Etablierung der minimalen bakteriziden Konzentration eines antimikrobiellen Mittels für planktonische Zellen (MBC-P) und Biofilmzellen (MBC-B)

Dieses Verfahren vergleicht direkt die Plankton- und Biofilmresistenz für einen Bakterienstamm, der einen Biofilm bilden kann. Etablieren Sie zunächst einen Biofilm, füllen Sie das Medium auf und wenden Sie eine serielle Verdünnung des antimikrobiellen Mittels Ihrer Wahl an. Lassen Sie die Zellen dann in frischem, mittlerem Medium sich erholen.

Prüfen Sie nun die Lebensfähigkeit der Zellen durch Plattieren auf der LB-Schnecke. Letztendlich wird die Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration von Plankton- und Biofilmzellen verwendet, um die Erhöhung der Resistenz zu zeigen, die sich aus dem Wachstum eines Biofilms ergibt. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, weil sie benachbarte Brunnen kontaminieren oder die Zacken des mehrzackigen Geräts nicht ausreichend abkühlen lassen, damit sie die Bakterien nicht abtöten.

Kultur, der Wildtyp und mutierte Bakterienstamm wird 16 Stunden lang in einem reichhaltigen Medium bei 37 Grad Celsius kultiviert, die gesättigten Übernachtkulturen werden in ein frisches Medium wie M 63, minimales Medium, ergänzt mit Magnesium, Sulfat und Arginin, verdünnt. Dann Eloqua. 100 Mikroliter pro Vertiefung.

Jedem Stamm werden 24 Vertiefungen zugeteilt und 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Als nächstes werden 10 x Stammlösungen einer Verdünnungsreihe von Antibiotika für sieben Vertiefungen hergestellt und auf Eis gelagert. Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette den verbrauchten Überstand, der Planktonzellen enthält.

Geben Sie dann 90 Mikroliter M 63 in alle Vertiefungen und fügen Sie 10 Mikroliter der entsprechenden antibiotischen Stammlösung zu der Antibiotika-Kontrolle hinzu. Nun, für jedes Replikat und jeden Stamm fügst Du 10 Mikroliter Wasser hinzu. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette den verbrauchten Überstand, der Planktonzellen enthält. Geben Sie 115 Mikroliter M 63 in alle Vertiefungen und züchten Sie die Kulturen 24 Stunden lang weiter. Bei 37 Grad Celsius.

Beschriften Sie ein Pfund Schneckenplatte pro Hälfte 96. Well Mikrotiterplatte zum Sterilisieren des mehrzackigen Geräts, tauchen Sie es in 100%Ethanol und führen Sie die Zinken über die offene Flamme eines Bunsenbrenners. Die Zacken etwas abkühlen lassen.

Mit den Spitzen der Zinken. Übertragen Sie die Planktonkultur aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte auf die Oberfläche einer LB-Schneckenplatte. Stellen Sie die LB-Schneckenplatten 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf.

Bestimmen Sie dann visuell den Grenzwert für das Bakterienwachstum, indem Sie die minimale bakterizide Konzentration der Antibiotikakultur, des Wildtyps und des mutierten Bakterienstamms 16 Stunden lang in einem reichhaltigen Medium bei 37 Grad Celsius aufhalten und die gesättigten Übernachtkulturen eins bis 100 in frisches Medium für Antibiotikaresistenztests in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterschale verdünnen. Fügen Sie 90 Mikroliter der bakteriellen Verdünnung hinzu. Nun werden die planktonischen Zellen einem Konzentrationsgradienten von Antibiotikum ausgesetzt.

Beginnen Sie mit 10 x Stammlösungen einer Verdünnungsreihe von Antibiotika wie Tobramycinmycin. Fügen Sie 10 Mikroliter der Antibiotika-Stiele gemäß dem Versuchsplan hinzu. Geben Sie dann 10 Mikroliter Wasser in die Antibiotika-Kontrollvertiefungen für jedes Replikat und jeden Stamm

Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um auf lebende Zellen zu testen. Beginnen Sie mit der Beschriftung einer LB-Schneckenplatte für jede Hälfte einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Sterilisieren Sie das mehrgleisige Gerät, indem Sie es mit 100% Ethanol beflammen.

Wiederholen Sie den Vorgang einmal. Übertragen Sie dann mit dem mehrpoligen Gerät etwa drei Mikroliter Planktonkultur aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte auf die Oberfläche einer LB-Schneckenplatte. Inkubieren Sie die Platten 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Bestimmen Sie dann die minimale bakterizide Konzentration des Antibiotikums, indem Sie mit dem Auge den Grenzwert für das Bakterienwachstum identifizieren. In diesem Experiment wurden die beiden unterschiedlichen minimalen BACTERICID-Konzentrationsassays verwendet, um die Sensitivität des PA 14-Wildtyps mit einem mutierten Stamm zu vergleichen, dem die Antibiotikaresistenz fehlt. Gen NDVB.

Hier wurden die minimalen bakteriziden Konzentrationen des Antibiotikums Tobramycin für den Biofilm gemessen. Der MBCB-Wert für PA 14 beträgt 100 Mikrogramm pro Milliliter im Vergleich zu 12,5 Mikrogramm pro Milliliter für die Mutante. Im Gegensatz dazu betrug die minimale bakterizide Konzentration von Tobramycin für die Planktonzellen acht Mikrogramm pro Milliliter sowohl für den PA-14-Wildtyp als auch für die Mutante.

Einmal gemeistert, kann das NBCB in etwa einer Stunde absolviert werden, aufgeteilt auf fünf Tage.