Visualisierung des zytoplasmatischen Flusses während der Einzelzell-Wundheilung bei Stentor coeruleus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Fluss des Zytoplasmas während der Wundheilung in einer einzelnen Zelle zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst lebende Stent- oder SEIUs-Zellen gesammelt werden, um sie als Modellsystem für zelluläre Wunden zu verwenden. Der zweite Schritt besteht darin, die Glaswerkzeuge für den Schnitt der Zellen vorzubereiten.

Anschließend werden die Stent-Sarius-Zellen auf einem maßgeschneiderten Mikroskop aufgeschnitten, das eine gleichzeitige Operation mit geringer Vergrößerung und eine hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Der letzte Schritt besteht darin, eine computergestützte Analyse der zytoplasmatischen Strömung mit Hilfe der Particle Image Velo-Symmetrie-Software durchzuführen. Letztendlich wird eine hochauflösende Bildgebung des Zytoplasmas verwendet, um die aktive Reaktion der Zellen während der Wundheilung zu zeigen.

Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen zur zellulären Wundheilung zu beantworten, z. B. ob das Zytoplasma um den Bereich eines Schnitts herum gelartig wird oder nicht, um ein Austreten in das umgebende Medium zu verhindern. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Vorbereitung und zum Schneiden der Zellhandhabung schwer zu erlernen sind, da sie manuelle Geschicklichkeit erfordern. Um mit der Gewinnung von Stent- oder Sirius-Zellen entweder aus natürlichen Pons, wie von Zahnstein beschrieben, oder von einem kommerziellen Anbieter zu erhalten, fügen Sie 300 Milliliter modifizierten Stents oder Mediums hinzu, das von Rezepturen von Zahnstein angepasst ist, und abschrecken Sie, wie in dem begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Pflegen Sie Kulturen, indem Sie sie im Dunkeln bei 20 Grad Celsius anbauen. Als nächstes züchten Sie Kulturen von Chlamydomonas Rhine Hardy Algen in Trisacetat-Phosphat-Medium. Waschen Sie die Chlamydomonas-Zellen vor der Fütterung unter Verwendung von Standardkulturmethoden, indem Sie sie vorsichtig nach unten schleudern, den Überstand entfernen und in dem modifizierten Stent oder Medium suspendieren.

Füttern Sie die 300 Milliliter Stent- oder Sarius-Kulturen bei Bedarf zwei- bis dreimal pro Woche mit etwa 30 Millionen chm-Zellen. Sammeln Sie Stents oder Zellen für die Operation. Bewegen Sie die Kultur zunächst vorsichtig, indem Sie Luft durch eine Pipettenspitze sprudeln lassen, bis sich die Zellen zu lösen beginnen und frei zu schwimmen beginnen.

Erfassen Sie dann die schwimmenden Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette, die mit einer Spitze mit breiter Öffnung ausgestattet ist, um ein Scheren der Zellen zu vermeiden. Lassen Sie die Zellen nach dem Sammeln absetzen. Pipettieren Sie dann langsam das darüber liegende Medium weg und fügen Sie frischen modifizierten Stent oder Medium hinzu.

Bereiten Sie die Glasnadeln vor, mit denen die Stentzellen geschnitten werden, indem Sie zwei Glasrührstäbe über die Fülle halten und verbrennen, bis die Enden zu schmelzen beginnen. Berühre dann die Enden der beiden Stäbe miteinander, bis das geschmolzene Glas verschmilzt. Sobald sie verschmolzen sind, nehmen Sie sie von der Flamme und lassen Sie sie ein bis zwei Sekunden abkühlen.

Ziehen Sie sie dann langsam auseinander, um einen sauberen Bruch zu machen. Im Idealfall entsteht so eine etwa ein bis zwei Zentimeter lange Nadel mit einer feinen Spitze am Ende. Wenn die resultierende Nadel suboptimal ist, brechen Sie die Spitze in die Glastaille und verwenden Sie die Stäbchen wieder.

Als nächstes bereiten Sie mit einem quadratischen Gummistempel, der mit Vaseline beschichtet ist, eine quadratische Vaseline-Wandkammer vor, indem Sie ihn in einen gläsernen Deckglas drücken. Geben Sie dann 100 Mikroliter modifizierten Stent oder Medium mit 2 % Methylcellulose in das Vaseline-Quadrat. Legen Sie den vorbereiteten Deckglas in einen Kunststoffadapter und fügen Sie dann die gewaschenen Stentzellen auf den Deckglas hinzu.

Ordnen Sie schließlich die Zellen in der Methylcellulose so an, dass sie gleichmäßig verteilt sind und nahe genug an die Oberfläche des Deckglases geschoben werden, um während der Bildgebung scharf zu sein. Legen Sie den Objektträger zunächst auf den Tisch des inversen Mikroskops. Nehmen Sie dann den Präpariermikroskopkörper von seinem Ständer und bestimmen Sie die ungefähre Position, in der er platziert werden muss, um den Objektträger bei geringer Vergrößerung von oben zu visualisieren.

Konstruieren Sie als Nächstes ein Doppeldeckermikroskop, indem Sie einen Karton mit dem gewünschten Abstand zwischen dem Okular des inversen Mikroskops und dem Präparierfernrohr hinzufügen. Kleben Sie die Box mit Laborklebeband fest, damit sie leicht entfernt werden kann Wenn das Experiment abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass sich die Probe im Sichtfeld und im Fokus befindet, ohne dass das Präparierfernrohr bewegt werden muss. Halten Sie das Präparierfernrohr nach dem Anbringen an die Box und kleben Sie es mit Laborklebeband auf die Box. Als nächstes richten Sie das inverse Mikroskop mit DIC-Optik ein, indem Sie ein 20-fach-Luftobjektiv einsetzen.

Achten Sie außerdem darauf, einen DIC-Kondensator mit großem Arbeitsabstand zu verwenden, um genügend Platz für die Durchführung der Mikrochirurgie von oben zu haben. Bringen Sie dann die Zellen mit dem inversen Mikroskop in den Fokus, wobei alles von beiden Seiten vorbereitet und scharf ist. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern mit einer Bildrate von zwei Bildern pro Sekunde mit einer 12 x fünf 12 CCD-Kamera.

Schneide dann die Zelle mit der Glasnadel ab. Erfassen Sie das anfängliche zytoplasmatische Flussmuster und beobachten Sie alle Stadien der Wundbildung und des Wundheilungsprozesses. Beenden Sie die Erfassung, wenn die Zelle wieder normal aussieht oder wieder aktive Motilität aufgenommen hat.

Laden Sie PIV Lab herunter, ein MATLAB-Paket zur Messung des zytoplasmatischen Flusses mithilfe der Particle Image Veloc-Symmetrie. Laden Sie als Nächstes den TIFF-Bildstapel für jede Videosequenz in das Particle Image Veloc Symmetry Program Within MATLAB manual. Generieren Sie manuell eine Maske für jeden Bildstapel, um Bereiche der Rohdaten außerhalb des Stentkörpers zu maskieren.

Legen Sie dann PIV Lab so fest, dass die Einstellung für die schnelle Fourier-Transformation und eine Bin-Größe von 64 x 64 Pixeln verwendet werden, wodurch die Pixel in jedem Frame in größere quadratische Pixel unterteilt werden. Führen Sie als Nächstes das PIV-Lab aus, um Kreuzkorrelationen zwischen den Pixeln in jedem Frame mit nahegelegenen Pixeln zu berechnen. Im nächsten Frame ergibt sich ein zeitabhängiger Strömungsvektor, der an jedem Biegepixel zentriert ist und die gleiche Zeitauflösung wie die Rohdaten hat.

Berechnen Sie dann die Zeitmittelwerte der resultierenden Vektorfeldausgabe, um die mit dem Stent vor dem Schneiden und während der Wundheilung aufgenommenen Daten zu vergleichen. Berechnen Sie außerdem Histogramme von Strömungsgeschwindigkeiten, um die Strömungsstärke und die Geschwindigkeitsänderung an einem bestimmten Pixel im Laufe der Zeit zu untersuchen und so die Strömungsschwankungen zu untersuchen. Bei der Bildgebung von Sequenzen, bei denen der Stent oder die Zelle in zwei Hälften gespalten ist, berechnen Sie den Gesamtfluss des Zytoplasmas zurück in den eigentlichen Zellkörper, indem Sie die durchschnittliche Strömungsgeschwindigkeit mit der Querschnittsfläche der extrazellulären Zytoplasma-Blasenbasis multiplizieren.

Hier ist eine Live-Bildgebung eines Stents oder einer Zelle zu sehen, wie sie mit einer Glasnadel geschnitten und durchtrennt wird. Nach dem Schneiden wurde eine beträchtliche Menge Zytoplasma aus dem Hauptzellkörper entnommen, aber es fließt schnell wieder in die Zelle zurück. Im Anschluss an dieses Verfahren können chemische Inhibitoren hinzugefügt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Komponenten des Zytoskeletts zur zytoplasmatischen Bewegung während des Stents oder der Wundheilung beitragen könnten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Werkzeuge zum Schneiden von Stents in unsere Zellen vorbereiten und wie Sie den zytoplasmatischen Fluss während des Schnitt- und Wundheilungsprozesses innerhalb der einzelnen Riesenzelle abbilden.