Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente mit dem genetisch manipulierbaren Metazoen CENO R elegance ist es, die Fehlfaltung von Proteinen auf drei Ebenen zu überwachen: dem Organismus, den Zellen und den Proteinen. Verhaltensphänotypen wie Motilität oder Thermowiderstand fungieren als Messwerte für Veränderungen der Proteinhomöostase auf organismischer Ebene, temperaturempfindlich oder natürlich auftretend. Metastabile Proteine werden verwendet, um die Lokalisierung von Proteinfehlern zu verfolgen, die mit einer Proteinfehlfaltung in Verbindung gebracht werden können.

Ein ex vivo Teilverdau-Assay überwacht die Proteinstabilität direkt. Die Ergebnisse können Veränderungen der Proteostasekapazität bei unterschiedlichen Kultivierungstemperaturen zeigen, basierend auf dem Thermoresistenz-Assay, der Immunfluoreszenzmikroskopie und der westlichen Blutanalyse. Diese Verfahren werden von Doktoranden in meinem Labor demonstriert.

Der Verhaltenstest wird von ish ido demonstriert und Shai wird die Immunfärbung demonstrieren und ANA flunking und sheron wird die partielle Verdauung demonstrieren. Dieses Protokoll zur Messung der Temperaturtoleranz wird von vorbereitenden Schritten zur Synchronisierung der Tiere und einem Bewegungsassay begleitet. Beide werden im Textprotokoll beschrieben und beginnen mit dem Sammeln von Replikaten, die mindestens 20 synchronisierte Tiere enthalten.

In 24 gut bespielten Bohrlöchern mit 450 Mikrolitern Hitzeschockpuffer. Ergänzen Sie jede Vertiefung mit neun Mikrolitern Cytoxin. Gib die Platte nun in ein beheiztes Bad.

Der Hitzeschock, die Temperatur und die Dauer hängen stark von den Wachstumsbedingungen ab. Insbesondere die Kultivierungstemperatur bewertet das Überleben der Tiere, indem sie die Matrizenaufnahme überwacht. Bei Verwendung eines fluoreszierenden Stereoskops mit einem TXR-Filter sind die Tiere, die den Würfel aufnehmen, tot.

Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie kine, der Toleranz durch manuelles Scoring ist die Verwendung der visuellen Auslesung der Tiersterblichkeit, die diesen Aufsatz viel schneller und reproduzierbarer macht. In der erforderlichen Phase werden mindestens 30 Tiere in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit M neun Puffer überführt. Waschen Sie die Tiere einige Male mit M neun, indem Sie kurze Zentrifugationsschritte mit niedriger Geschwindigkeit durchführen und sie in M neun aufhängen.

Legen Sie die Röhren dann zum Abkühlen einige Minuten auf Eis. Entfernen Sie nach dem Abkühlen die überschüssige Flüssigkeit und inkubieren Sie die Röhrchen. In 500 Mikrolitern eiskaltem, 4%PARAFORM-Aldehyd.

Die Inkubationszeit muss für jedes untersuchte Protein kalibriert werden und sollte bei Raumtemperatur etwa fünf bis 30 Minuten betragen. Waschen Sie nun die fixierten Tiere dreimal mit PBS-Tween bei pH 7,2 durch Zentrifugation. Zentrifugationen werden immer bei 3000 U/min für ein oder zwei Minuten durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

Entfernen Sie in der Haube den größten Teil des Überstands und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Mercaptoethanollösung. Dann brüten Sie die Tiere über Nacht bei 37 Grad Celsius aus und schaukeln am nächsten Tag sanft in der Haube. Waschen Sie die Tiere dreimal mit PBST durch Zentrifugation und Resus.

Beenden Sie die Wäsche mit 50 bis 100 Mikrolitern PBST und entfernen Sie den größten Teil dieses PBST nach einer weiteren Zentrifugation. Als nächstes fügen Sie 100 bis 150 Mikroliter Kollagenaselösung hinzu und inkubieren die Tiere bei 37 Grad Celsius unter starkem Rühren. Verwenden Sie einen Thermomixer oder einen Schüttelinkubator.

Beginnen Sie nach fünf Minuten mit regelmäßigen Kontrollen unter einem Stereomikroskop. Wenn ein Fünftel der Tiere zerbrochen ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie das Röhrchen auf Eis legen. Dieser Schritt ist hochsensibel.

Die Dauer der Behandlung hängt von den Fixationsbedingungen ab und kann zwischen den Stämmen stark variieren. Eine längere Inkubation könnte zu einer vollständigen Zersetzung der Tiere führen. Die Bedingungen müssen vor jeder Enzymcharge kalibriert werden, und der Abbau sollte sorgfältig überwacht werden.

Als nächstes waschen Sie die Tiere zweimal in PBST. Sammeln Sie die Tiere durch Zentrifugation und entfernen Sie den größten Teil des PBST. Dann fügen Sie einen Milliliter einer BA-Lösung hinzu, gefolgt von einer Inkubation unter leichtem Schaukeln für eine Stunde bei Raumtemperatur, sammeln Sie die Tiere durch Zentrifugation und suspendieren Sie sie in 200 Mikrolitern a b, A. Fügen Sie nun den primären Antikörper hinzu und beginnen Sie eine Inkubation über Nacht mit leichtem Schaukeln bei Raumtemperatur.

Diese Parameter müssen kalibriert werden. Als nächstes waschen Sie die Tiere durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie sie in einem Milliliter a b, A und inkubieren Sie sie durch sanftes Mischen 15 Minuten bis eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

An dieser Stelle kann eine optionale Zugabe von Fluoreszenzfarbstoff hinzugefügt werden. Wiederholen Sie anschließend die Wäsche mit einem BA-Puffer drei weitere Male und beenden Sie die Waschungen, indem Sie 100 Mikroliter eines BA mit dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von eins bis 100 mit Resus suspendieren. Die Proben werden mehrere Stunden lang bei Lichtschutz bei Raumtemperatur unter Schaukeln inkubiert, um die Sekundärprobe zu reinigen.

Führen Sie drei Wäschen mit a, b, a durch. Montieren Sie dann die Tiere auf Objektträger, indem Sie sie zuerst mit Resus aufhängen, indem Sie sie in 10 Mikrolitern a b, a aufhängen, und dann mit einer Pipette mit breitem Bohrloch ein oder zwei Mikroliter der Probe auf jeden Objektträger übertragen, fügen Sie ein gleiches Volumen Einbettmedium hinzu und decken Sie den Objektträger ab. Versiegeln Sie die Folie vorsichtig mit Nagellack.

Die Dias können über einen längeren Zeitraum bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesem Protokoll noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Protokoll lang ist und viele Schritte umfasst, die sich auf die Effizienz auswirken und die Fehlerbehebung erschweren können. Beginnen Sie damit, die Tiere von etwa 1560 Millimeter Platten in ein bis zwei Milliliter M neun Puffer zu sammeln.

Die Tiere sollten nicht überfüllt sein. Waschen Sie die Tiere einige Male mit M neun Puffer, indem Sie zentrifugieren und die Tiere wieder aufhängen. Nach dem letzten Schleudern werden die Tiere durch die Wiederbelebung in 100 Mikrolitern M neun Puffer suspendiert.

Dann frieren Sie die Tiere im Schockfrost ein und zerkleinern Sie die Probe mit einem gekühlten Stößel und Bohrer auf Eis. Wird häufig pausiert, um zu überprüfen, ob die Tiere ausreichend geschliffen sind. Sobald die Tiere vollständig zerkleinert sind, schätzen Sie das Volumen des Wurmextrakts.

Geben Sie dann ein gleiches Volumen von zwei x Wurmlyselösung hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang auf Eis. Entfernen Sie anschließend die Rückstände durch einen gekühlten Zentrifugationszyklus und übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozündrohr. Nach einem Bradford-Assay verdünnen Sie die Probe auf drei bis 3,5 Milligramm Protein pro Milliliter.

Fügen Sie dann frisch zubereitete gekühlte Camo-Trypsin-Lösung im Verhältnis eins zu 1200 hinzu. Legen Sie zu diesem Zeitpunkt fest, dass die Probe eine Stunde lang inkubiert wird. Nehmen Sie während der Inkubation regelmäßig 20 Mikroliter Aliquots und mischen Sie sie sofort mit SDS-Puffer, gefolgt von fünf Minuten bei 96 Grad Celsius.

Führen Sie die Proben aus und führen Sie anschließend eine westliche Blutanalyse durch, um die relative Stabilität des Proteins zu bestimmen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, der Aufschlussprobe keinen Proteasehemmer-Cocktail hinzuzufügen, sondern wir werden die Proben schnell und auf Eis legen. Die E 781 K ts-Mutation im Muskelchaperon auf 45 beeinflusst stark die Myosinfaltung und -assemblierung und beeinträchtigt daher die Beweglichkeit der Tiere.

Als diese Mutanten bei Temperaturen über 20 Grad Celsius gezüchtet wurden, waren sie vollständig gelähmt, aber nicht bei 15 Grad Celsius. Wenn Wildtyp-Tiere, die bei 25 Grad Celsius aufgezogen wurden, einem anhaltenden Hitzeschock ausgesetzt waren, überlebten die meisten. Während nur 30 % überlebten, wenn sie auf 15 bis 20 Grad Celsius erhöht wurden, um die wirksamen Modifikatoren der Hitzeschockreaktion zu überwachen, wurden die Kontrollstressbedingungen bei Wildtyptieren auf eine Überlebensrate von 70 % erhöht.

Die Tiere wurden sechs Stunden lang einem 37 Grad Celsius heißen Hitzeschock ausgesetzt. Am ersten Tag des Erwachsenenalters wurde das Überleben mit dem Cyt-Orange-Aufnahme-Assay bestimmt. Tote Tiere sind durch weiße Pfeile und lebende Tiere durch gelbe Pfeile gekennzeichnet.

Die Lokalisierung mehrerer metastabiler Proteine wurde mit Hilfe spezifischer Antikörper sichtbar gemacht. Zum Beispiel ist Paramin ts unter restriktiven Bedingungen an polykristalline Anordnungen statt an Muskelsarkomeren lokalisiert. Ebenso bildet Myosin TS bei der restriktiven Temperatur unorganisierte Filamente anstelle der hochgeordneten filamentösen Strukturen.

Tiere, die verschiedene TS-mutierte Proteine exprimieren, die mit myo drei koexprimiert werden. GFP zeigte eine rasche Verschlechterung der Myofilamentorganisation, wie durch die Überwachung der GFP festgestellt wurde. Veränderungen in der Myosinbestätigung können Veränderungen in der Faltungskapazität von Muskelzellen widerspiegeln. Das proteolytische Fragmentierungsmuster der Myosin-Schwerkette, die mit UNC 45 Ts koexprimiert wird, zeigt im Vergleich zum Verdauungsprofil von Myosin aus Wildtyp-Tieren deutliche Eigenschaften, was die Behauptung stützt, dass die Myosinfaltung durch UNC 45 beeinflusst wird.

Verlust der Funktion. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Regulation der Proteostase in der Meereseleganz geben kann, kann sie auch in anderen Systemen, wie z.B. in verschiedenen Modellorganismen, angewendet werden.