Name: Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Lernen Sie die Nahrungsergänzung mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren bei Caenorhabditis elegans. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Fettsäurefunktionen in der Entwicklung und Physiologie des Nematoden.

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Wir danken Chris Webster für die Durchführung der Vorversuche in Abbildung 3 der repräsentativen Ergebnisse und Jason Watts und Chris Webster gezeigt für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Die Finanzierung für diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Institutes of Health (USA) (R01DK074114), um JLW Verfügung gestellt. Einige Nematodenstämmen in dieser Arbeit verwendet wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, die von der NIH Office of Research Infrastructure Programme (P40 OD010440) gefördert wird.

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind empfindlich gegen Hitze, Licht und Sauerstoff. Daher muss darauf bei der Vorbereitung Fettsäure-Supplementierung Platten genommen werden, dass Fettsäuren nicht, um überschüssige Wärme und Licht ausgesetzt ist. NGM-Medium, enthaltend 0,1% Tergitol (NP-40) wird autoklaviert und teilweise abgekühlt, wonach Fettsäure Natriumsalze unter konstantem Rühren zugegeben. Die Platten können in der Dunkelheit trocknen. Aufnahme von Fettsäuren von C elegans kultiviert auf diesen Platten kann dann durch Gaschromatographie verfolgt werden. 1. Herstellung von Fettsäure Ergänzte Medien <ol><li> Messen Sie Media-Komponenten in einen entsprechend dimensionierten Kolben. Pro 1 L, fügen 17 g Bacto-Agar, 2,5 g Trypton, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol gelöst und 10 ml 10% Tergitol in Wasser gelöst. </li><li> In 80% der endgültigen gewünschten Volumen von Millipore Wasser und Autoklaven werden die Medien mit leeren Glasflaschen (gleich der Anzahl der verschiedenenFettsäure-Konzentrationen getestet werden), sowie geeignete Messzylinder. </li><li> Coole Medien in einem Wasserbad auf 55 ° C eingestellt Während die Medien ist die Kühlung bereiten den Arbeitsstammlösung des Fettsäure-Natriumsalz durch Aufbrechen der Glasfläschchen mit Sicherheitsvorkehrungen und die Gewährleistung Glaspartikel nicht zu verwechseln mit den Fettsäuren. Wiegen Sie genug Fettsäure zu 100 mm Arbeits Lager zu machen. </li><li> Bringt die Fettsäurelösung bis zu einer Endkonzentration von 100 mM mit gereinigtem Wasser. Voll Auflösen des Fettsäure-Natriumsalz dauert in der Regel ca. 20-30 min. Spülen Sie die Arbeits Lager Fettsäure mit Argon oder Stickstoff, weil der Kontakt mit einem inerten Gas verhindert die Oxidation. Verschließe das Röhrchen und lagern Sie den Arbeitsvorrat im Dunkeln, bis Medien abgekühlt ist. </li><li> (Optional) Wenn RNAi Medien gewünscht wird, messen Ampicillin und Isopropyl β-D-1-(IPTG)-Lösungen hier. </li><li> Wenn der Agar auf 55 ° C gekühlt und fügen je 1 L: 1ml 1 M MgSO 4, 1 ml 1 M CaCl 2 und 25 ml Phosphatpuffer (108,3 g KH 2 PO 4 und 35,6 g K 2 HPO 4 pro 1 L Autoklaven). Fügen Sie den Filter sterilisiert Ampicillin und IPTG-Lösungen machen, wenn RNAi-Platten. Für alle Arten von Platten, fügen sterilem Wasser, um die endgültige Medien Volumen auf 1 L. bringen </li><li> In der Nähe einer Flamme, Medien zu übertragen, um eine autoklaviert und entsprechend dimensionierten Messzylinder und fügen Sie dann warme sterilem Wasser auf das gewünschte Volumen. Übertragen Sie Medien zu den ursprünglichen Kolben und mischen durch Rühren. </li><li> In der Nähe der Flamme, übertragen Medium in einer Reihe von Flaschen gleich der Anzahl der durch Messung mit einer autoklavierten Konzentrationen getestet werden und entsprechend bemessen Messzylinder. Pflegen Sie die aliquotiert Medien als Flüssigkeit mit einem Wasserbad, bis die Fettsäure Arbeits Lager vollständig aufgelöst hat. </li><li> Legen Sie eine Flasche auf einem Aufsehen Platte und rühren, bis die Medien sich warm an, aber nicht heiß. Achten Sie darauf, sich selbst genug zu verlassenZeit, in der Fettsäure-Stammlösung rühren und Platten gießen, bevor die Medien beginnt sich zu verfestigen. Wenn rühren Platte Temperaturregelung, stellen Sie es auf 55 ° C </li><li> Verdünnen Sie die 100 mM Fettsäurearbeitsmaterial in den Medien für die gewünschte Endkonzentration. Stir Medien bis der weiße Niederschlag in der Lösung (ca. 1 min). Medien können noch leicht bewölkt danach. </li><li> (Optional) Falls RNAi Medien auf 0,1 mg / ml und 2 mM IPTG zu einer Endkonzentration gewünschten Add Ampicillin. </li><li> Gießen Sie Medien mit Hilfe eines automatisierten Pipette Hilfe und ein steriles 25 ml Pipette Zugabe von 8 ml Medium pro 60 mm-Platte oder 25 ml Medium pro 100 mm-Platte. Wiederholen Fettsäure Addition und Platte gießen Schritte für die restlichen Flaschen. </li><li> Nach dem Erstarren des Agars, decken Sie die Fettsäure-Platten, ergänzt mit einer Box oder bei Zimmertemperatur in einem gut belüfteten Schublade, um vor Licht Oxidation zu schützen. </li><li> Samen E. coli OP50 auf Platten zwei Tage nach Platten getrocknet sind.60 mm-Platten, Pipetten 300 ul einer Übernachtkultur OP50 (bei 37 º C gezüchtet). Wenn RNAi-Platten wurden gegossen, Saatgut mit 300 ul von RNAi-Bakterien nach der die Platten für vier Tage getrocknet. Platte Trocknungszeit muss möglicherweise aufgrund von Unterschieden in der Feuchtigkeit in verschiedenen Laborumgebungen angepasst werden. </li><li> Die Platten in einer dunklen Umgebung Inkubation bei Raumtemperatur, während der Bakterienrasen trocknet. </li></ol> 2. Induktion Keimzell-Zerstörung durch Ergänzung von DGLA <ol><li> C. elegans gewachsen auf Platten, die 0,3 mM DGLA (20.03 n-6) werden aufgrund der Zerstörung von Keimzellen in beiden Larvenstadium und Erwachsenen Nematoden steril. <ol><li> Bereiten Sie eine synchronisierte Bevölkerung von L1-Larven durch die Behandlung schwangeren Hermaphroditen mit alkalischen Hypochlorit-Lösung (für ein 10 ml-Lösung: 0,5 ml 5 M NaOH, 2,5 ml Haushaltsbleiche, und 7 ml H 2 O). Schütteln Sie die trächtige Hermaphroditen in dieser Lösung bis zum erwachsenen Wurms aufzulösen. Eier bleiben erhalten und können durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert werden. </li><li> Waschen Ei Zubereitung 3 mal in M9-Puffer (3 g KH 2 PO 4, 6 g Na &amp;sub2; HPO &amp;sub4;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O auf 1 L MgSO 4 In nach dem Autoklavieren). Um genügend Sauerstoff zu versorgen, zu suspendieren, die Eier in einem 15 ml Kunststoffrohr auf ein Gesamtvolumen von 5 ml M9-Puffer und Rock auf einem Schüttler über Nacht. </li><li> L1-Larven sollte zwei Tage nach der Aussaat mit OP50, oder einen Tag nach dem Ausplattieren der Bakterien an die RNAi ergänzt Platten hinzugefügt werden. Würmer Inkubation bei 20 ° C für drei Tage oder bis sie das Erwachsenenstadium erreichen. </li></ol></li><li> Erwachsene Würmer für Sterilität mit einem Binokular mit einer ausreichend hohen Vergrößerung zu entwickelnden Embryonen in der Gebärmutter zu visualisieren erzielt werden. Erfolgreiche Keimzellverlust wird als klare Leere des Uterus Eier erscheinen. </li><li> Worms kann auch durch Fixierung und Färbung mit dem Nukleinsäure eine gewertetcid Farbstoff diamindinophenylindole (DAPI), die die Visualisierung von Kernen in Keimzellen und sich entwickelnden Embryonen ermöglicht. Eine schnelle DAPI-Färbung wird durch Wahl Würmer in einem Tropfen M9 Puffer auf einem Uhrglas 9 gelöst. <ol><li> Flood Uhrglas mit 1 ml einer 0,2 ng / m. DAPI in 95% Ethanol-Lösung, lassen Sie sich für ca. 5 min. </li><li> Wählen Würmer in einen Tropfen Vectashield auf einer Folie und dann mit einem Deckglas abdecken. </li><li> Seal Deckglas und bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln für eine optimale Färbung, jedoch gleitet auch sofort eingesehen werden. Note auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Keimzellkerne mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer UV-Lampe und Filter. </li></ol></li></ol> 3. Bestätigung Fettsäureaufnahme durch Gaschromatographie Gesamtfettsäurezusammensetzung C. elegans kann durch Herstellung von Fettsäuremethylester (FAME), die dann getrennt und quantifiziert mit Gas chr bestimmt werdenomatography 4. <ol><li> Sammeln 500-1.000 erwachsenen Würmer durch Waschen aus der Platten mit Wasser und Übertragen auf den silanisierten 13 mm x 100 mm Glasschraube Oberrohr. </li><li> Lassen Würmer nieder durch die Schwerkraft, und entfernen Sie so viel Wasser wie möglich mit einer Glaspasteurpipette. </li><li> Würmer einmal mit Wasser waschen, und dann wieder entfernen, so viel Wasser wie möglich. </li><li> FAME werden durch Zugabe von 1 ml 2,5% H 2 SO 4 in Methanol, und dann Erhitzen auf 70 º C für 1 Stunde in einem Wasserbad ausgebildet. </li><li> Die Küvetten aus dem Wasserbad abkühlen und für 1 min. </li><li> Auszug FAME durch Zugabe von 1,5 ml Wasser und 0,25 ml Hexan. </li><li> Recap Rohre und kräftig schütteln. </li><li> Zentrifugenröhrchen in einer Tischklinikzentrifuge für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zu Hexan von wässrigen Lösungsmittel trennen. </li><li> Übertragen Hexan (obere Schicht) zu einem GC-Vial Einsatz in einem GC-Vial, vorsichtig zu einem der wässrigen Phase nicht zu übertragen. Für GC einnalyse wird 1-2 ul FAME in Hexan auf einer polaren Kapillar-Gaschromatographie-Säule geeignet für FAME-Analyse injiziert. Agilent 7890 GC-Injektor wird auf 250 º C eingestellt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,4 ml / min, und die GC-Ofen wird für eine Anfangstemperatur von 130 ° C, die 1 Minute lang gehalten wird, programmiert. Anschließend wird die Temperatur hochgefahren 10 ° C / min bis 190 ° C, und dann rampenförmig wieder auf 5 ° C / min bis 210 ° C und für weitere 1 min gehalten. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Aufnahme von DGLA aufgetreten FAME Analyse von Flammenionisationsdetektor (FID) oder Massenspektrometrie (MS) Detektion unter Verwendung authentischer Standards für die Identifizierung des C elegans-Fettsäuren. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Ergänzung von C. elegans mit ungesättigten Fettsäuren. Wie oben erwähnt, muß bei der Herstellung von PUFA ergänzt Platten genommen werden, da die reaktive Natur der Doppelbindungen in PUFAs bewirkt diese Fettsäuren oxidationsempfindlich sein, durch Hitze und Licht 11. Um Oxidation zu vermeiden, ist es wichtig, die PUFA zu dem flüssigen Agar-Medium hinzugefügt, nachdem das Medium auf 55 ° C und speichert Platten in einer dunklen Umgebung gekühlt. <p class="jo...

Fettsäuren sind wesentliche strukturelle Bestandteile von Membranen sowie effiziente Energiespeichermolekülen. Zusätzlich können Fettsäuren aus Zellmembranen durch Lipasen gespalten werden und enzymatisch modifiziert, um Signalisierungs Effektoren 1 herzustellen. Natürlich vorkommenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) zwei oder mehr cis-Doppelbindungen. Die Omega-3-Fettsäuren und die Omega-6-Fettsäuren sind voneinander unterscheiden, basierend auf den Positionen der Doppelbindungen in Bezug auf die Methylende der Fettsäure. Gesunde Ernährung benötigen sowohl Omega-6 und Omega-3-Fettsäuren. Allerdings sind westliche Ernährung besonders reich an Omega-6-Fettsäuren und arm an Omega-3-Fettsäuren. Eine Omega-6-zu Omega-3-Fettsäure-Verhältnis mit einem erhöhten Risiko von kardiovaskulären und entzündlichen Krankheiten, jedoch werden die genauen positiven und negativen Funktionen bestimmter Fettsäuren nicht gut verstanden 2 verbunden. Die Fadenwurm Caenorhabditis elens ist nützlich bei der Untersuchung Fettsäure-Funktion, weil sie synthetisiert alle notwendigen Enzyme, um eine Reihe von Omega-6 und Omega-3-Fettsäuren, mit einem Omega-3-Desaturase, eine Aktivität, die bei den meisten Tieren 3,4 fehlt erzeugen. Mutanten, denen Fettsäure-Desaturase-Enzyme nicht auf spezifische PUFAs produzieren, was zu einer Reihe von Entwicklungs-und neurologische Defekte 6.4. Um die physiologischen Wirkungen von Nahrungsfettsäuren zu studieren, haben wir eine biochemische Assays mit genetischen Analyse entwickelt kompatibel mit sowohl Mutante und RNAi-Knockdown-Techniken in C. elegans. Ergänzung mit spezifischen PUFAs durch Zugabe einer Fettsäure-Natriumsalz-Lösung auf die Agar-Medium vor dem Gießen erreicht. Dies resultiert in PUFA-Aufnahme durch den E. coli Nahrungsquelle, wo es in den Bakterienmembranen ansammelt. C elegans einnehmen PUFA-haltigen Bakterien, und diese Nahrungsergänzung ist ausreichend, um die schad rettents von PUFA-defizienten Mutanten. Ergänzung der meisten Fettsäuren hat keine nachteiligen Auswirkungen auf Wildtyp-Tiere, jedoch bestimmte Omega-6-Fettsäuren, insbesondere Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA 20:3 n-6) zu einer dauerhaften Zerstörung von C. elegans Keimzellen 7,8. Gaschromatographie verwendet wird, um die Aufnahme des ergänzten Fettsäure in der bakteriellen Nahrungsquelle (entweder OP50 oder HT115) sowie in der Nematoden zu überwachen. Die Zugabe der Waschmittel Tergitol (NP-40) in den Medien ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung der Fettsäuren durch die gesamte Platte und effiziente Aufnahme der Fettsäuren durch die E. coli und die Nematoden. Wir haben gefunden, daß ungesättigte Fettsäuren leicht von Bakterien und C aufgenommen elegans, aber die Aufnahme von gesättigten Fettsäuren ist viel weniger effizient. Dieser Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie Sie die Agar-Medien mit Fettsäuren zu ergänzen, als auch, wie man die Fettsäureaufnahme in th überwachenE Nematoden mittels Gaschromatographie.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td> <td>(5 mg/ml in Ethanol)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihomogamma-Linolenat</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Warmes steriles Millipore-Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser zum Sammeln von Würmern</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser für DGLA-Stammlösung</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml in Wasser (für RNAi-Platten)</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M in Wasser (für RNAi-Platten)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Diamindinophenylindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glaskolben</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavierbare Glasflaschen mit Rührstäben</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavierbarer Messzylinder aus Glas</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Rührplatte</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad bei 55+ &Grad; C</td><td>Precision Scientific Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschluss Braunglas Fläschchen</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>Argongastank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatisierte Pipettenhilfe</td><td>Pipettenhilfe</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Sterile serologische Pipetten (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>Silanisiertes Glasröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>für FAMEs Ableitung</td></tr><tr><td>PTFE Schraubverschlüsse</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Klinische Tischzentrifuge</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Crimp Fläschchen</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC Fläschcheneinsatz</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC Fläschchenkappe</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>Gaschromatograph</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometrie-Detektor</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>Säule für Gaschromatographie</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0,25 mm Quarzglas-Kapillarsäule</td></tr></tbody></table>

nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten fettsäuren<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fettsäuren sind für eine Vielzahl von Zellfunktionen unerlässlich. Sie dienen als effiziente Energiespeichermoleküle bilden den hydrophoben Kern von Membranen, und beteiligen sich an verschiedenen Signalwege. Caenorhabditis elegans synthetisiert alle notwendigen Enzyme, um eine Reihe von Omega-6-und Omega-3-Fettsäuren zu produzieren. Dies, kombiniert mit der einfachen Anatomie und Umfang der verfügbaren genetischen Werkzeugen, machen es zu einem attraktiven Modell zur Fettsäure-Funktion zu untersuchen. Um die genetischen Ursachen, die die physiologischen Wirkungen von Nahrungsfettsäuren vermitteln zu untersuchen, haben wir ein Verfahren, um die C ergänzen entwickelten elegans Diät mit ungesättigten Fettsäuren. Nahrungsergänzung ist ein wirksames Mittel, um die Fettsäurezusammensetzung von Würmern zu ändern und kann auch verwendet werden, um Defekte in Fettsäure-Mutanten zu retten. Unsere Methode verwendet Nematoden Wachstumsmedium-Agar (NGM) mit Fett acidsodium Salze ergänzt. Die Fettsäuren in den Platten ergänzt werden InkorporationTED in den Membranen der Bakterienlebensmittelquelle, die dann von der C aufgenommen elegans ergänzt, die auf den Bakterien ernähren. Wir beschreiben auch ein Gaschromatographie-Protokoll, um die Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung, die ergänzt Würmer auftreten überwachen. Dies ist eine effiziente Möglichkeit, die Diäten von großen und kleinen Populationen von C. ergänzen elegans, so dass für eine Reihe von Anwendungen für diese Methode.

Ergänzung des C. elegans Diät wird durch die Fähigkeit der bakteriellen Nahrungsquelle in der Bakterienmembran zu integrieren Aufnahme und Fettsäure beschränkt. Um die Fähigkeit von E. bestimmen coli OP50 verschiedenen Fettsäuren in ihre Membranen aufzunehmen, OP50 wurde auf Medien ohne Ergänzung, 0,1 mM und 0,3 mM Konzentrationen von Stearinsäure (18.00), Natriumoleat (18.01 n-9) und Natrium DGLA (20 plattiert : 3n-6). Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 2 Tage im Dunkeln getrocknet und...

&lt;em&gt; Caenorhabditis ele &lt;/ em&gt; ist ein nützliches Modell, um die Funktionen der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der Entwicklung und Physiologie zu erforschen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren zur Ergänzung des &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; Ernährung mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren.

Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, diätetische Mittel zu verwenden, um die Fettsäurezusammensetzung der Meereseleganz zu verändern, um die Funktion und Regulation der Fettsäuren zu untersuchen. Dies wird durch die Kultivierung der Nematoden-Nahrungsquelle in Gegenwart von ungesättigten Fettsäuren erreicht. Als nächstes werden die Meereseleganz mit den ergänzten Bakterien gefüttert, die die Aufnahme der Fettsäure und ihren Einbau in den Wurm ermöglichen.Die Lipide verändern sich dann in der Eleganz des Meeres. Die Zusammensetzung der Fettsäuren wird durch gaschromatographische Massenspektrometrie bestätigt. Nach der Fütterung von ungesättigten Fettsäuren werden die Würmer schließlich auf Sterilität geprüft.Es werden Ergebnisse erzielt, die die physiologischen Auswirkungen einer veränderten Fettsäurezusammensetzung durch Entwicklungsverhalten und Veränderungen der Genexpression zeigen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Meereseleganz, Entwicklung und Physiologie zu beantworten, da wir sowohl genetische Manipulation als auch diätetische Beiträge nutzen können, um die Fettsäurezusammensetzung zu verändern und die Folgen zu überwachen. Im Allgemeinen müssen Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, vorsichtig und vorsichtig sein, da es aufgrund der Empfindlichkeit ungesättigter Fettsäuren gegenüber Sauerstoff und hohen Temperaturen schwierig ist, konsistente Ergebnisse zu erzielen.Um einen Liter Fettsäurezusatz herzustellen, messen Sie die folgenden Komponenten in einen Kolben ab. Fügen Sie Millipore-Wasser bis zu 800 Milliliter hinzu und autoklavieren Sie das Medium zusammen mit einer leeren Glasflasche für jede zu prüfende Fettsäurekonzentration sowie entsprechenden Messzylindern, während das Medium auf 55 Grad Celsius abkühlt. Bereiten Sie die Arbeitsstofflösung des Fettsäure-Natriumsalzes vor, indem Sie das Glasfläschchen vorsichtig aufbrechen, um keine Glaspartikel in das Pulver zu bekommen, und so weit abwiegen, dass eine 100 millimolare Stammlösung entsteht, und die erforderliche Menge gereinigten Wassers hinzufügen.Spülen Sie anschließend die Lösung mit Argon- oder Stickstoffgas, um eine Fettsäureoxidation zu verhindern. Verschließen Sie dann das Fläschchen und lagern Sie das Fläschchen im Dunkeln, während sich die Fettsäure, Natriumsalz, auflöst. Wenn der Agri bei den folgenden Temperaturen auf 55 Grad Celsius abgekühlt ist, dann in der Nähe einer Flamme, wird die Lösung in einen sterilen Messzylinder überführt.Bevor Sie steriles Wasser bis zu einem Liter hinzufügen, füllen Sie das Medium zurück in den Kolben und mischen Sie weiter. Verwenden Sie einen sterilen Messzylinder, um für jede zu testende Fettsäurekonzentration ein Aliquot des Mediums in eine autoklavierte Flasche zu überführen. Anschließend die Flaschen auf einer Rührplatte warm halten.Rühren Sie die entsprechende Konzentration der Fettsäure-Stammlösung ein, bevor Sie eine sterile 25-Milliliter-Pipette verwenden, um die Platten nach dem Erstarren der Platten zu gießen, decken Sie sie ab und lagern Sie sie bei Raumtemperatur an einem gut überprüften Ort im Dunkeln. Zwei Tage später verwenden Sie e coli OP 50, um die Platten zu säen, und inkubieren Sie die Platten dann in einer dunklen Umgebung bei Raumtemperatur, während der Bakterienrasen trocknet. Bereiten Sie eine synchronisierte Population von L-1-Larven vor, indem Sie Ravi-Hermaphroditen mit alkalischer Hypochloritlösung behandeln.Wiegen Sie die GR-Hermaphroditen vorsichtig in dieser Lösung, bis sich die erwachsenen Würmer aufgelöst haben. Zentrifugieren Sie dann bei niedriger Geschwindigkeit, um die Eier zu pelletieren. Mit M neun Puffer die Eier dreimal waschen.Dann in einem 15-Milliliter-Röhrchen in fünf Millilitern M neun Puffer resuspendieren und über Nacht rocken. Geben Sie die L 1-Larven in OP 50-Saatplatten, die mit 0,3 Millimolar di Homo Gammalin Säure oder DGLA ergänzt wurden, und inkubieren Sie sie drei Tage lang bei 20 Grad Celsius oder bis die Larven das adulte Stadium erreichen. Verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um adulte Würmer auf Sterilität zu bewerten.Ein erfolgreicher Keimverlust zeigt sich in einer klaren Gebärmutter ohne Eizellen. Alternativ können Sie Würmer einritzen, indem Sie sie in einen Tropfen M neun Puffer auf einem Uhrglas picken. Verwenden Sie dann einen Milliliter 0,2 Nanogramm pro Milliliter Dumpinglösung, um das Uhrglas zu fluten und etwa fünf Minuten lang zu inkubieren.Nach der Inkubation pflücken Sie die Würmer in einen Tropfen Eindeckmittel auf einem Objektträger, bevor Sie sie mit einem Deckglas abdecken, verschließen Sie das Deckglas und lagern Sie es bei vier Grad Celsius im Dunkeln über Nacht oder betrachten Sie es sofort unter einem Fluoreszenzmikroskop, um Fettsäuremethylester oder -ffame zu produzieren. Um die Fettsäureaufnahme zu quantifizieren, sammeln Sie 500 bis 1000 erwachsene Würmer, indem Sie sie mit Wasser von den Platten abwaschen und auf silikonisiert übertragen. 13 x 100 Millimeter große Schraubrohre aus Glas.Lassen Sie die Würmer sich durch die Schwerkraft ansiedeln und entfernen Sie dann mit einer Pipette aus dem Glas so viel Wasser wie möglich. Fügen Sie einen Milliliter 2,5%ige Schwefelsäure in Methanol hinzu und erhitzen Sie die Rohre in einem Wasserbad bei 70 Grad Celsius für eine Stunde, nachdem Sie eine Minute lang unter der Haube abgekühlt sind, extrahieren Sie die Rahmen durch Zugabe von 1,5 Millilitern Wasser und 0,25 Millilitern Hexan. Verschließen Sie die Tuben und schütteln Sie sie kräftig.Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen eine Minute lang in einer klinischen Tischzentrifuge, um das Hexan vom wässrigen Lösungsmittel zu trennen. Übertragen Sie die oberste Hexanschicht auf einen Gaschromatographie- oder GC-Fläschcheneinsatz in einem GC-Fläschchen. Für die Analyse mit gc injizieren Sie ein bis zwei Mikroliter Fame auf eine polare Kapillargaschromatographiesäule, die für die Fame-Analyse geeignet ist.Stellen Sie den Injektor auf 250 Grad Celsius mit einer Durchflussmenge von 1,4 Millilitern pro Minute ein. Den Ofen auf eine Anfangstemperatur von 130 Grad Celsius programmieren, die eine Minute lang gehalten wird. Erhöhen Sie dann die Temperatur um 10 Grad Celsius pro Minute, bis sie 190 Grad Celsius erreicht, und erhöhen Sie sie dann erneut auf fünf Grad Celsius pro Minute auf 210 Grad Celsius und halten Sie sie dann für eine weitere Minute gedrückt, um sicherzustellen, dass die Aufnahme von DGLA erfolgt ist.Analysieren Sie Frames durch Flammenionisationsdetektion oder Massenspektrometrie oder MS-Detektion unter Verwendung authentischer Standards zur Identifizierung der maritimen Eleganz. Die Supplementierung der Fettsäuren der Sea Elegance-Diät wird durch die Fähigkeit der bakteriellen Nahrungsquelle begrenzt, Fettsäuren aufzunehmen und in die Bakterienmembran einzubauen, um die Fähigkeit von e coli OP 50 zu bestimmen, verschiedene Fettsäuren in ihre Membranen aufzunehmen. OP 50 wurde ohne Zusatz auf Medien mit 0,1 Millimolaren und 0,3 Millimolaren Konzentrationen von Sterinsäure, Natriumat und Natrium-DGLA plattiert, wie in dieser Abbildung zu sehen ist. Die Fame-Analyse durch GCMS zeigt, dass ungesättigte Fettsäuren, einschließlich OLEATE und DGLA, in höheren Konzentrationen als die gesättigte Fettsäure Sterinsäure in OP 50 aufgenommen werden.Darüber hinaus zeigt die Messung der Fettsäuremengen in adulten Würmern, dass eine Supplementierung mit gesättigten Fettsäuren keinen Einfluss auf die relative Menge an gesättigten Fettsäuren im Wurmgewebe hat. Die Supplementierung mit ungesättigten Fettsäuren erhöhte jedoch die relativen Mengen dieser Fette zusammen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die relative Akkumulation von supplementierten Fettsäuren in see elegance direkt mit der relativen Akkumulation von Fettsäuren in der Nahrung korreliert.Wie wir bereits gezeigt haben, veranschaulicht diese Grafik die Dosisreaktion der DGLA-Induktion der Sterilität bei Meereseleganz. Die Konzentration von DGLA in Wurmlipiden, in denen 50 % der Population steril sind, beträgt etwa 12 %, und interessanterweise kann die Reaktion auf DGLA durch genetische Mutationen in den Würmern verändert werden. Basierend auf einer aktuellen Erkenntnis, dass die vom Insulinwachstumsfaktor abhängigen Stresswege die DGLA-induzierte Keimzellzerstörung beeinflussen können.Wir ergänzten die Ernährung von Würmern, die schädliche Mutationen entweder im DAF-Zwei-Insulin-IGF-Rezeptor oder im DAF 16 FOXO-Transkriptionsfaktor enthielten. Mit DGLA zeigte eine Bewertung der Sterilität in jedem Stamm, dass DAF-2-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Würmern bei beiden DGLA-Konzentrationen fruchtbar waren und keinen induzierten Keimzellverlust aufwiesen. Im Gegensatz dazu zeigten DGLA-supplementierte Würmer mit inaktivem Vox O einen höheren Anteil an sterilen Würmern im Vergleich zum Wildtyp, wenn sie auf Platten mit 0,15 Millimolar der Fettsäure gefüttert wurden. Nach diesem Verfahren können Forscher mit der ergänzten sea elegance zahlreiche Assays durchführen, wie z. B. Genexpressionsstudien, Verhaltensassays oder Entwicklungs- oder Reproduktionsanalysen.Diese Assays werden die Rolle bestimmter Fettsäuren in diesen Prozessen aufzeigen. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit Fettsäuren angereicherte Medien konsistent zubereiten, die verwendet werden können, um die Fettsäurezusammensetzung von Sea Elegance zu verändern.

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Biology

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