Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktion des Transkriptionsfaktors NF kappa B im erwachsenen Gehirn zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst transgene Mäuse gezüchtet werden, die spezifisch die NF-Kappa-B-Aktivität in Neuronen hemmen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Verhaltenskonsequenzen der NF kappa B-Hemmung anhand des räumlichen Musters, der Trennung oder des Stalllabyrinths zu testen.

Der dritte Schritt ist die sorgfältige Vermehrung der Tiere, die Entfernung der Gehirne und die richtige Teilung derselben. Der letzte Schritt besteht in der Analyse histologischer und struktureller Effekte, wie z.B. der Visualisierung von moosigen Faserprojektionen durch Immunfärbung. Letztendlich kann die Verwendung des Verhaltenstests, gefolgt von der Histologie, Veränderungen des vom Gyrus dentatus abhängigen Lernens mit strukturellen Veränderungen in assoziierten Geweben korrelieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Mars Vase besteht darin, dass räumliche Mustertrennungsbindungen MA die Möglichkeit bieten, anti-kindliche Lernprozesse sowie Neurodegeneration und Regeneration in diesem Hirnbereich spezifisch zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der adulten Neurogenese zu beantworten, wie z.B. das Lernen als spezielle Mustertrennung. Die Demonstration des Labyrinths wird von Angela Kula, einer Technikerin aus meinem Labor, durchgeführt.

Die Perfusion wird von Peter Hyman, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter, vorgestellt. Dann wird das Schneiden von Gehirnen von Ulrich KA, Techniker, gezeigt. Und schließlich wird die konfokale Rastermikroskopie von Jeanine Muah, einer Doktorandin meines Labors Perform out the spatial pattern separation, vorgestellt.

Barnes Maze Verhaltenstests nach internationalen und lokalen Richtlinien. Für diesen Assay ist es wichtig, nur männliche Mäuse zu verwenden, die mindestens sechs Monate alt sind. Bei jeder Versuchsreihe müssen die Tiere innerhalb von vier Tagen alt sein, und ein und derselbe Bediener sollte alle Tests vor der Prüfung durchführen.

Die Mäuse sollten mit einer Standarddiät gefüttert werden, damit sie durch süße Nahrung motiviert werden. Um den Test einzurichten, besorgen Sie sich zunächst eine weiße Platte aus Hartplastik mit einem Durchmesser von 120 Zentimetern. Die zusätzlichen Labyrinth-Queues können aus verschiedenen Materialien bestehen und unterschiedliche Formen haben.

Wichtig ist, dass sie einen hohen Kontrast aufweisen müssen, um von den Laufrädern der Tiere eindeutig erkannt zu werden. Leitern und Tunnel sind allesamt gute Hinweise. Positionieren Sie die Platte unter mehreren Neon-Leuchtstofflampen, die mäßig stark sind, damit die Mäuse motiviert sind, das Licht zu verlassen.

Der Raum muss feuchtigkeitskontrolliert und konstant 22 Grad Celsius haben. Richten Sie nun das Video-Tracking-System ein. Positionieren Sie die Kamera 115 Zentimeter über der Mitte der Platte.

Befestigen Sie als Nächstes mehrfarbige zusätzliche Labyrinth-Queues an einem weißen Tuch, das auf die Platte passt. Positioniere sie so in der Mitte des Tuchs, dass sie für die Tiere gut sichtbar sind. Reinigen Sie nun die Platte vorsichtig mit dem Schnelldesinfektionsmittel, das den Geruch aus dem Versuchsaufbau entfernen kann.

Sieben identische gelbe Imbisshäuser auf den weißen Teller legen. Ihre Positionen sollten einen Tag vor Beginn der Tests eindeutig markiert werden, gewöhnen Sie jede Maus an die Scheibe. Platzieren Sie süße Lebensmittelpellet-Belohnungen wie eine geviertelte Fruchtschleife in jedem der sieben Lebensmittelhäuser für die Wohnprobe.

Setzen Sie jede Maus auf den Startpunkt der Platte und lassen Sie sie 10 Minuten lang erkunden. Nehmen Sie diese Erkundung zwischen Mäusen auf. Reinigen Sie die runde Platte und die Futterhäuser mit Schnelldesinfektionsmittel.

Fülle auch die Nahrungsbelohnungen auf. Führen Sie an den nächsten sieben aufeinanderfolgenden Tagen die Testversuche für die Tests durch. Bis auf eines ist das gesamte Haus für das gesamte Experiment mit transparentem Klebeband verschlossen.

Es ist immer das gleiche Haus. Jedes Haus ist immer noch mit einer Belohnung beladen und der Test wird wie die Gewöhnungsprobe durchgeführt. Führen Sie die Tests für jedes Tier zur gleichen Tageszeit durch, um zirkadiane Schwankungen zu vermeiden.

Analysieren Sie später die Latenz, die zurückgelegte Strecke und die Fehler anhand geeigneter Statistiken. Software definiert Fehler als Annäherung an das falsche Futterhaus oder Kontaktaufnahme mit der richtigen Box, aber nicht beim Betreten und Abrufen der Belohnung. Zum Vergleich der Gruppen wird eine bidirektionale ANOVA mit einem Bon-fer-Post-hoc-Test verwendet.

Nach der Betäubung des Tieres mit einer interperitonealen Injektion von Vertin wird es vorsichtig trans cordial mit PBS perfundiert, das Heparin und Propan enthält. Machen Sie mit einer 26-Gauge-Nadel ein Loch in den linken Ventrikel. Machen Sie auch einen Schnitt im rechten Vorhof, damit das Blut und die Perfundacht herausfließen können.

Führen Sie die Perfusionsnadel in der linken Herzkammer an der Bohrung mit einem geraden Winkel und einer Tiefe von ein bis zwei Millimetern ein. Verwenden Sie einen hydrostatischen Druck von 1,2 bis 1,4 Metern und perfundierten Sie die Maus über zwei bis vier Minuten. Folgen Sie dem Heparin und Propan mit 4% Paraldehyd in PBS für 10 bis 15 Minuten.

Die Perfusion sollte eine Rate von 15 Millilitern pro Minute haben. Sezieren Sie nun das Gehirn. Es sollte hellweiß sein und keine sichtbaren roten Blutgefäße haben.

Fixieren Sie alle gesammelten Gehirne 24 Stunden lang in 4%para Formaldehyd bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag. Kryoschutz des Gehirns in 30%Saccharose in PBS, lagern Sie es mindestens 24 Stunden später bei vier Grad Celsius.

Die Gehirne werden auf einem Kryo-Tonstadium eingefroren und in 40 Mikrometer dicke horizontale Abschnitte geschnitten. Nach der Färbung der Schnitte mit einem Antikörper für Neurofilament M können die moosigen Faserprojektionen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop bei der für den fluoreszierenden Antikörper geeigneten Wellenlänge sichtbar gemacht werden. Beginnen Sie den Scanvorgang mit geringer Vergrößerung und orientieren Sie sich an den Hippocampus- und moosbewachsenen Faserprojektionen.

Sammeln Sie dann bei höherer Vergrößerung hochauflösende Kaiserschnittscans der Moosfasern für die Analyse, um die Expression des Transgens I kappa B alpha AA one zu untersuchen. In der doppeltransgenen Maus wurden Gehirne isoliert, kryogeschnitten und mit einem Antikörper gegen konfokales GFP-Laserscanning gefärbt. Die Mikroskopie zeigte eine hohe Expression des Transgens in der CA-Region in der CA-Region, in der CA-Region-Region und in der DG, um den frühesten Zelltyp zu bestimmen, der die CAMK-, zwei alpha-getriebenen I kappa B alpha AA in der hippokampalen neurogenen Region exprimiert.

Kryo-Schnitte von Nilpferd-Campi aus I Kappa BTTA. Die Tiere wurden auf Doppelcourtin gefärbt und die transgene konfokale Analyse ergab GFP-Signale in jungen DCX-positiven Körnerzellen, die durch die Pfeile markiert sind, was auf die Induktion der Expression des Transgens durch die CAMK-2-alpha-Aktivität hinweist. Koronale Schnitte des Hippocampus von i kappa BTTA und i Kappa B minus Mäusen wurden auf Neurofilament M gefärbt, um moosige Faserprojektionen sichtbar zu machen und eine komplexe und vesikuläre Organisation in I kappa BTTA Mäusen zu zeigen.

Die moosigen Faservorsprünge waren stark beeinträchtigt. Darüber hinaus führte die Hemmung von NF kappa B zu einer signifikant reduzierten Klingendicke und einem kleineren DG-Volumen, um die möglichen Ursachen für den dramatischen strukturellen Defekt zu untersuchen. Frische, nicht fixierte Hippocampus-Schnitte von Kontroll- und I-Kappa-BTTA-Mäusen wurden mit Fluorjade C gefärbt, was den spezifischen Nachweis des neuronalen Zelltods ermöglicht.

Eine dramatisch erhöhte Anzahl degenerierter Neuriten wurde bei doppelt transgenen Tieren im Vergleich zu einfach transgenen Kontrollen beobachtet. Darüber hinaus wurde eine signifikante Zunahme von gespaltenen Capaca drei positiven Zellen bei I kappa BTTA-Mäusen festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigte die immunhistochemische Färbung gegen DCX signifikant erhöhte Mengen an DCX-positiven Zellen im Gehirn von I kappa BT-Mäusen.

Darüber hinaus waren d CX-positive Zellen in I kappa B TTA hippo Campi nicht ausschließlich in der subgranularen Zone angeordnet, sondern wurden auch in den tieferen Regionen der dg gefunden. Während die D CX-positiven Vorläuferzellen in den Kontrolltieren fast ausschließlich innerhalb der subgranularen Zone lokalisiert waren. Die erhöhte Anzahl von DCX-exprimierenden Zellen war ein Ergebnis der Reifung früherer Vorläuferzellen oder direkt aufgrund der Proliferation von DCX-positiven Zellen.

BRDU wurde intraperitoneal von i kappa BTTA und Kontrollmäusen injiziert, die dann kryoschnitten und mit DCX und BRDU gefärbt wurden, um die Proliferation zu analysieren. BRDU wurde einmal injiziert, gefolgt von einer Analyse nach 24 Stunden. Zur Analyse der Differenzierung wurden täglich drei Injektionen durchgeführt, gefolgt von einer Analyse sieben Tage nach einer einzigen BRDU-Injektion.

Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtzahl der BRDU-positiven Zellen zwischen I kappa BTTA-negativen und Kontrolltieren beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigte der Ansatz der drei seriellen Injektionen eine deutlich erhöhte Anzahl von B-R-D-U-D-C-X-positiven Zellen in der DG von I capa, BTTA. Mäuse, die an der Differenzierung oder Integration von DCX-exprimierenden Zellen gestört sind, könnten erhöhte Zellzahlen aufweisen, und Typ-3-Zellen könnten beteiligt gewesen sein, um das Verhalten der doppeltransgenen Mäuse spezifisch zu testen.

In einer GD-abhängigen Aufgabe wurde der S-P-S-B-M eingesetzt. Die I kappa B Kontrolltiere erkundeten am ersten Tag des Versuchs nacheinander die Futterhäuser. Nach sieben Tagen Training konnten die Tiere direkt das offene Futterhaus finden.

Im Gegensatz dazu erkunden die IA BTTA-Tiere auch nach dem Training reihenweise weiter die Futterhäuser. Die Beobachtung einer signifikanten Zunahme der zurückgelegten Strecken und höherer Latenzen und Fehlerraten bei den I kappa BTTA-Tieren im Vergleich zu den i Kappa B-Kontrolltieren deutet darauf hin, dass diese Tiere schwere Lerndefekte aufwiesen. Einmal etabliert, kann diese Technik in 30 Minuten pro Tier durchgeführt werden, wenn sie nach ihrer Entwicklung richtig durchgeführt wird.

Diese Technik könnte den Weg für andere Neurowissenschaftler ebnen, die sich für gyrosabhängige Aufgaben interessieren, wie z. B. die Degeneration der adulten Neurogenese oder die Regeneration bei Mäusen.