Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, neurale Stammzellkulturen aus verschiedenen Bereichen des Gehirns adulter Nagetiere zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem Gewebe aus einer Region von Interesse entnommen wird, um es auf das Vorhandensein und Potenzial von neuralen Stammzellen zu untersuchen. In einem zweiten Schritt wird das Gewebe zu einer Zellsuspension für die Beschichtung als Monolayer-Kultur verarbeitet.

Als nächstes verwenden Sie definierte Kulturbedingungen, um die neuralen Stammzellen selektiv zu vermehren und ihr Selbsterneuerungspotenzial zu validieren. In vitro werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die neuralen Stammzellen aufgrund ihres Differenzierungspotenzials multipotent sind und wie verschiedene Faktoren ihre Selbsterneuerung und ihr Schicksal beeinflussen können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Neurowissenschaften und der regenerativen Medizin zu beantworten, z. B. wo sich endogene Neurostammzellen befinden und wie sie manipuliert werden können.

Wir dachten zum ersten Mal an diese Technik, als wir Signalreduktionswege entdeckten. Dies ermöglichte es uns, sowohl mutmaßliche endogene Neuros-Stammzellen zu identifizieren als auch ihre Anzahl zu regulieren. Also haben wir dieses Wissen genutzt, um robuste Kulturen dieser Zellen aus verschiedenen Bereichen des Gehirns zu etablieren.

Untersuchen Sie ihre Eigenschaften und stellen Sie sich die Frage, sind es tatsächlich Stammzellen? Die richtige Zubereitung der Kulturschale ist zwei Tage vor der geplanten Sektion von entscheidender Bedeutung: Bestreichen Sie die Schalen mit Poly-L-Ornithin bei 75 Mikrogramm pro Milliliter. Inkubieren Sie die Platten dann am nächsten Tag über Nacht, aspirieren Sie das Poly-L-Ornithin und waschen Sie jede Platte zweimal gut mit drei Millilitern PBS für fünf Minuten pro Waschgang.

Die Platten können dann bis zu drei Wochen in einem Inkubator gelagert werden. Nach dem Entfernen der letzten Wäsche fügen Sie durch vorsichtiges Pipettieren um eins auf 250 verdünntes Fasernin in PBS hinzu. Achten Sie darauf, die Lösung nicht zu stark zu bewegen. Inkubieren Sie die Platten dann über Nacht am Tag der Dissektion.

Aspirieren Sie das Fibronektin und spülen Sie das Geschirr zweimal mit PBS. Legen Sie die Platten mit der abschließenden PBS-Wäsche wieder in den Inkubator und warten Sie, bis das dissoziierte Gewebe vorhanden ist. Unbenutzte Platten können bis zu einer Woche im Inkubator gelagert werden, lassen Sie sie jedoch nicht austrocknen und rühren Sie sie nicht auf.

Die Demonstration dieses Protokolls wird auf drei erwachsene Ratten übertragen. Stellen Sie zunächst sicher, dass Sie den Gehirntrennblock auf Eis abkühlen, bevor Sie die erste Ratte einschläfern. Bereiten Sie dann ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis mit fünf Millilitern N, zwei mittleren und basischen FGF vor.

Nachdem Sie das Gehirn einer euthanasierten Ratte entfernt haben, legen Sie das Gehirn in eine 10 Zentimeter große Petrischale, die eiskaltes PBS enthält. Übertragen Sie dann das Gehirn auf eine zweite Schale PBS ohne Resthaare oder Blut. Platzieren Sie nun das Gehirn in den gekühlten Schnittblock und führen Sie eine neue, saubere Rasierklinge in der Nähe der interessierenden Region in den Block ein, aus der Zellen erzeugt werden.

Führen Sie als Nächstes eine zweite saubere Rasierklinge ein. Drei Millimeter verhätscheln bis zur ersten Rasierklinge. Heben Sie die Klingen vorsichtig vom Block ab und nehmen Sie den gewünschten Abschnitt mit.

Lassen Sie den Abschnitt von der Klinge schweben, indem Sie ihn in PBS eintauchen. Entnehmen Sie nun den interessierenden Bereich mit der Pinzette Nummer fünf. In diesem Beispiel enthält der Abschnitt die vordere Kommissur. Sicher.

Sammeln Sie den Schnitt in das konische 15-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter N zwei Medium mit basischem FGF enthält. Reduzieren Sie dann das Volumen der Lösung auf ein bis zwei Milliliter. Als nächstes tauchen Sie in einer Zellkulturhaube eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze an den Boden des Konus und verwenden Sie etwa 20 Ströme Lösung, um das Gewebe mechanisch zu dissoziieren.

Stoppen Sie die Tation, wenn die Lösung homogen wird, und lassen Sie sie einige Minuten ruhen, damit sich größeres, nicht assoziiertes Gewebe am Boden absetzt. Übertragen Sie nun den homogenen Überstand ohne Gewebestücke in ein konisches Röhrchen, das 8,5 Milliliter Supplementierstoff und zwei Medien enthält. Mischen Sie den Inhalt der Tube und halten Sie sechs vorbereitet.

Gut anrichten. Entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen und geben Sie dann in den nächsten 10 bis 14 Tagen der Kultivierung drei Milliliter Zellmischung pro Vertiefung in drei Vertiefungen. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch frisches ergänztes N zwei, beginnend 24 Stunden nach dem Plattieren jeden zweiten Tag, fügen Sie ein frisches Volumen an Nahrungsergänzungsmitteln in N zwei hinzu.

Medium zu dem Medium, das sich bereits auf den Zellen befindet. Die Sorgfalt auf die Bedingungen der Medien ist unerlässlich, um die Zellen undifferenziert zu halten und ihre Expansion zu ermöglichen. Nach dem ersten Mediumwechsel blieb eine große Menge an Zelltrümmern zusammen mit den Blutgefäßen zurück.

In den nächsten Tagen wurden jedoch Kolonien von ausgeprägten wuchernden Stammzellen sichtbar. Ebenfalls vorhanden waren länglichere spindelartige Zellpopulationen. Diese sind keine neuralen Stammzellen und wurden schließlich mit der Vermehrung der neuralen Stammzellen überholt.

Im Laufe der nächsten zwei Wochen wuchsen die neuralen Stammzellen dichter, bis sie den Zusammenfluss erreichten. Diese Kulturen waren positiv für eine Reihe von Stammzellmarkern gefärbt, darunter SOX two, hesi und nest. Indem sie die Gewissheit schaffen, dass es sich bei den Zellpopulationen, die selektiert und erweitert wurden, tatsächlich um neurale Stammzellen handelt.

Eine weitere Bestätigung erfolgte nach dem Entzug von FGF aus dem Medium, was es den Zellen ermöglichte, sich 10 Tage lang in Neuronen, Astrozyten und alle Zendrazyten zu differenzieren. Um Differenzierung zu induzieren. Ersetzen Sie das ergänzte N zwei Medium durch unser ergänztes N zwei, Medium und kultivieren Sie die Zellen auf diese Weise 10 Tage lang, ersetzen Sie das N zwei alle 48 Stunden nach 10 Tagen, aspirieren Sie das Medium und fixieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern 4% para Formaldehyd pro Vertiefung für 20 Minuten.

Waschen Sie das Fixiermittel zweimal pro Wäsche fünf Minuten lang mit drei Millilitern PBS aus. Nach dem Aspirieren der zweiten Wäsche fügen Sie zwei Milliliter PBS hinzu, die 5 % normales Eselsserum und 0,1 % Tritton X 100 enthalten, um die Zellen zu permen und zu blockieren, während die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie den primären Antikörpermix in PBS mit 5 % NDS vor.

In diesem Beispiel wird der Anti-T-UJ-Eins-Antikörper zur Identifizierung von Neuronen verwendet, während die Antikörper von GFAP und CPA zur Visualisierung von Astrozyten bzw. Oligodendrozyten verwendet werden. Nach 20 Minuten aspirieren Sie die Blockierungslösung und fügen jeweils 1,5 Milliliter des primären Antikörpergemisches hinzu. Inkubieren Sie die Zellen gut.

Fügen Sie 90 Minuten lang Raumtemperatur hinzu, waschen Sie die Zellen mit zwei PBS-Bädern, gefolgt von einer Anwendung von PBS mit 5% NDS, verwenden Sie drei Milliliter Lösung und fünf Minuten Bäder. Nach dem Entfernen der letzten Wäsche jeweils 1,5 Milliliter Sekundärantikörper in PBS mit 5 % NDS auf jeden auftragen. Na dann stelle den Teller ins Dunkel, füge Raumtemperatur hinzu und warte 40 Minuten.

Ersetzen Sie nach 40 Minuten die Sekundärfarbe durch zwei Milliliter eines frisch zubereiteten DPI-Flecks und warten Sie drei Minuten. Nach dem Aspirieren der DPI-Lösung waschen Sie die Zellen dreimal mit drei Millilitern PBS für fünf Minuten pro Waschgang. Nach diesem Verfahren sind die Zellen bereit für die Mikroskopie.

Andere Methoden wie Western Blots können durchgeführt werden, um Veränderungen der Proteinexpression und Phosphorylierung zu untersuchen, die sich aus pharmakologischen Behandlungen oder im Verlauf der Zelldifferenzierung ergeben. Nach der Entwicklung dieser Technik ebnete sie Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um neue Methoden zu testen, die sie in der Forschung an verschiedenen Spezies einsetzten, darunter Mäuse, Ratten und sogar Primaten.