Name: Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie Proteinmisfaltung in Caenorhabditis elegans auf organismischer, zellulärer und Proteinebene untersucht wird. Diese Methoden zeigen Veränderungen der Proteostase-Kapazität bei verschiedenen Kultivierungstemperaturen.

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Alle Nematodenstämme, die in dieser Arbeit verwendet wurden, wurden vom Caenorhabditis Genetics Center zur Verfügung gestellt, das vom NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert wird. Die von H.F. Epstein entwickelten monoklonalen Antikörper wurden von der Developmental Studies Hybridoma Bank bezogen, die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und vom Department of Biology der University of Iowa gepflegt wird. N. Shemesh wurde durch den Fay and Bert Harbour Award unterstützt. A.B.-Z. wurde unterstützt durch ein Alon Fellowship des Israeli Council for Higher Education, durch ein Marie Curie International Reintegration Grant und durch Stipendien der Binational Science Foundation und der Israeli Science Foundation (Grant No. 91/11).

Verwendung von Verhaltensassays zur Überwachung der Proteinfaltung in einem lebenden Organismus
1. Synchronisieren von Tieren für Verhaltenstests
<ol>
	<li>Befolgen Sie die Standardmethoden für die Pflege von C. elegans36, einschließlich der Vorbereitung von Medien und Platten, der Futterzubereitung und der Wachstumsbedingungen der Tiere. Kontrollieren Sie die Anbaubedingungen sorgfältig, einschließlich der Temperatur (15-25 °C), der Populationsgröße und der Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln. Entsorgen Sie alle Platten, die bakteriell oder pilzlich kontaminiert sind.</li>
	<li>Entnehmen Sie 15-30 Embryonen, übertragen Sie sie auf neue Platten und wachsen Sie für die Dauer des Experiments bei der gewünschten Temperatur (15-25 °C). Alternativ 10-20 trächtige adulte Tiere auf einen Teller legen, sie 30-60 min Eier legen lassen und dann vom Teller nehmen. Sowohl die direkte Entnahme von Embryonen als auch das Setzen trächtiger adulter Tiere führen zu einer gewissen Variabilität im Alter (±6 Stunden). Um diese Variabilität zu reduzieren, wählen Sie entweder Embryonen in einem bestimmten Stadium, z. B. im Kommastadium, oder setzen Sie 10-20 erwachsene Tiere ein, die gerade erst mit der Eiablage beginnen (Tag 2 des Erwachsenenalters). Vermeiden Sie nach Möglichkeit eine Synchronisation durch Bleichen, da diese Behandlung stressig ist und die Proteostase beeinträchtigen kann.</li>
	<li>Entnehmen Sie synchronisierte Tiere, geben Sie sie zur Bewertung auf eine Testplatte und verwerfen Sie sie.</li>
</ol>
2. Bewegungs-Assay
Synchronisierte Tiere aufnehmen und auf eine saubere Platte bei der gewünschten Temperatur für die Bewegungsbewertung (15-25 °C) legen. Bewerten Sie für jedes biologische Replikat >20 Tiere und wiederholen Sie den Assay mindestens 3x pro Versuchsbedingung. Verwenden Sie den Wilcoxon-Mann-Whitney-Rangsummentest, um zwei unabhängige experimentelle Bedingungen zu vergleichen.
<ol>
	<li>Um auf eine leichte Bewegungsbeeinträchtigung zu testen, setzen Sie 5-7 Tiere zusammen in die Mitte eines sauberen Bakterienrasens und lassen Sie die Tiere 2 Minuten lang auf der Platte wandern. Dieses Zeitintervall wurde anhand der Zeit bestimmt, die 90 % der Wildtyp-Tiere benötigten, um einen 1 cm großen Kreis zu überwinden.</li>
	<li>Die Anzahl der Tiere, die einen 1-cm-Kreis nicht passiert haben (z. B. die sich in einem Radius von 1 cm von dem Punkt befanden, an dem sie aufgestellt wurden), wird innerhalb von 2 Minuten als unkoordiniert gezählt.</li>
	<li>Um auf schwere Bewegungseinschränkungen zu testen, setzen Sie die Tiere auf einen sauberen Bakterienrasen.</li>
	<li>Fotografieren Sie mehrere Tiere zum Zeitpunkt Null (t=0) und noch einmal 5 min später (t=5). Tiere, die sich nach 5 Minuten nicht eine Körperlänge bewegt haben, gelten als gelähmt.</li>
</ol>
3. Wärmewiderstand
<ol>
	<li>Entnehmen Sie >20 synchronisierte Tiere und geben Sie sie auf eine 24-Well-Platte mit 450 μl Heat Shock (HS)-Puffer (Tabelle 1). Bewerten Sie für jedes biologische Replikat >20 Tiere und wiederholen Sie den Assay mindestens 4x pro Versuchsbedingung.</li>
	<li>Übertragen Sie die 24-Well-Platte in ein beheiztes Bad. Die HS-Temperatur und -Dauer hängen stark von den Wachstumsbedingungen ab, insbesondere von der Kultivierungstemperatur.</li>
	<li>Ergänzen Sie den HS-Puffer mit 9 μl SYTOX orange.</li>
	<li>Bewerten Sie das Überleben der Tiere, indem Sie die Farbstoffaufnahme mit einem fluoreszierenden Stereoskop mit einem TXR-Filter überwachen. Tiere, die den Farbstoff aufgenommen haben, sind tot. Verwenden Sie den Wilcoxon-Mann-Whitney-Rangsummentest, um zwei unabhängige experimentelle Bedingungen zu vergleichen.</li>
</ol>
Verwendung von Immunfärbung und markierten Proteinen zur Überwachung der Proteinfaltung in bestimmten Zellen
4. Überwachung der Lokalisierung von Proteinen durch Immunfärbung
<ol>
	<li>In der erforderlichen Phase werden mindestens 30 Tiere in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, das den M9-Puffer36 enthält.</li>
	<li>Waschen Sie die Tiere einige Male mit M9-Puffer, indem Sie einen kurzen Zentrifugationsschritt mit niedriger Geschwindigkeit (3.000 U/min/900 x g, 2 min) durchführen und wieder aufwirbeln.</li>
	<li>Lege die Röhren zum Abkühlen für ein paar Minuten auf Eis.</li>
	<li>Überschüssige Flüssigkeit entfernen und mit 500 μl eiskalter 4%iger Paraformaldehydlösung inkubieren (Tabelle 2). Die Inkubationszeit muss für jedes untersuchte Protein kalibriert werden und sollte bei Raumtemperatur etwa 5-30 Minuten betragen. Eine längere Inkubation bei 4 °C kann ebenfalls durchgeführt werden, was jedoch die Permeabilisierung der Probe beeinträchtigen kann.</li>
	<li>Fixierte Tiere 3x mit PBS-Tween (pH 7,2) Puffer durch Zentrifugation waschen (3.000 U/min, 1-2 min). Die Tiere können in diesem Stadium einige Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Sammeln Sie die Tiere durch Zentrifugation (3.000 U/min, 1-2 min).</li>
	<li>Entfernen Sie in der Haube den größten Teil des Überstands und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml β-Mercaptoethanol (β-ME)-Lösung (Tabelle 2).</li>
	<li>Über Nacht bei 37 °C unter leichtem Schaukeln auf einem Nutator inkubieren.</li>
	<li>In der Haube die Tiere 3x mit PBS-Tween (pH 7,2) Puffer waschen.</li>
	<li>Die Tiere werden in 50-100 μl PBS-Tween (pH 7,2) resuspendiert. Die Tiere können in diesem Stadium einige Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Sammeln Sie die Tiere durch Zentrifugation (3.000 U/min, 1-2 min) und entfernen Sie den größten Teil des PBS-Tween-Puffers.</li>
	<li>Geben Sie 100-150 μl Kollagenaselösung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie bei 37 °C unter starkem Rühren (mit einem Thermomischer oder einem Schüttelinkubator).</li>
	<li>Untersuchen Sie die Tiere häufig unter einem Stereomikroskop, beginnend nach 5 Minuten Inkubation. Wenn 20 % der Tiere zerbrochen sind, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie das Röhrchen auf Eis legen. Dieser Schritt ist hochsensibel! Die Dauer der Behandlung hängt von den Fixationsbedingungen ab und kann je nach Stamm stark variieren. Eine längere Inkubation kann zu einer vollständigen Verschlechterung der Tiere führen. Die Bedingungen müssen für jede verwendete Enzymcharge kalibriert werden, und der Abbau sollte sorgfältig überwacht werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Tiere zweimal in PBS-Tween (pH 7,2) und sammeln Sie die Tiere dann durch Zentrifugation (3.000 U/min, 1-2 min) und entfernen Sie den größten Teil des PBS-Tween-Puffers.</li>
	<li>1 ml AbA-Lösung (Tabelle 2) zugeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubieren. Die Tiere können in diesem Stadium einige Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Die Tiere werden durch Zentrifugation (3.000 U/min, 1-2 min) aufgefangen und in 200 μl AbA resuspendiert.</li>
	<li>Den auf 1:100-1:1.000 verdünnten Primärantikörper in AbA-Lösung zugeben und unter leichtem Schaukeln inkubieren. Die Temperatur und die Dauer der Inkubation können zwischen den Antikörpern variieren und sollten für jedes untersuchte Protein kalibriert werden. Wir beginnen mit einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Tiere durch Zentrifugation (3.000 U/min, 1-2 min).</li>
	<li>AbA-Puffer (1 ml) zugeben und unter schonendem Mischen 15-60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Tiere können in diesem Stadium einige Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Optional: Die Probe kann auch mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt werden. Dazu wird der Farbstoff (z.B. DAPI (2 mg/ml) oder Phalloidin (1:100)) auf 200 μl AbA gegeben und unter leichtem Schaukeln bis zu 1 h inkubiert. Dieser Schritt kann während eines der Schritte zum Waschen des Sekundärantikörpers durchgeführt werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Tiere 3x, indem Sie die Schritte 4.18-4.19 wiederholen.</li>
	<li>100 μl AbA mit dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, verdünnt im Verhältnis 1:100, zugeben.</li>
	<li>Die Proben werden abgedeckt (oder in einem dunklen Röhrchen) aufbewahrt und mehrere Stunden lang bei Raumtemperatur unter Schaukeln inkubiert.</li>
	<li>Waschen Sie die Tiere 3x, indem Sie sie in AbA-Puffer (1 ml) mit sanftem Mischen für 15-60 min bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von einer Zentrifugation (3.000 U/min, 1-2 min). Die Tiere können in diesem Stadium einige Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Um Tiere auf Objektträger zu montieren, entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und resuspendieren Sie sie in 10 μl desselben Puffers.</li>
	<li>Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze ab, um ein Scheren der Tiere zu vermeiden, und geben Sie 1-2 μl der Probe auf einen Objektträger.</li>
	<li>Fügen Sie Eindeckmedium im Verhältnis 1:1 hinzu.</li>
	<li>Decken Sie die Folie vorsichtig mit einem Deckglas ab und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Wird der Objektträger nicht sofort überwacht, können die Objektträger über einen längeren Zeitraum bei -20 °C gelagert werden.</li>
</ol>
5. Überwachung der Lokalisierung von markierten Proteinen
<ol>
	<li>In der erforderlichen Phase werden mindestens 15 Tiere in einen 10-ml-Tropfen M9-Puffer auf einem Objektträger aufgefangen.</li>
	<li>Setzen Sie die Tiere mit einem "Wurmpickel" in einen 10-ml-Tropfen Paraformaldehydlösung (4%) (Tabelle 2) und warten Sie, bis sich alle Tiere nicht mehr bewegen (ca. 5 Minuten).</li>
	<li>Mit einem "Wurmpickel" werden die Tiere in einen 2-ml-Tropfen M9-Puffer und Einbettmedium (1:1) gebracht (Tabelle 2).</li>
	<li>Decken Sie die Tiere vorsichtig mit einem Deckglas ab und versiegeln Sie sie mit Nagellack.</li>
</ol>
Verwendung von ex vivo Assays zur Überwachung der Proteinfaltung und -stabilität
6. Partieller Aufschluss
<ol>
	<li>Die Tiere werden von 15 Platten (60 mm) mit 1-2 ml M9-Puffer in einem Mikrofuge-Röhrchen gewaschen. Bitte beachten Sie, dass die Tiere nicht überfüllt sein sollten und während der gesamten Dauer des Versuchs ausreichend Futter zur Verfügung stehen sollte.</li>
	<li>Waschen Sie die Tiere einige Male mit M9-Puffer, indem Sie die Tiere zentrifugieren (3.000 U/min, 2 min) und wieder suspendieren.</li>
	<li>Nach dem letzten Schleudern werden die Tiere in 100 μl M9-Puffer resuspendiert.</li>
	<li>Schockfrosten in Flüssigkeit N2. Die Proben können bei -80 °C gelagert werden.</li>
	<li>Mahlen Sie die Probe mit einem gekühlten Stößel und einem motorisierten Bohrer (ein tragbarer Gewebekulturbohrer kann auch verwendet werden). Bewahren Sie die Probe auf Eis auf und vermeiden Sie eine Überhitzung.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Tiere häufig unter einem Stereomikroskop, um festzustellen, ob das Schleifen abgeschlossen ist. Wenn noch unversehrte Tiere übrig sind, wiederholen Sie den Vorgang.</li>
	<li>Schätzen Sie das Volumen, indem Sie den Wurmextrakt pipettieren.</li>
	<li>Fügen Sie ein Verhältnis von (2x) Wurmlyselösung im Verhältnis 1:1 hinzu (Tabelle 3). Verwenden Sie keine Proteasehemmer jeglicher Art.</li>
	<li>15 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Ablagerungen durch Zentrifugation (1.000 x g für 2 min) in einer vorgekühlten Zentrifuge (4 °C) entfernen.</li>
	<li>Den Überstand in ein sauberes Mikrofugenröhrchen umfüllen. Die Proben können direkt verwendet oder bei -80 °C gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Chymotrypsin-Lösung vor (Tabelle 3) und halten Sie sie bis zur Verwendung auf Eis.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.</li>
	<li>Die Probe wird bei Bedarf so verdünnt, dass die Gesamtproteinkonzentration 3-3,5 mg/ml beträgt.</li>
	<li>Fügen Sie Chymotrypsin-Lösung zum Gesamtproteinlysat (1:1.200) hinzu.</li>
	<li>Um die Inkubationszeit zu bestimmen, inkubieren Sie die Probe 60 Minuten lang mit Chymotrypsin. Entfernen Sie 20 μl Aliquots zu verschiedenen Zeitpunkten (z. B. 0, 5, 20, 40 und 60 Minuten) aus der Probe, mischen Sie sie sofort mit SDS-Probenpuffer und kochen Sie sie 5 Minuten lang bei 96 °C. *Alternativ können Sie die Probe mit unterschiedlichen Konzentrationen von Chymotrypsin inkubieren und die Reaktion nach einer bestimmten Zeit stoppen, indem Sie SDS-Probenpuffer hinzufügen und 5 Minuten kochen lassen bei 96 °C.</li>
	<li>Führen Sie Proben auf einem SDS-PAGE-Gel aus.</li>
	<li>Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit geeigneten Antikörpern durch, um die relative Stabilität des Proteins zu bestimmen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die optimalen Bedingungen (Chymotrypsin-Konzentration und Verdauungszeit), die signifikante Veränderungen zwischen den Proben aufweisen, und verwenden Sie diese Bedingungen für zukünftige Experimente.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Intensität verschiedener Verdauungsprodukte (Fragmente mit niedrigerem Molekulargewicht) mit Hilfe von Densitometrie-Software, wie z. B. dem NIH-Bildgelmodul.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Sonden der zellulären Proteostasekapazität müssen hochempfindlich auf Veränderungen in der Faltungsumgebung reagieren und leicht zu überwachen sein, um eine Echtzeitbewertung der Qualitätskontrolle der Proteinfaltung zu ermöglichen. Mit metastabilen Proteinen als Sonden für die Proteostasekapazität überwachten wir Veränderungen des Phänotyps, der subzellulären Proteinlokalisation und der Proteinkonformation. Die hier vorgestellten Protokolle konzentrieren sich auf Muskelprotein-assoziierte Phänotypen, einschließlich Moti...

Das Zusammenspiel der verschiedenen Schritte der Proteinbiosynthese, wie z.B. mRNA-Transkription, -Verarbeitung und -Translation, sowie Proteinfaltung, Translokation und Assemblierung/Demontage, bestimmt die Belastung metastabiler Proteine, die für ihre Funktion von den zellulären Proteinqualitätskontrollmechanismen abhängen1. Das Fehlen oder die Fehlfunktion von Maschinerien zur Proteinqualitätskontrolle kann daher zum funktionellen Verfall verschiedener Arten von zellulären Maschinerien und zum Auftreten von Krankheiten der Proteinfehlfaltung führen2-7. Wenn die Kapazität der Proteinfaltungs- und Clearance-Maschinerie mit der Belastung metastabiler Proteine ausgeglichen wird, wird die Proteinhomöostase (Proteostase) erreicht, ein Zustand, der letztendlich die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen und die Aggregation innerhalb der Zellen verhindert6. Es wird angenommen, dass die Akkumulation fehlgefalteter Proteine das Signal ist, das stressinduzierbare Transkriptionsfaktoren wie den Hitzeschockfaktor (HSF-1) aktiviert und zur Aktivierung zytoprotektiver Stressantworten führt6,8.
Unser Verständnis der Funktionen von Proteostase-Netzwerken in Metazoen wurde hauptsächlich aus in vitro Rekonstitutionsstudien und aus Beobachtungen mit Gewebekulturzellen und einzelligen Organismen abgeleitet9. So konzentrierte sich beispielsweise die Forschung an molekularen Chaperonen, die Proteinschäden verhindern und beheben, auf biochemische und zellbiologische Studien der Mechanismen der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung, -disaggregation und -translokation10-13. Im Vergleich dazu gibt es nur begrenzte Informationen über die integrierte Funktion verschiedener Proteostasekomponenten in den verschiedenen Zellen und Geweben von Metazoen unter "normalen" Wachstumsbedingungen und als Reaktion auf Stress11. Die Entdeckung, dass in C. elegans die zelluläre Proteinqualitätskontrolle auch zellunabhängig reguliert werden kann, wie in Experimenten zum Ausdruck kommt, die zeigen, dass Mutationen in den beiden Neuronen, die die Temperatur wahrnehmen, die Aktivierung der Hitzeschockreaktion blockieren und die Wärmetoleranz verringern können, zeigten die Notwendigkeit, die Proteostase-Regulation in mehrzelligen Organismen zu untersuchen14-17. Was jedoch fehlt, ist ein zusammenhängendes Bild davon, wie Proteostase-Netzwerke, wie die verschiedenen molekularen Chaperon-Familien, im Gewebe eines intakten Metazoons funktionieren und wie dynamisch diese Netzwerke während der Entwicklung und des Alterns sind. Um dieses Ziel zu erreichen, werden zuverlässige Sensoren zur Überwachung der Proteomerhaltung bei lebenden Tieren benötigt, um die proteostatische Kapazität verschiedener Zellen in einem mehrzelligen Organismus im Laufe der Entwicklung und des Alterns zu bestimmen.
Damit ein gegebenes Protein als Sensor der zellulären Proteostase fungieren kann, muss es auf Veränderungen in der zellulären Faltungsumgebung reagieren, während es die Faltung von nicht verwandten Proteinen in der Zelle nur minimal stört. Um die Aufrechterhaltung und Wiederherstellung der zellulären Proteostase in einem lebenden Organismus zu untersuchen, können zwei komplementäre Ansätze verfolgt werden, die auf Faltungssensoren beruhen. Die erste beruht auf designten Faltungssensoren, die auf experimentell identifizierten metastabilen Proteinen basieren, von denen bekannt ist, dass sie von Proteostase-Maschinerien abhängen, wie z.B. Glühwürmchen-Luciferase18-20 oder GFP, das mit einem Degron21-24 markiert ist. Im zweiten Ansatz werden endogene metastabile Proteine, wie z. B. temperaturempfindliche oder altersabhängige aggregierende Proteine, die auf inkrementelle Veränderungen in der zellulären Umgebung reagieren, verfolgt25-27. Entworfene Faltungssensoren erfüllen keine wesentliche biologische Funktion, bieten aber den Vorteil, dass sie mit leistungsstarken Reporting-Assays, wie z. B. GFP-markierten Proteinen, nachweisbar sind und mit vielen verschiedenen Zell- und Tiermodellen eingesetzt werdenkönnen 18. Da jedoch die Einführung eines einzelnen fremden Proteins die Faltungsumgebung beeinflussen kann27, können solche Polypeptide die zelluläre Proteostase-Maschinerie überlasten. Alternativ können entworfene Faltungssensoren, die nicht nativ für die Zelle sind, auf der sie berichten, nicht durch Veränderungen in der Proteostasekapazität der Zelle beeinflusst werden. Zum Beispiel erforderte ein GFP-markiertes Proteasom-Reportersubstrat ~90% des Proteasoms, um gehemmt zu werden, bevor ein Phänotyp nachgewiesen werden konnte23. Im Gegensatz dazu bieten endogene metastabile Proteine, die auf die Proteostase-Maschinerie der Zelle angewiesen sind, den Vorteil, dass sie sich innerhalb des zellulären Empfindlichkeitsbereichs befinden. Der Funktionsverlust, der mit der Fehlfaltung solcher Proteine verbunden ist, kann sich jedoch auch auf die zelluläre Funktion und die Lebensfähigkeit des Organismus auswirken. Hier konzentrieren wir uns auf den Einsatz von endogenen C. elegans-Faltungssensoren.
C. elegans ist ein gut etabliertes Metazoenmodell für die Untersuchung von Entwicklung und Alterung, das viele konservierte biologische Wege nutzt und verwendet werden kann, um die Proteinfaltung in der Zelle zu verfolgen, indem eine Kombination aus Zellbiologie, biochemischen und genetischen Ansätzen verwendet wird. Wir setzten metastabile Proteine als Sonden für die proteostatische Kapazität ein, indem wir Veränderungen in ihrem Phänotyp, ihrer Lokalisation und Stabilität überwachten. Darüber hinaus kann eine Vielzahl von Proteinfunktionen durch einfache Verhaltensanalyse untersucht werden. Ebenso kommt es zu einer erheblichen Fehllokalisierung von Proteinen, wenn zelluläre Proteinqualitätskontrollnetzwerke sich nicht an die zellulären Anforderungen anpassen. Proteine können in Zellen lebender Tiere mithilfe von fluoreszenzmarkierten Proteinen oder durch Immunfärbung leicht sichtbar gemacht werden. Schließlich ist es mit ex vivo-Methoden möglich, die Proteinexpression und -stabilität zu überwachen. Dies ermöglicht ein schnelles und einfaches Screening von Verhaltens- und physiologischen Veränderungen, gekoppelt mit einer eingehenden Analyse der Proteinlokalisierung und -stabilität, was die Überwachung von Proteostase-Modifikatoren ermöglicht. Durch die Kombination dieser verschiedenen Methoden kann ein umfassender Blick auf die Proteinfaltungsumgebung einer Zelle gewonnen werden. In der Tat wurde diese Strategie erfolgreich zur Überwachung der Proteostase-Störung in C. elegans, Hefen, Gewebekulturen und Bakterien eingesetzt15,25-35.

<table><tbody><tr><td>Antikörper-Staning und Fiaxtion</td><td>Paraformaldehyd</td><td>Merc</td><td>8187151000</td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td></td><td>Sigma C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -ME</td><td>Sigma</td><td>8057400250</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Partielle Zusammenfassung&nbsp;</td><td>Chymotrypsin</td><td>Sigma</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>Thermobeständig</td><td>SYTOX Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Amaresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>AUSRÜSTUNG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC Fluoreszenzstereoskop</td><td>Leica</td><td></td><td>TXR Filter</td></tr><tr><td>EXi Blaue Fluoreszenzmikroskopie Kamera</td><td>QImaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>ConfoCor 3/510 META Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellet-Stößel</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Pellet-Stößel Akku-Motor</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 Mikrozentrifuge Serie</td><td>Thermo</td><td>75002455</td><td>gekühlt, 230 V 50/60 Hz, inklusive 24x 1,5/2,0 ml Rotor mit ClickSeal Biocontainment-Deckel</td></tr></tbody></table>

verwendung von caenorhabditis elegans als modellsystem zur untersuchung der proteinhomöostase in einem mehrzelligen organismus

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Die Faltung und Assemblierung von Proteinen ist essentiell für die Proteinfunktion, die langfristige Gesundheit der Zelle und die Langlebigkeit des Organismus. Historisch gesehen wurde die Funktion und Regulation der Proteinfaltung in vitro, in isolierten Gewebekulturzellen und in einzelligen Organismen untersucht. Jüngste Studien haben Zusammenhänge zwischen Proteinhomöostase (Proteostase), Stoffwechsel, Entwicklung, Alterung und Temperaturwahrnehmung aufgedeckt. Diese Erkenntnisse führten zur Entwicklung neuer Werkzeuge zur Überwachung der Proteinfaltung im Modellmetazoen-Organismus Caenorhabditis elegans. In unserem Labor kombinieren wir Verhaltensassays, bildgebende Verfahren und biochemische Ansätze mit temperaturempfindlichen oder natürlich vorkommenden metastabilen Proteinen als Sensoren der Faltungsumgebung, um die Fehlfaltung von Proteinen zu überwachen. Verhaltensassays, die mit der Fehlfaltung eines bestimmten Proteins in Verbindung gebracht werden, liefern eine einfache und aussagekräftige Auslesung für die Proteinfaltung und ermöglichen ein schnelles Screening von Genen und Bedingungen, die die Faltung modulieren. Ebenso kann eine solche Fehlfaltung mit einer Fehllokalisierung von Proteinen in der Zelle verbunden sein. Die Überwachung der Proteinlokalisierung kann daher Veränderungen der zellulären Faltungskapazität aufzeigen, die in verschiedenen Geweben, in verschiedenen Entwicklungsstadien und angesichts sich ändernder Bedingungen auftreten. Schließlich können wir mit biochemischen Werkzeugen ex vivo die Stabilität und Konformation von Proteinen direkt überwachen. Durch die Kombination von Verhaltensassays, Bildgebung und biochemischen Techniken sind wir in der Lage, die Fehlfaltung von Proteinen mit der Auflösung des Organismus, der Zelle bzw. des Proteins zu überwachen.

Ein beeinträchtigtes Faltungsmilieu kann zu Proteinfehlfaltung und -aggregation führen. Proteinfehlfaltung ist mit veränderten Konformationen verbunden und führt zum Verlust der Proteinfunktion. Wir verwenden komplementäre Ansätze, um die Proteinfaltung und -funktion in intakten Tieren, spezifischen Zellen und Proteinauszügen zu überwachen. Eine gezielte Auswahl eines Faltungssensors, basierend auf starken Verhaltens- und zellulären Phänotypen, die mit einer bekannten destabilisierenden Mutation assoziiert sind, kann ans...

Um die Beziehung zwischen Proteinhomöostase, Stress und Alterung zu untersuchen, haben wir Veränderungen in der Proteinfaltung beobachtet, indem wir die Proteindysfunktion, die Proteinlokalisierung in der Zelle und die Proteinstabilität auf organismischer, zellulärer und Proteinebene verfolgt haben, wobei wir das genetisch manipulierbare Metazoon Caenorhabditis elegans als Modellsystem verwendet haben.

Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente mit dem genetisch manipulierbaren Metazoen CENO R elegance ist es, die Fehlfaltung von Proteinen auf drei Ebenen zu überwachen: dem Organismus, den Zellen und den Proteinen. Verhaltensphänotypen wie Motilität oder Thermowiderstand fungieren als Messwerte für Veränderungen der Proteinhomöostase auf organismischer Ebene, temperaturempfindlich oder natürlich auftretend. Metastabile Proteine werden verwendet, um die Lokalisierung von Proteinfehlern zu verfolgen, die mit einer Proteinfehlfaltung in Verbindung gebracht werden können.Ein ex vivo Teilverdau-Assay überwacht die Proteinstabilität direkt. Die Ergebnisse können Veränderungen der Proteostasekapazität bei unterschiedlichen Kultivierungstemperaturen zeigen, basierend auf dem Thermoresistenz-Assay, der Immunfluoreszenzmikroskopie und der westlichen Blutanalyse. Diese Verfahren werden von Doktoranden in meinem Labor demonstriert.Der Verhaltenstest wird von ish ido demonstriert und Shai wird die Immunfärbung demonstrieren und ANA flunking und sheron wird die partielle Verdauung demonstrieren. Dieses Protokoll zur Messung der Temperaturtoleranz wird von vorbereitenden Schritten zur Synchronisierung der Tiere und einem Bewegungsassay begleitet. Beide werden im Textprotokoll beschrieben und beginnen mit dem Sammeln von Replikaten, die mindestens 20 synchronisierte Tiere enthalten.In 24 gut bespielten Bohrlöchern mit 450 Mikrolitern Hitzeschockpuffer. Ergänzen Sie jede Vertiefung mit neun Mikrolitern Cytoxin. Gib die Platte nun in ein beheiztes Bad.Der Hitzeschock, die Temperatur und die Dauer hängen stark von den Wachstumsbedingungen ab. Insbesondere die Kultivierungstemperatur bewertet das Überleben der Tiere, indem sie die Matrizenaufnahme überwacht. Bei Verwendung eines fluoreszierenden Stereoskops mit einem TXR-Filter sind die Tiere, die den Würfel aufnehmen, tot.Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie kine, der Toleranz durch manuelles Scoring ist die Verwendung der visuellen Auslesung der Tiersterblichkeit, die diesen Aufsatz viel schneller und reproduzierbarer macht. In der erforderlichen Phase werden mindestens 30 Tiere in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit M neun Puffer überführt. Waschen Sie die Tiere einige Male mit M neun, indem Sie kurze Zentrifugationsschritte mit niedriger Geschwindigkeit durchführen und sie in M neun aufhängen.Legen Sie die Röhren dann zum Abkühlen einige Minuten auf Eis. Entfernen Sie nach dem Abkühlen die überschüssige Flüssigkeit und inkubieren Sie die Röhrchen. In 500 Mikrolitern eiskaltem, 4%PARAFORM-Aldehyd.Die Inkubationszeit muss für jedes untersuchte Protein kalibriert werden und sollte bei Raumtemperatur etwa fünf bis 30 Minuten betragen. Waschen Sie nun die fixierten Tiere dreimal mit PBS-Tween bei pH 7,2 durch Zentrifugation. Zentrifugationen werden immer bei 3000 U/min für ein oder zwei Minuten durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.Entfernen Sie in der Haube den größten Teil des Überstands und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Mercaptoethanollösung. Dann brüten Sie die Tiere über Nacht bei 37 Grad Celsius aus und schaukeln am nächsten Tag sanft in der Haube. Waschen Sie die Tiere dreimal mit PBST durch Zentrifugation und Resus.Beenden Sie die Wäsche mit 50 bis 100 Mikrolitern PBST und entfernen Sie den größten Teil dieses PBST nach einer weiteren Zentrifugation. Als nächstes fügen Sie 100 bis 150 Mikroliter Kollagenaselösung hinzu und inkubieren die Tiere bei 37 Grad Celsius unter starkem Rühren. Verwenden Sie einen Thermomixer oder einen Schüttelinkubator.Beginnen Sie nach fünf Minuten mit regelmäßigen Kontrollen unter einem Stereomikroskop. Wenn ein Fünftel der Tiere zerbrochen ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie das Röhrchen auf Eis legen. Dieser Schritt ist hochsensibel.Die Dauer der Behandlung hängt von den Fixationsbedingungen ab und kann zwischen den Stämmen stark variieren. Eine längere Inkubation könnte zu einer vollständigen Zersetzung der Tiere führen. Die Bedingungen müssen vor jeder Enzymcharge kalibriert werden, und der Abbau sollte sorgfältig überwacht werden.Als nächstes waschen Sie die Tiere zweimal in PBST. Sammeln Sie die Tiere durch Zentrifugation und entfernen Sie den größten Teil des PBST. Dann fügen Sie einen Milliliter einer BA-Lösung hinzu, gefolgt von einer Inkubation unter leichtem Schaukeln für eine Stunde bei Raumtemperatur, sammeln Sie die Tiere durch Zentrifugation und suspendieren Sie sie in 200 Mikrolitern a b, A. Fügen Sie nun den primären Antikörper hinzu und beginnen Sie eine Inkubation über Nacht mit leichtem Schaukeln bei Raumtemperatur.Diese Parameter müssen kalibriert werden. Als nächstes waschen Sie die Tiere durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie sie in einem Milliliter a b, A und inkubieren Sie sie durch sanftes Mischen 15 Minuten bis eine Stunde lang bei Raumtemperatur.An dieser Stelle kann eine optionale Zugabe von Fluoreszenzfarbstoff hinzugefügt werden. Wiederholen Sie anschließend die Wäsche mit einem BA-Puffer drei weitere Male und beenden Sie die Waschungen, indem Sie 100 Mikroliter eines BA mit dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von eins bis 100 mit Resus suspendieren. Die Proben werden mehrere Stunden lang bei Lichtschutz bei Raumtemperatur unter Schaukeln inkubiert, um die Sekundärprobe zu reinigen.Führen Sie drei Wäschen mit a, b, a durch. Montieren Sie dann die Tiere auf Objektträger, indem Sie sie zuerst mit Resus aufhängen, indem Sie sie in 10 Mikrolitern a b, a aufhängen, und dann mit einer Pipette mit breitem Bohrloch ein oder zwei Mikroliter der Probe auf jeden Objektträger übertragen, fügen Sie ein gleiches Volumen Einbettmedium hinzu und decken Sie den Objektträger ab. Versiegeln Sie die Folie vorsichtig mit Nagellack.Die Dias können über einen längeren Zeitraum bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesem Protokoll noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Protokoll lang ist und viele Schritte umfasst, die sich auf die Effizienz auswirken und die Fehlerbehebung erschweren können. Beginnen Sie damit, die Tiere von etwa 1560 Millimeter Platten in ein bis zwei Milliliter M neun Puffer zu sammeln.Die Tiere sollten nicht überfüllt sein. Waschen Sie die Tiere einige Male mit M neun Puffer, indem Sie zentrifugieren und die Tiere wieder aufhängen. Nach dem letzten Schleudern werden die Tiere durch die Wiederbelebung in 100 Mikrolitern M neun Puffer suspendiert.Dann frieren Sie die Tiere im Schockfrost ein und zerkleinern Sie die Probe mit einem gekühlten Stößel und Bohrer auf Eis. Wird häufig pausiert, um zu überprüfen, ob die Tiere ausreichend geschliffen sind. Sobald die Tiere vollständig zerkleinert sind, schätzen Sie das Volumen des Wurmextrakts.Geben Sie dann ein gleiches Volumen von zwei x Wurmlyselösung hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang auf Eis. Entfernen Sie anschließend die Rückstände durch einen gekühlten Zentrifugationszyklus und übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozündrohr. Nach einem Bradford-Assay verdünnen Sie die Probe auf drei bis 3,5 Milligramm Protein pro Milliliter.Fügen Sie dann frisch zubereitete gekühlte Camo-Trypsin-Lösung im Verhältnis eins zu 1200 hinzu. Legen Sie zu diesem Zeitpunkt fest, dass die Probe eine Stunde lang inkubiert wird. Nehmen Sie während der Inkubation regelmäßig 20 Mikroliter Aliquots und mischen Sie sie sofort mit SDS-Puffer, gefolgt von fünf Minuten bei 96 Grad Celsius.Führen Sie die Proben aus und führen Sie anschließend eine westliche Blutanalyse durch, um die relative Stabilität des Proteins zu bestimmen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, der Aufschlussprobe keinen Proteasehemmer-Cocktail hinzuzufügen, sondern wir werden die Proben schnell und auf Eis legen. Die E 781 K ts-Mutation im Muskelchaperon auf 45 beeinflusst stark die Myosinfaltung und -assemblierung und beeinträchtigt daher die Beweglichkeit der Tiere.Als diese Mutanten bei Temperaturen über 20 Grad Celsius gezüchtet wurden, waren sie vollständig gelähmt, aber nicht bei 15 Grad Celsius. Wenn Wildtyp-Tiere, die bei 25 Grad Celsius aufgezogen wurden, einem anhaltenden Hitzeschock ausgesetzt waren, überlebten die meisten. Während nur 30 % überlebten, wenn sie auf 15 bis 20 Grad Celsius erhöht wurden, um die wirksamen Modifikatoren der Hitzeschockreaktion zu überwachen, wurden die Kontrollstressbedingungen bei Wildtyptieren auf eine Überlebensrate von 70 % erhöht.Die Tiere wurden sechs Stunden lang einem 37 Grad Celsius heißen Hitzeschock ausgesetzt. Am ersten Tag des Erwachsenenalters wurde das Überleben mit dem Cyt-Orange-Aufnahme-Assay bestimmt. Tote Tiere sind durch weiße Pfeile und lebende Tiere durch gelbe Pfeile gekennzeichnet.Die Lokalisierung mehrerer metastabiler Proteine wurde mit Hilfe spezifischer Antikörper sichtbar gemacht. Zum Beispiel ist Paramin ts unter restriktiven Bedingungen an polykristalline Anordnungen statt an Muskelsarkomeren lokalisiert. Ebenso bildet Myosin TS bei der restriktiven Temperatur unorganisierte Filamente anstelle der hochgeordneten filamentösen Strukturen.Tiere, die verschiedene TS-mutierte Proteine exprimieren, die mit myo drei koexprimiert werden. GFP zeigte eine rasche Verschlechterung der Myofilamentorganisation, wie durch die Überwachung der GFP festgestellt wurde. Veränderungen in der Myosinbestätigung können Veränderungen in der Faltungskapazität von Muskelzellen widerspiegeln. Das proteolytische Fragmentierungsmuster der Myosin-Schwerkette, die mit UNC 45 Ts koexprimiert wird, zeigt im Vergleich zum Verdauungsprofil von Myosin aus Wildtyp-Tieren deutliche Eigenschaften, was die Behauptung stützt, dass die Myosinfaltung durch UNC 45 beeinflusst wird.Verlust der Funktion. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Regulation der Proteostase in der Meereseleganz geben kann, kann sie auch in anderen Systemen, wie z.B. in verschiedenen Modellorganismen, angewendet werden.

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