass die Arbeit mit CAF zwei abgeleiteten Vektoren äußerst gefährlich und vorsichtig sein kann, wie z. B. ordnungsgemäße Eindämmungs- und Abfallbehandlungsmaßnahmen, einschließlich persönlicher Schutzausrüstung und Arbeiten in Laminar-Flow-Hauben in BSL zwei Laboratorien, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer berücksichtigt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAVs) Vektoren sind immer wertvoll...

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Es wird ein Protokoll zur Erzeugung von adenoviralen Vektoren mit hoher Kapazität vorgestellt, bei denen alle viralen kodierenden Sequenzen fehlen. Die Klonierung von Transgenen, die im Vektorgenom enthalten sind, basiert auf Homing-Endonukleasen. Die Virusamplifikation in Produzentenzellen, die als adhärente Zellen und in Suspension gezüchtet werden, beruht auf einem Helfervirus, das virale Gene in trans bereitstellt.

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Hier stellen wir ein Protokoll für die Adenovirus-Produktion mit dem pAdEasy-System vor. Die Technologie umfasst die Rekombination der Plasmide pAdTrack und pAdEasy-1, die Adenovirus-Verpackung und -Verstärkung, die Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium, die virale Titration und die funktionelle Prüfung des Adenovirus.

Eine effiziente Methode für die Adenovirus-Produktion

Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent &gt;1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

In diesem Protokoll wird der AAV2-Vektor durch Co-Kultivierung von Spodoptera frugiperda (Sf9) Insektenzellen mit Baculovirus (BV)-AAV2-grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder therapeutischem Gen und BV-AAV2-rep-cap infizierten Sf9-Zellen in Suspensionskultur hergestellt. AAV-Partikel werden mittels Reinigungsmittel aus den Zellen freigesetzt, geklärt, durch Affinitätssäulenchromatographie gereinigt und durch tangentiale Strömungsfiltration konzentriert.

Prozessentwicklung zur Herstellung und Reinigung von Adeno-assoziiertem Virus (AAV)2 Vektor mit Baculovirus-Insekten-Zellkultursystem

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg &gt; 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Hier wird ein zellbasiertes AAV-Produktionsprotokoll für HEK293-Suspensionen vorgestellt, das zu einem reduzierten Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion mit Komponenten führt, die für Forschungszwecke von kommerziellen Anbietern erhältlich sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen

Erfahren Sie die Konstruktion, Produktion und Aufreinigung von CAV2-Vektoren für Gentherapie und Impfung. Diese Methode ermöglicht effiziente Transduktion von Zellen in vitro und in vivo.

Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

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