FtsZ Polymerisation Assays: Einfache Protokolle und Überlegungen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, geeignete Bedingungen für die Untersuchung von FTSZ, Polymerisation und Aktivität mit einfachen Assays und Geräten zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem FDSC-Polymersedimentationsassays unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden, um geeignete Bedingungen zu finden, unter denen FDSZ polymerisiert. In einem zweiten Schritt führen wir Lichtstreuassays durch, um die FDSZ-Polymerisation in Echtzeit zu untersuchen.

Als nächstes führen wir GTP-Hydrolyse-Assays durch, um die polymerisationsassoziierte g gtpa-Aktivität von FT SC zu bestimmen. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, welche Bedingungen am besten für die Untersuchung von FTSC einer bestimmten Bakterienquelle geeignet sind, basierend auf Sedimentation, Lichtstreuung und GTP-Hydrolyse. Die hier gezeigte Technik ist in jedem Labor einfach durchzuführen und gibt einen schnellen Überblick über die Polymerisationsfähigkeiten bestimmter FT a z. Wir stellen fest, dass die Wahl des richtigen Puffers besonders wichtig ist, wenn wir mit FTAZ in Gegenwart anderer Proteine arbeiten, die die Technik demonstrieren, ist EVA Crawl, ein Doktorand aus meinem Labor.

Zu Beginn fügen Sie fünf Mikroliter 100 millimolares Magnesiumchlorid und 12 Mikromolare der bakteriellen Proteine, FDSC und/oder SEP F in einen der ausgewählten Polymerisationspuffer hinzu, die verschiedene pH-Werte und Zusammensetzungen aufweisen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Legen Sie anschließend die Röhrchen in einen Inkubator mit Schüttelfunktion und inkubieren Sie die Proben zwei Minuten lang bei 30 Grad Celsius und 300 U/min. Nachdem die Röhrchen gründlich gemischt wurden, beginnen Sie mit der Polymerisation, indem Sie einen Mikroliter eines GTP- oder GDP-Gemisches aus einer 100 Millimolaren Stammlösung hinzufügen, so dass die Endkonzentration zwei Millimolar beträgt.

Geben Sie die Proben dann für weitere 20 Minuten zurück in den Schüttelinkubator. Als nächstes drehen Sie die Röhren 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 20.000 U/min mit einem TLA 55-Rotor oder einem gleichwertigen 24.600 G herunter, wenn Sie etwas anderes verwenden. Sobald die Zentrifuge fertig ist, füllen Sie die Überstände in saubere Röhrchen um und bewahren Sie die Pellets für später auf.

Man nehme 20 Mikroliter der übertragenen Überstände und mische sie in einem separaten Röhrchen mit 20 Mikrolitern zweifach konzentriertem Probenpuffer. Befestigen Sie die Verschlüsse und kochen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 98 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter zweifach konzentrierten Probenpuffer zu jeder Pelletfraktion, die zuvor beiseite gelegt wurde, und suspendieren Sie die Polymere, indem Sie die Proben 10 Minuten lang bei 98 Grad Celsius kochen.

Sobald die Proben fertig gekocht sind, geben Sie weitere 50 Mikroliter demineralisiertes Wasser in die Röhrchen mit den Pellets. Laden Sie als nächstes 10 Mikroliter der Überstände und Pellets aus jeder Probe nebeneinander auf ein 10%iges SDS-Seitengel und lassen Sie das Gel bei 150 Volt laufen. Sobald das Gel fertig ist, entfernen Sie das Gel und färben Sie es mit Kumasi Brillantblau G two 50.

Dann bilden Sie das Gel ab und quantifizieren Sie das Protein mittels Zytometrie, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Schalten Sie zunächst ein Fluoreszenzspektrometer ein und lassen Sie die Lampe einige Minuten lang erwärmen, um thermische Schwankungen zu vermeiden. Schalten Sie außerdem ein zirkulierendes Wasserbad ein und stellen Sie die Wassertemperatur auf 30 Grad Celsius ein, um die Temperatur der Kammer konstant zu halten.

Definieren Sie beim Aufwärmen des Systems die Betriebsparameter des Spektrometers. Stellen Sie die Hochspannung des Detektors auf 300 Volt und die Emissions- und Anregungswellenlängen auf 350 Nanometer bei einer Spaltbreite von vier Nanometern ein. Programmieren Sie dann das Datenerfassungsprotokoll, indem Sie eine zeitbasierte Erfassung mit einer Dauer von 3.600 Sekunden auswählen.

Reinigen Sie vorsichtig einen 200 Mikroliter Fluoreszenz-Vete mit einer Weglänge von einem Zentimeter, indem Sie ihn fünf Minuten lang in einer Reinigungslösung in einem Wasserbad unzüchtig machen. Als nächstes bereiten Sie 294 Mikroliter eines Mastermixes für jeden der neun Polymerisationspuffer vor, die im begleitenden Textprotokoll beschrieben sind, jeweils mit 10 Millimolar Magnesiumchlorid und 12 Mikromolar FDSE als die für 300 Mikroliter berechneten Endkonzentrationen. Dann kurz vortexen: Die Mischungen geben 196 Mikroliter des ersten Polymerisationspuffers an den Tierarzt ab.

Legen Sie es in das Spektrometer und inkubieren Sie es zwei Minuten lang, um die Temperatur der Probe auf 30 Grad Celsius zu bringen. Starten Sie nach zwei Minuten die Datenerfassung und warten Sie 90 Sekunden, um zu überprüfen, ob das Signal stabil ist. Fügen Sie dann vier Mikroliter 100 Millimolar GTP oder GDP hinzu.

Mischen Sie die Probe und setzen Sie die Datenerfassung eine volle Stunde lang fort. Wiederholen Sie diese Schritte für jeden aufgelisteten Puffer. Bereiten Sie 1,5 Milliliter mit zwei Millimolaren GTP in einem ausgewählten Polymerisationspuffer vor.

Bereiten Sie auch eine Phosphatstandardverdünnung im Bereich von null bis 40 Mikromolaren im selben Puffer vor. Bereiten Sie als Nächstes das Malachitgrün-Arbeitsreagenz vor, wie im Bioassay-Kit beschrieben. Stellen Sie dann vier Mastermixe mit einem Gesamtvolumen von jeweils 360 Mikrolitern zusammen, wobei der erste Mastermix FDSZ enthält, der von B subtilis abgeleitet ist, und der zweite Mastermix enthält FDSE, der von E. coli abgeleitet ist.

Die Mastermixe drei und vier werden als Kontrolle verwendet und enthalten EDTA anstelle von Magnesiumchlorid. Pipettieren Sie anschließend 20 Mikroliter Aliquots der Mastermixe und Phosphatstandards. In A-Q-P-C-R 96 Well-Platte so verlegen, dass für jeden Mastermix 16 Wells vorhanden sind und die Phosphatstandards wie hier gezeigt angeordnet sind.

Pipettieren Sie 180 Mikroliter zwei Millimolare GTP-Brühe auf die letzte Spur der Platte. Legen Sie die Platte dann in eine PCR-Maschine. Führen Sie ein Programm mit einem einzigen Zyklus durch, der 40 Minuten lang auf 30 Grad Celsius eingestellt ist.

In einer zweiten 96-Well-Plattenpipette werden 20 Mikroliter des Malachitgrün-Arbeitsreagenzes in die Vertiefungen A eins bis H 10 gegeben. Dann bei 60 Mikrolitern des Polymerisationspuffers aus den Experimentansprüchen A eins bis H acht, dann bei 20 Mikrolitern der zwei millimolaren GTP-Lösung in die Vertiefungen in jeder Spur der Platte. Eine in den vorgegebenen Intervallen, wie hier gezeigt, um die Reaktion zu verschiedenen Zeitpunkten zu untersuchen.

Spritzen Sie die Mischungen auf und ab, um sie nach 30 Minuten zu mischen, beginnend mit Bahn eins in Platte eins, übertragen Sie 20 Mikroliter von Bahn eins von Platte eins in Bahn eins von Platte zwei und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Dies ist der Ausgangspunkt der malachitgrünen Farbentwicklung für die 30-minütige Reaktion: Nach 30 1/2 Minuten werden 20 Mikroliter von Bahn zwei der ersten Platte in die zweite Bahn der zweiten Platte übertragen und gemischt. Dies ist der Ausgangspunkt der malachitgrünen Farbentwicklung für die 20-minütige Reaktion.

Wiederholen Sie diese Schritte mit den restlichen Bahnen drei bis sieben im 32. Intervall nach 33 1/2 Minuten bei 20 Mikrolitern GTP auf Bahn acht auf Platte eins und mischen Sie. Dann 20 Mikroliter auf Bahn acht auf der zweiten Platte umfüllen und mischen. Dies stellt die Null-Minuten-Reaktion dar und ist der Startzeitpunkt für die Entwicklung der malachitgrünen Farbe.

Nach 34 Minuten werden 80 Mikroliter von der neunten Bahn der ersten Platte, die den Phosphatstandard enthält, auf die neunte Bahn der zweiten Platte gegeben und nach 34 1/2 Minuten gemischt, 80 Mikroliter aus dem zweiten Phosphatstandard auf der Bahn 10 der ersten Platte auf die Bahn 10 der zweiten Platte übertragen und gemischt. Entfernen Sie dann alle Luftblasen von den Proben und inkubieren Sie die Platte weitere 25 1/2 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation.

Legen Sie die Platte ab 60 Minuten nach Beginn des Experiments in einen 96-Well-Plattenreader. Messen Sie die Platte bei 630 Nanometern alle 30 Sekunden für fünf Minuten, so dass 10 Zeitpunkte genommen werden. Die erste Plattenmessung entspricht der ersten Bahn, die zweite der zweiten Bahn zwei, so dass jede Bahn genau die gleiche Zeit hatte, damit sich die malachitgrüne Farbe entwickeln konnte.

Berechnen Sie als Nächstes das freie Phosphat in jeder Probe unter Verwendung der Phosphatstandard-Kalibrierkurve und stellen Sie die Daten als Phosphatfreisetzung im Laufe der Zeit dar. Berechnen Sie dann die Hydrolyseaktivität F-D-S-Z-G-T-P aus dem linearen Bereich der Kurve. Hier ist der prozentuale Anteil von SEP F und FDSZ in den Pellets der Proben dargestellt.

FDSZ wurde in dem Pellet nur dann über den Hintergrundwerten wiedergefunden, wenn sowohl SEP F als auch GTP in der Probe vorhanden waren. Die genaue Stöchiometrie von SEPPE und FDSZ in diesen Tubuli ist nicht bekannt, aber diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mehr Seppe als FDSZ vorhanden ist. Hier ist die Lichtstreuung von FDSZ von B subtilis und e coli dargestellt, assembliert in Gegenwart von zwei millimolaren GTP im 50 millimolaren Kaliumchlorid-Puffer.

F-D-S-E-B-S liefert je nach pH-Wert des Puffers ein 20- bis 40-fach höheres Lichtstreusignal als FDSC EC. Interessanterweise beeinflusste eine Erhöhung der Kaliumchloridkonzentration im Puffer das Lichtstreusignal von F-D-S-Z-E-C nicht signifikant, aber das Signal von F-T-S-Z-B-S nahm bei pH 7,5 etwa 80-fach, bei pH 6,8 um das 30-fache und bei pH 6,5 bei 300 Millimolar Kaliumchlorid um das 45-fache ab, verglichen mit Puffern mit 50 Millimolar Kaliumchlorid. Die GTP-Hydrolyseaktivität von FDSZ wurde unter verschiedenen Pufferbedingungen mit einem kolorimetrischen Assay für freies Phosphat gemessen.

Es wurde festgestellt, dass die GTPS-Aktivität von FT SZ mit zunehmender Kaliumchloridkonzentration bei jedem der verschiedenen pH-Bedingungen zunimmt. Bei 50 Millimolar Kaliumchlorid war die gtpa-Aktivität aufgrund der Bündelung von F-D-S-Z-B-S-Filamenten bei 50 Millimolar reduziert. Kaliumchlorid FDSZ EEC hatte eine drei- bis sechsfach höhere GTPS-Aktivität als F-D-S-Z-B-S, da die FDSC EEC-Polymere schneller zerlegt

Schließlich wurde der Unterschied in der GTP-Hydrolyseaktivität zwischen F-D-S-Z-B-S und F-D-S-Z-E-C bei 300 Millimolar Kaliumchlorid reduziert, möglicherweise aufgrund einer reduzierten Bündelung von F-D-S-Z-B-S-Filamenten. Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Metalle wie z.B. die Elektromikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Struktur von fts-Polymeren in der Probe zu beantworten.