Induktion von Invasive Transitional Handy Blasenkarzinom in Immune intakte menschliche MUC1 transgenen Mäusen: Ein Modell für Immuntherapie Entwicklung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine zytotoxische T-Lymphozyten-Antwort effektiv zu induzieren, die auf ein tumorassoziiertes Antigen bei Blasenkrebs abzielt. Dies wird durch die Induktion von Blasenkrebs bei Mäusen erreicht, die das humane tumorassoziierte Antigen Mach One exprimieren. Als nächstes wird den Mäusen ein Peptidimpfstoff injiziert und eine Mach-Eins-spezifische zytotoxische T-Lymphozytenantwort erzeugt.

Dann werden der Serumtumor und die Milz isoliert und das Gewebe auf Zytokine, Antigene bzw. Immunantwort analysiert. Die Verwendung von Western-Blot-Multiplex, fluormetrischen Mikrobeads, Immunassay-Immunhistochemie und einer Live-Spot-Analyse ermöglicht es uns, die Wirksamkeit eines Peptidimpfstoffs gegen Blasenkrebs zu testen. Hallo, ich bin Dr. Gregory Wetz, Forscher am Davis Health System der University of California in Sacramento, Kalifornien.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Xenotransplantaten besteht darin, dass Xenotransplantate immungeschwächte Wirte benötigen, während unser Modell eine immunintakte transgene Maus verwendet, die ein humanes tumorassoziiertes Antigen exprimiert, das das Ziel des Peptidimpfstoffs ist. Die Techniken werden mit mir von Daniel V und den Doktoren Chaga und Audrey Gutierrez, die alle Forschungskollegen sind, sowie dem Labor von Dr. Michael de Gregorio und dem UC Davis Health System demonstriert. Bevor Sie die erste Dosis von N-Butyl, N-4-Hydroxy, Butyl-NITROSAMIN oder O-H-B-B-N verabreichen, um Blasenkrebs auszulösen, führen Sie bei jeder Maus eine submandibuläre Blutung durch, um Vollblut und Blutgerinnungsröhrchen zu sammeln, und lassen Sie das Blut 30 Minuten lang gerinnen.

Beginnen Sie mit acht Wochen mit 20-Gauge-Sondennadeln aus Edelstahl und verabreichen Sie den O-H-V-B-N 12 Wochen lang an fünf Tagen pro Woche oral. Verwenden Sie in Woche 20 600 Mikroliter 0,9% sterile Kochsalzlösung, um jedes Fläschchen mit lyophilisiertem Peptidimpfstoff zu rekonstituieren, und resuspendieren Sie gründlich, indem Sie die Lösung sechsmal mit Kochsalzlösung durch eine 0,5-Zoll-Nadel mit 27 Gauge ziehen. Passen Sie die Konzentration so an, dass die gewünschte Dosis in einem Volumen von 100 Mikrolitern nach der letzten Dosis O-H-B-B-N verabreicht wird, und verabreichen Sie den Impfstoff wöchentlich für einen Zyklus von acht Wochen, indem Sie acht Wochen nach der letzten Dosis von O-H-B-B-N eine 25-Gauge-Nadel verwenden, um 100 Mikroliter des Impfstoffs zu injizieren.

Nachdem Sie alle Mäuse durch Kohlendioxid-Erstickung eingeschläfert haben, legen Sie jede Maus auf ein Sezierbrett und stecken Sie alle vier Gliedmaßen fest. Machen Sie anschließend mit einer Zange und einer Schere einen horizontalen Schnitt in der oberen Bauchregion. Führen Sie die Schere in den Schnitt zwischen Epidermisschicht und Bauchdecke ein und trennen Sie mit Hilfe einer Pinzette sanft die Haut vom darunterliegenden Gewebe.

Machen Sie einen vertikalen Schnitt vom horizontalen Schnitt entlang der Mittelachse zum vorderen Ende der Maus. Trennen Sie dann die Haut vom Brustkorb und stechen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 22-Gauge-Nadel in das Herz und sammeln Sie Blut mit einem gleichmäßigen und gleichmäßigen Zug mit Pinzette und Schere. Schneiden Sie den Rest der Epidermisschicht in einer biologischen Sicherheitswerkbank ab und schälen Sie sie zurück.

Schneiden Sie durch die Bauchdecke und das Bauchfell und aseptisch. Entfernen Sie den Blasentumor für die Immunhistochemie oder IHC und Western Blot für IHC. Legen Sie die Blasentumorprobe in eine Gewebekassette und fixieren Sie sie über Nacht in gekühlter Form.

Entnehmen Sie bei Raumtemperatur die Milz für die Analyse der Zellviabilität und einen Lie-Spot für die Durchführung des Multiplex-Fluorfluor-Immunoassays. Verwenden Sie 200 Mikroliter Assay-Puffer zum Vorbefeuchten. Eine 96-Well-Filterbodenplatte, die es dem Filter ermöglicht, vollständig einzuweichen.

Verwenden Sie dann ein 96-Well-Plattenvakuumgerät, um den Filter vorsichtig zu entleeren, und verwenden Sie Papiertücher, um den Boden der Platte mit einer Mehrkanalpipette bluttrocken zu machen: Pipettieren Sie 25 Mikroliter Serummatrix in die Vertiefungen, die für die Leerproben und Standards vorgesehen sind, und pipettieren Sie 25 Mikroliter Assay-Puffer in die Vertiefungen, die für die Kontrollen und Unbekannten zugewiesen sind. Als nächstes pipettieren Sie 25 Mikroliter der Blindstandards, Kontrollen und Unbekannten in die jeweils zugewiesenen Wells. Die Perlenmischung 20 Sekunden lang vorziehen und in ein Reservoir geben.

Pipettieren Sie dann jeweils 25 Mikroliter der Perlenmischung hinein. Decken Sie die Platte gut ab, um sie vor Licht zu schützen, und schütteln Sie die Platte auf einem Shaker bei 500 U/min zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, lassen Sie die Platte ab und waschen Sie sie mit 200 Mikrolitern PBST zweimal, bevor Sie sie abtropfen lassen und trocken tupfen. Zur Herstellung der Nachweisantikörperlösung die erforderliche Menge an 0,1 % PBST und Nachweisantikörper in einem 15-Milliliter-Röhrchen kombinieren und 10 Sekunden lang vortexen.

Pipettieren Sie dann jeweils 25 Mikroliter hinein. Schütteln Sie die Platte bei 500 U/min eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Dann die Platte abtropfen lassen und mit 200 Mikrolitern 0,1 % PBST zweimal abgießen und trocken pipettieren und jeweils 25 Mikroliter der frisch zubereiteten Streptokokken, AVID und FICO eryn oder SAPE trocken tupfen, die Platte gut auf den Plattenschüttler legen und 30 Minuten bei Raumtemperatur bei 500 U/min inkubieren.

Abgießen und zweimal mit PBST waschen. Um die Kügelchen zu suspendieren, geben Sie 100 Mikroliter 0,1 % PBST in jede Vertiefung und schütteln Sie sie mindestens zwei Minuten lang bei 500 U/min. Verwenden Sie die Luminex LX 200 Maschine, um die Platte in einer biologischen Sicherheitswerkbank zu lesen und zu analysieren.

Verarbeiten Sie die Milz der Maus durch 100 Mikrometer große Nylongewebesiebe in sterilen Petrischalen zu fünf Millilitern sterilem PBS. Schichten Sie die PLE-Aytes auf drei Milliliter Lymphozyten-Trennmedium in sterilen 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 600 GS für 15 Minuten.

Um die Lymphozyten von den roten Blutkörperchen zu trennen, werden die geschichteten Lymphozyten oberhalb des Gradienten in neue sterile 15-Milliliter-Röhrchen in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss überführt. Verwenden Sie das Countin-Viabilitätsreagenz, um eine serielle Verdünnung der Lymphozyten vorzunehmen. Analysieren Sie dann auf der Muse.

Bereiten Sie eine Plattenkarte der Proben und Bedingungen für die ally Spot-Platte vor, indem Sie die Platte gemäß dem Protokoll des Herstellers vorbereiten und jeweils 100 Mikroliter Medium Peptid oder Scramble Peptid in jede pipettieren. Nun, fügen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für den ALI-Spot-Assay und verwenden Sie das Dissektionsmikroskop, um die entwickelte Aly-Spot-Platte zu analysieren.

Quantifizieren Sie die Ergebnisse, indem Sie die Anzahl der farbigen Flecken zählen, die jedem Analyten in jeder Vertiefung entsprechen. Die Spots entsprechen der Anzahl der fleckenbildenden Zellen in jeder Vertiefung in unserem transgenen Mausmodell: Induktion mit der Chemikalie Karzinogen. O-H-B-B-N führte zu einer hohen Rate an Blasenkrebserkrankungen mit überwiegend Übergangszellkarzinomen oder TCC mit einigen Plattenepithelkarzinomen oder SCC, die dem Blasenkrebs beim Menschen ähneln, wie in dieser Abbildung gezeigt.

Acht Wochen nach O-H-B-B-N-Induktion betrug die Inzidenzrate von Blasenkrebs sowohl bei Mach-1-Transgen- oder TG- als auch bei Wildtyp-Mäusen 67 %Hämatin- und Eosin-Färbung bestätigte das Vorhandensein von TCCs und SCCs, wobei TCCs in einem Verhältnis von zwei zu eins vorherrschten. Unter diesen beobachteten wir eine Reihe von niedrig- und hochgradigen nicht-invasiven bis hochgradigen invasiven Tumoren. Alle Mach-Eins-Blasenkrebsproben waren positiv für die Mach-Eins-Expression durch IHC.

Während der Modellentwicklung wurden die Serumspiegel von inflammatorischen Zytokinen seriell zwischen der achten und der 28. Woche überwacht. Wir beobachteten, dass die inflammatorischen Zytokinspiegel im Laufe der Zeit von der Induktion bis zum Ende der Studie anstiegen. Dieses Zytokinmuster ist dem, was wir zuvor in unserem Lungenkrebsmodell beobachtet haben, sehr ähnlich, was stark darauf hindeutet, dass ein Anstieg der entzündlichen Zytokinspiegel mit der Tumorentwicklung korrelieren könnte.

Um die Reaktion des Serumzytokins auf den Peptidimpfstoff zu beurteilen, wurden 15 geimpfte und 14 mit Placebo behandelte Mach One TG-Mäuse euthanasiert und am Ende der Studie 24 Stunden nach der letzten Impfung Blut entnommen. Die Multiplex-Analyse zeigt erhöhte Serumzytokinspiegel von TNF, Alpha-Interferon, Gamma-IL, IL zwei, IL 12 und IL 17 in der Impfstoffgruppe.

Im Vergleich zur Placebogruppe waren die Spiegel von TNF, alpha-Interferon, gamma und IL 17 bei den mit dem Impfstoff behandelten Mäusen signifikant höher. Diese Ergebnisse deuten auf eine th one polarisierte Zytokinantwort auf den Peptidimpfstoff hin, um die TH eins, TH zwei Immunantwort auf den Peptidimpfstoff zu bewerten. SP-Zyten wurden durch Interferon-Gamma-IL-Vier-ALI-Spot bewertet, der hier gezeigt wird, ist eine Bewertung isolierter Lymphozyten auf Lebensfähigkeit nach dem Aussäen von ALI-Spot-Platten mit lebensfähigen Lymphozyten, die Ergebnisse in diesem Experiment waren eine klare und spezifische Interferon-Gamma-Antwort auf das Peptid, die die TH-Immunantwort auf den Peptid-Impfstoff nach seiner Entwicklung bestätigt.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Krebsimmunologie den Weg, um neue Immuntherapeutika unter Verwendung eines präklinischen Modells für fortgeschrittenen Blasenkrebs zu erforschen.