Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in
4. Februar 2014
Ansätze zum Testen der Wirkung von Neuroleptika (APD) in Caenorhabditis elegans gezeigt werden. Die Tests werden für die Prüfung Arzneimittelwirkungen auf die Entwicklung und Lebensfähigkeit und Rachenpumprate beschrieben. Diese Methoden sind auch für pharmakogenetische Versuche mit anderen als APDs Medikamentenklassen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung von Antipsychotika auf die Entwicklung und das pharyngeale Pumpen von Seeelgan zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Population adulter Nematoden gezüchtet und aus ihnen eine synchronisierte Population von Tieren erzeugt wird. Der nächste Schritt besteht darin, synchronisierte Eizellen oder adulte Tiere auf mit Medikamenten versetzte Assay-Platten zu übertragen.
Der letzte Schritt besteht darin, die Auswirkungen der Medikamente auf die Würmer zu beobachten und zu bewerten. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, dass Antipsychotika die Entwicklung verzögern und das Rachenpumpen bei arzneimittelexponierten Tieren hemmen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Wirkmechanismen von Antipsychotika geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer kleiner Moleküle und sogar großer Moleküle wie Lipide angewendet werden. Haben Sie ein Medikament von Interesse mit einer bekannten Arbeitskonzentration bereit.
Beginnen Sie damit, eine 12-Well-Platte mit zwei Millilitern NGM zu beladen, Medium pro Well. Legen Sie die Platte zum Aushärten bei Raumtemperatur beiseite. Als nächstes wählen Sie eine Kolonie von OP 50-Bakterien aus und geben sie in eine 50-Milliliter-Flasche LB-Kultur.
Die Bakterien werden über Nacht bei 37 Grad Celsius geschüttelt und am nächsten Tag bei 220 U/min in jede Vertiefung der vorbereiteten Platte geschüttelt. Bei 20 Mikrolitern der Bakterienkultur stellen Sie die Platte so ein, dass sie am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Beladen Sie jeden gut sitzenden mit 80 Mikrolitern des interessierenden Arzneimittels in der Arbeitskonzentration.
In diesem Fall ist das Medikament C Clozapin. Achten Sie darauf, die Lösung vor der Einnahme von Aliquoten zu wirbeln. Schwenken Sie die Lösung, um sie gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur einziehen, während der Plattendeckel abgenommen wird.
Fahren Sie dann mit dem Assay fort oder lagern Sie die Platte über Nacht bei 20 Grad Celsius und beginnen Sie den Assay am nächsten Tag. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Eiern aus dem gewünschten Genotyp. Beginnen Sie mit einer Population von Würmern mit vielen GR-Erwachsenen.
Die Würmer in einer 3,5 cm großen Platte mit M neun Puffer abwaschen. Dann schleudern Sie sie in einer 15-Milliliter-Tube bei 2000 U/min eine Minute lang herunter. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration und ersetzen Sie ihn durch fünf Milliliter Bleichmittel.
Unterbrechen Sie dann die erwachsenen Tiere vorsichtig, indem Sie die Röhre umdrehen und warten, bis sich die Tiere kontinuierlich aufzulösen beginnen. Beobachten Sie die sich auflösenden Würmer unter dem Zielfernrohr. Wenn sich etwa die Hälfte der Würmer aufgelöst hat.
Nach etwa fünf Minuten drehen Sie das Röhrchen herunter, um die Eier zu sammeln, saugen Sie den Überstand ab und ersetzen Sie ihn schnell durch M neun Puffer. Schleudern Sie dann das Röhrchen wieder wie bisher nach unten und entfernen Sie alle bis auf etwa 100 Mikroliter des Überstands M neun. Um die Eier aufzuhängen, wirbeln Sie die Röhre ein.
Übertragen Sie dann zwei Mikroliter der Suspension auf eine NGM-Platte und zählen Sie die Anzahl der übertragenen Eizellen. Beladen Sie dann die mit dem Medikament behandelte Platte mit 30 bis 35 Eiern pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Nach 24 Stunden wird die Anzahl der ausgebrüteten Eier bewertet.
Wenn mehr als 25 Würmer in einem vorhanden sind, entfernen Sie die überschüssigen Würmer gut. Bringen Sie die Würmer auf der Platte zur späteren Beobachtung jeden Tag in 24-Stunden-Intervalle in den Inkubator zurück und bewerten Sie das Entwicklungsstadium der Würmer in den Vertiefungen basierend auf der Größe der Würmer und der Form ihrer Vulven. Robuste Effekte sind in der Regel am dritten und vierten Tag zu beobachten.
Das Experiment sollte etwa eine Woche dauern. Für dieses Protokoll haben Sie, wie zuvor beschrieben, Drogentestplatten vorbereitet, um den Assay zu starten. Für jeden Genotyp im Versuch werden 50 l Tiere in vier Stadien ausgewählt.
Übertragen Sie sie auf NGM-Platten und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Beladen Sie am nächsten Tag alle 15 bis 20 Minuten eine Testvertiefung mit 10 Tieren, nachdem eine Gruppe eine halbe Stunde lang dem Medikament ausgesetzt war. Beginne, das Pumpen des Rachens unter einem Präpariermikroskop zu beobachten.
Finde zuerst einen Wurm und zähle dann 20 Sekunden lang seine Rachenpumpen. Sobald er gekerbt ist, nimm den Wurm vom Teller. Alle Würmer in der Mulde auf die gleiche Weise einritzen.
Die erwarteten Ergebnisse der Durchführung der experimentellen Verzögerung. Letalitätstests mit Wildtyp-Kontrollen sollten zeigen, dass sich Tiere, die C-Clozapin ausgesetzt waren, im Gegensatz zur typischen Wachstumsrate bis zum ernsten, adulten Stadium noch in den jungen Larvenstadien befinden oder tot sind. Der Test von Mutanten auf unterschiedliche Clozapin-Konzentrationen ergab Suppressormutanten wie Mute One und Enhancer-Mutanten wie MU 2. Allgemein war die Letalität von Mute One niedriger als die des Wildtyps, und die Letalität von MU Two war höher als erwartet im Vergleich zu den Kontrolltieren, die überlebende Mute One Tiere besser entwickeln können, während Mute Two Überlebende verzögerter sind.
Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Exposition mit Clozapin die pharyngealen Pumpraten konzentrationsabhängig reduzierte. Die verringerte Rate des Stummen eins war jedoch geringer als die des Wildtyps, während die verringerte Rate des Stummen zwei größer war als die des Wildtyps. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Antipsychotika-Assay in kleinem Maßstab durchführen.
Die Botschaft kann auch skaliert werden, um ein groß angelegtes genetisches Screening durchzuführen.
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Übersicht
Dieser Artikel zeigt Methoden zur Untersuchung der Wirkungen von Antipsychotika (APDs) an Caenorhabditis elegans auf. Die Methoden umfassen Tests zur Bewertung der Arzneimittelwirkungen auf Entwicklung, Überlebensfähigkeit und Pharynxpumpfrequenz.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Pharmakologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Caenorhabditis elegans ist ein Modellorganismus, der zur Untersuchung von Arzneimittelwirkungen verwendet wird.
- Antipsychotische Arzneimittel können Entwicklungsprozesse beeinflussen.
- Das pharyngeale Pumpen ist ein entscheidendes Verhalten zur Beurteilung der Arzneimittelwirkung.
- Mithilfe dieser Methoden können pharmakogenetische Experimente durchgeführt werden.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wirkung von Antipsychotika auf die Entwicklung von Nematoden.
- Beurteilung des Einflusses dieser Arzneimittel auf die Raten der pharyngealen Pumpbewegungen.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Wirkmechanismen von Antipsychotika (APDs).
Verwendete Methoden
- Züchten Sie eine Population erwachsener Caenorhabditis elegans.
- Erzeugen Sie eine synchronisierte Population aus erwachsenen Nematoden.
- Überführen Sie synchronisierte Eier oder erwachsene Tiere auf Testplatten mit medikamentösen Zusätzen.
- Beobachten und bewerten Sie die Wirkungen der Medikamente auf Entwicklung und Verhalten.
Hauptergebnisse
- Antipsychotische Arzneimittel verzögern die Entwicklung exponierter Nematoden.
- Das pharyngeale Pumpen wird bei mit Arzneimitteln behandelten Tieren gehemmt.
- Die Ergebnisse können zum Verständnis der Wirkmechanismen von Arzneimitteln beitragen.
- Die Methoden sind auf andere kleine und große Moleküle anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet einen Rahmen für die Untersuchung von Arzneimittelwirkungen in C. elegans.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können auf verschiedene pharmakologische Studien übertragen werden.
- Diese Methoden können für breitere Anwendungen jenseits von APDs angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Studien zu Wirkmechanismen von Antipsychotika an C. elegans ermöglichen eine frühe Entlastung von Zielstrukturen, indem phänotypische Ergebnisse mit neuromolekularen Wegen verknüpft werden. Die Entwicklungs- und Pharynxpump-Assays liefern quantitative, skalierbare Messgrößen zur Untersuchung des Wirkmechanismus in der Entdeckungsbiologie. Dies unterstützt die Vorhersagegenauigkeit bei der Zielstrukturvalidierung und der Portfolioauswahl für neuropsychiatrische Indikationen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersuchung therapeutischer Hypothesen durch Verknüpfung der Exposition gegenüber Antipsychotika mit Entwicklungsverzögerung und pharyngealen Inhibitionsphänotypen.
- Operationaler Wert: Funktionelle Zielstrukturvalidierung ermöglichen durch genetische Suppressor- und Enhancer-Screens zur Identifizierung von Modulatoren der Arzneimittelwirkung.
- Prädiktiver Wert: Mechanistische Entlastung unterstützen, indem konzentrationsabhängige Effekte auf konservierte neuromuskuläre Ausgangssignale aufgedeckt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Untersuchung vorbereiten, indem synchronisierte Embryonen und stadiengerecht präparierte adulte Organismen verwendet werden.
- Operationaler Wert: Standardisierung von Assays durch tägliche Entwicklungsbewertung und Protokolle zur Zählung der pharyngealen Pumpleistung innerhalb von 20 Sekunden sicherstellen.
- Skalierbarkeitswert: Bereitschaft für Hochdurchsatz-Screenings und Wiederverwendung der Plattform für die Untersuchung kleiner und großer Moleküle über Antipsychotika hinaus hervorheben.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Nutzen: Erläutern Sie die Krankheitsrelevanz anhand konservierter Gene für die Neurotransmitterbiosynthese und synaptische Funktion im C. elegans-Genom.
- Vorklinische Kontinuität: Beschreiben Sie die Kontinuität von der Entdeckung bis zur phänotypischen Validierung in einem ganzorganismischen, krankheitsrelevanten System.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Erörtern Sie mechanismenbasierte Go/No-Go-Entscheidungen unter Verwendung von Entwicklungstotalität und Hemmung der Pumpfrequenz als Wirksamkeits-Biomarker.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode verortet Studien zu Wirkmechanismen von Antipsychotika in der frühen Entdeckungsphase bis hin zur Identifizierung von Leitverbindungen und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die Aufklärung von Signalwegen in der Neuropharmakologie.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutern Sie, wie die Methode die Hypothesenprüfung durch Entwicklungsstadien-Einstufung und Quantifizierung des pharyngealen Pumpens unterstützt.
- Screening: Beschreiben Sie die Bereitschaft des Assays anhand der synchronisierten Übertragung von Eiern auf mit Wirkstoffen versetzte Platten und der täglichen phänotypischen Bewertung.
- Analytik: Heben Sie quantitative Ergebnisse hervor, einschließlich der Bewertung des Entwicklungsstadiums und der Anzahl pharyngealer Pumpvorgänge pro Zeiteinheit für den Vergleich zwischen Versuchsbedingungen.
- Translationale Forschung: Verbinden Sie die Methode mit der präklinischen Kontinuität über konservierte neuromuskuläre Phänotypen, die auf den Wirkmechanismus von Wirkstoffen schließen lassen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellen Sie die Methode als wiederverwendbares Verfahren für Wirkmechanismus-Studien über verschiedene therapeutische Bereiche hinweg dar, das genetische und chemische Screenings nutzt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch phänotypische Verankerung antipsychotischer Wirkungen an der neuromuskulären Funktion.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch synchronisierte Populationen und definierte Bewertungsintervalle für Entwicklung und Verhalten.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unklarheiten beim frühen antipsychotischen Screening.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung unter Verwendung von Entwicklungsverzögerung und pharyngealer Hemmung als übertragbare biomarkerbasierte Endpunkte.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige Fachkenntnisse umfassen die Kultur von Nematoden, deren Synchronisierung sowie die phänotypische Bewertung mittels Auflichtmikroskopie.
- Zu den erforderlichen Geräten gehören Inkubatoren, Mikroskope und Systeme zur Wirkstoffdosierung für Assays in 12-Loch-Platten.
- Die Standardisierung über Teamgrenzen hinweg erfordert gemeinsame Protokolle für die Eizubereitung, die Wirkstoffapplikation auf Platten sowie Kriterien zur Entwicklungsstadieneinteilung.
- Anpassungsüberlegungen bei verschiedenen Modellsystemen beinhalten die Erhaltung von Neurotransmitter-Zielen und die Skalierung der Assays für hochdurchsatzfähigere Formate.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Assaydauer von etwa einer Woche sowie die Empfindlichkeit gegenüber der Qualität des Bakterienrasens, die die Gesundheit der Würmer beeinflusst.
