Name: Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Erfahren Sie, wie neuronale Stammzellen aus verschiedenen Regionen des erwachsenen Nagetiergehirns kultiviert werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial für Neurowissenschaften und regenerative Medizin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Imaging and Curing Umweltstoffwechselkrankheiten, durch die Initiative und Netzwerkfonds der Helmholtz-Gemeinschaft, einen Zuschuss von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung, und ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (- Diese Arbeit wurde von der Helmholtz-Allianz ICEMED finanziert (teilweise) SFB 655: Zellen in Gewebe).

Die Arbeit hält sich an die Erklärung der Helsinski und der ARVO Tiererklärung. Die Tiere wurden für die Gewebesammlung nach den Anweisungen der Tierhaltung an der Universität Dresden verwendet und alle relevanten Methoden verfolgt. Die Tiere wurden behandelt und untergebracht nach den Bundesrichtlinien für die Nutzung und Pflege von Labortieren, und die Studie wurde von der Landesdirektion Dresden genehmigt. Bitte wenden Sie sich an die Veterinärpolitik Ihrer Institution (IACUC oder andere board) zu entsprechenden Euthanasie-Methodik. Besondere Lager-und Arbeits Konzentrationen der Reagenzien in den dieses Protokoll beigefügten Tabellen Reagenz gefunden werden. 1. Kulturschale Vorbereitung <ol><li> Coat Gerichte mit einem ausreichenden Volumen von 75 ug / ml Poly-L-Ornithin (dh 2 ml / Well einer 6-Well-Platte) über Nacht in der Zellkultur-Inkubator 2 Tage vor dem geplanten Datum Dissektion. </li><li&gt; Absaugen des Poly-L-Ornithin am nächsten Tag waschen und jede Vertiefung 2x mit 3 ml PBS für 5 min. </li><li> Nehmen Sie die letzte Wäsche, dann fügen Fibronektin (1:250 verdünnt, 4 ug / ml in PBS) auf die Platte und legen die Gerichte in den Inkubator über Nacht. </li><li> Saugen Sie den Fibronektin am Tag der Präparation und waschen das Geschirr 2x mit PBS. Bringen Sie die Platten noch mit der endgültigen PBS zu waschen, um den Brutschrank, bis die dissoziierten Gewebe ist bereit für die Kultivierung. Zu dieser Zeit, entfernen Sie die PBS vor, um die Gewebebeschichtung. </li><li> Mit Poly-L-ornithinein den Inkubator für bis zu 3 Wochen beschichtet Speicher-Platten. Platten mit Fibronectin beschichtet ist, kann für bis zu 1 Woche gelagert werden. Fibronektin-Beschichtung kann in weniger als 2 Stunden durchgeführt werden, wenn dringend. Fibronektin ist anfällig für Denaturierung, nicht die Lösung zu rühren oder lassen Geschirr trocknen. </li></ol> 2. Dissection / Auflage <ol><li> Dieses Protokoll gilt für die Verwendung von 3 erwachsenen Ratten (3-6 Monate alt). </li><li> Chill das Gehirn vor dem Einschläfern die Ratte Schnittblock auf Eis. </li><li> Legen Sie ein 15 ml-Falcon-Röhrchen, die 5 ml N2 Medium mit bFGF auf Eis enthält. </li><li> Euthanize die Ratten nach Veterinärpolitik Ihrer Einrichtung. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel durch einen Einschnitt auf der Mittellinie des Kopfes. Verwenden Pinzette abziehen der Knochen so dass für das Gehirn vorsichtig herausgezogen werden. </li><li> Legen Sie das Gehirn in einer 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS. Dadurch werden alle Rest Haar und Blut zu entfernen. (1A) </li><li> Legen Sie das Gehirn in den Schneideblock gekühlt. (1B) </li><li> Stecken Sie eine neue, saubere Rasierklinge in den Block wie in 1C dargestellt. </li><li> Legen Sie eine zweite saubere Rasierklinge 3 mm kaudal der ersten wie in 1D dargestellt. </li><li> Die Blätter vorsichtig anheben aus dem Block, und mit ihnen den Abschnitt von Interesse. </li><li> Float der SECTion vor der Klinge durch Eintauchen in PBS. (1E) </li><li> Ernte Gewebe aus dem Bereich von Interesse (in diesem Beispiel verwendeten wir die vordere Kommissur (anterior) ACA, 1F) unter Verwendung von # 5 Pinzette und Sammeln in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml N2-Medium, das bFGF. </li><li> Bewegen des Rohres in einer laminaren Strömung Zellkulturhaube, weiterhin den Rest des Protokolls unter sterilen Bedingungen. </li><li> Mechanisch distanzieren das Gewebe mit einer 1 ml Pipettenspitze auf eine P1000 Pipette befestigt. Pipette nach oben und unten mehrmals (ca. 20x mit einer Rate von 1 Pipettieren Zyklus pro Sekunde), während Sie die Öffnung der Pipettenspitze an der Unterseite des konischen Rohrs (Abbildungen 1G 1-3). Verreiben stoppen, wenn die Lösung homogen. </li><li> Lassen Sie die Lösung für 2 Minuten ruhen lassen, damit ein größeres nondissociated Gewebe am Boden absetzen. (1G 4) </li><li> Sammeln Sie die homogeneous Überstand und in einen konischen Röhrchen mit 8,5 ml N2 Medien plus 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2 und 200 nMJAK Inhibitor. </li><li> Platten sie in drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 3 ml verdünnten Zelllösung / gut. </li><li> Die Platte wird in einer befeuchteten Zell Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2, 5% O 2. </li></ol> 3. Daily Care <ol><li> Ersetzen Sie das Medium, auf den Kulturschalen mit N2-Medium, das bFGF, Ang2, Dll4 und JAK Inhibitor 24 Stunden nach dem Ausstreichen. </li><li> Fügen Sie einen Bolus von bFGF, Dll4, Ang2 und JAK-Inhibitor auf den nächsten Tag. </li><li> Setzen Sie diesen Wechsel Prozess der Medienwechsel und Ergänzungen Faktor für insgesamt 10-14 Tage. </li></ol> 4. Induktion der Differenzierung <ol><li> Ziehen bFGF, Dll4, Ang2 und JAK-Inhibitor enthält, mittel-und ersetzen Sie es mit N2-Medium, das keine zusätzliche Faktoren enthält. </li><li> Ändern Sie jeden zweiten Tag das Medium. </li><li> Befestigen Sie die Zellen nach 10 Tagen und durchzuführen, Immunzytochemie. </li></ol> 5. Immunzytochemische Erkennung <ol><li> Saugen Sie das Medium und fixieren Zellkultur-Platten mit 2 ml 4% Paraformaldehyd für 20 min. </li><li> Wasch 2x mit 3 ml PBS für jeweils 5 min. </li><li> Aspirat PBS permeabilisiert und dann blockieren die Zellen durch Zugabe von 2 ml PBS mit 5% normalem Eselserum (NDS) und 0,1% Triton X-100 für 20 min. </li><li> Bereiten Sie den primären Antikörper-Mix in PBS mit 5% NDS. Anti-Nestin-Antikörpers zur Identifizierung VZ verwendet werden, während TuJ1 (Klasse III β-Tubulin), GFAP und CNPase Antikörper können zusammen für eine Dreifachfärbung von Differenzierungsmarkern verwendet werden. </li><li> Absaugen Blockierungslösung und 1,5 ml der primären Antikörpermischung in jedes Well. Inkubieren bei Raumtemperatur für 90 min. </li><li> Entfernen der Primärantikörper und 2x Waschen mit 3 ml PBS, und 1x mit 3 ml PBS, enthaltend 5% NDS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Prepare die Sekundärantikörper in PBS mit 5% NDS. </li><li> Saugen Sie den letzten Waschen und fügen Sie 1,5 ml Sekundärantikörperlösung in jede Vertiefung. Inkubieren im Dunkeln für 40 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und 2 ml einer frisch hergestellten DAPI-Färbung (500 ng / ml in PBS). Inkubation für 3 min. </li><li> Saugen Sie den DAPI-Lösung dann waschen 3x mit 3 ml PBS für jeweils 5 min. Die Zellen können nun mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. </li></ol>

<ol><li>Cajal, R. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+RY+%22Comparative+Study+of+Sensory+Areas+of+the+Human+Cortex%22">Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex</a>. , Harvard University. (1899).</li>
<li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).</li>
<li>Kaplan, M. S., Hinds, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+rat%3A+electron+microscopic+analysis+of+light+radioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs.</a> Science. 197, 1092-1094 (1977).</li>
<li>Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement in adulthood.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).</li>
<li>Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+neocortex+of+adult+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the neocortex of adult primates.</a> Science. 286, 548-552 (1999).</li>
<li>Kornack, D. R., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuation+of+neurogenesis+in+the+hippocampus+of+the+adult+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+proliferation+and+migration+of+postnatally+generated+neurons+derived+from+the+forebrain+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone.</a> Neuron. 11, 173-189 (1993).</li>
<li>Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+cells+express+a+new+class+of+intermediate+filament+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.</a> Cell. 60, 585-595 (1990).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+precursors+in+the+adult+brain+rescues+injured+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+dentate+subgranular+zone+and+rostral+subventricular+zone+after+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).</li>
<li>Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone.</a> Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+MSCs+therapeutic%3F+New+data%3A+new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.</a> J. Pathol. 217, 318-324 (2009).</li>
<li>Goldman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+of+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.</a> Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).</li>
<li>Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-based+therapy%3A+considerations+before+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications.</a> Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, e1000029(2009).</li>
<li>Lindvall, O., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapeutics+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell therapeutics in Parkinson's disease.</a> Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).</li>
<li>Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+eNSCs+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mo.l+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease.</a> Mo.l Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Cattaneo, E., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+manipulating+neuronal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identifying and manipulating neuronal stem cells.</a> Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Duarte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage-sensitive+requirement+for+mouse+Dll4+in+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development.</a> Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).</li>
<li>Maisonpierre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2%2C+a+natural+antagonist+for+Tie2+that+disrupts+in+vivo+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.</a> Science. 277, 55-60 (1997).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li>
<li>Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+increases+survival+and+differentiated+functions+of+rat+septal+cholinergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture.</a> Neuron. 5, 297-306 (1990).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+display+an+inherent+mechanism+for+rescuing+dysfunctional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).</li>
<li>Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+attenuate+inflammatory+reactivity+and+neuronal+loss+in+an+animal+model+of+inflamed+AD+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain.</a> J. Neuroinflammation. 6, 39(2009).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factors+stimulate+growth+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells.</a> PLoS One. 5, e9414(2010).</li>
<li>Park, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes3+regulates+cell+number+in+cultures+from+glioblastoma+multiforme+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics.</a> Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).</li>
<li>Poser, S. W., et al. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoser%2C+SW+%22Cancer+Stem+Cells+-+The+Cutting%22">Cancer Stem Cells - The Cutting</a>. Shostak, S. , InTech. Europe, Rijeka, Croatia. 89-110 (2011).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+controlling+neural+stem+cells+slow+progressive+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Viele der Schritte für eine erfolgreiche Isolierung, Expansion und Differenzierung von neuronalen Stammzellen aus adulten Gehirn sind gemeinsam mit Standardgewebekulturtechniken geteilt. Das Ziel zu bedenken ist, dass NSCs aus dem erwachsenen Gehirn isoliert als viele ihrer in-vivo-Eigenschaften wie möglich (2J) zu halten. Oft ist eine Balance zwischen notwendigen Vorsicht und angemessener Geschwindigkeit muss gefunden werden. Pflege mit der Isolierung des Gehirn aus dem Schädel machen die Iden...

Das zentrale Dogma der Neurobiologie, den von den grundlegenden Beobachtungen des Gehirns Zytoarchitektur von Ramón Y. Cajal vor über einem Jahrhundert gemacht gelegt, entschieden, dass die Neurogenese unwahrscheinlich war, nach der Adoleszenz angesichts der Komplexität der neuronalen Netze im ZNS 1 gefunden. Trotz der Arbeit von Altman in den 1960er Jahren und später Kaplan, die zeigen, dass 3 H-Thymidin konnte in reifen Neuronen darauf hinweist, dass in der Tat Neuronen wurden in verschiedenen Bereichen des erwachsenen Gehirns erzeugt gefunden werden, das Dogma weiterhin halten 2, 3. Evidence weiterhin mit Forschungs Nottebohms die jahreszeitlichen Veränderungen in der Anzahl der Singvogel in Gehirnen 4 vorhanden Neuronen beschreiben, zu montieren. Es war nicht bis 1999, als Gould et al. Veröffentlichten Arbeiten über die Erzeugung von Neuronen im Hippocampus steigt mit der Leistung der assoziativen Lernaufgaben in Ratte, sowie die Beobachtungen von Kornack und Rakic ​​DemonstrationTing fortgesetzt Neurogenese im erwachsenen Makaken, die das Konzept einer weniger starren, plastischer Gehirn wurde erkannt 5, 6. Die Suche nach der zellulären Quelle für diese de novo generierten Neuronen führen zur Entdeckung einer diskreten Population von Stammzellen (VZ), die in Bereichen des Gehirns befinden sich die als Nischen 7. Die Subventrikularzone und Unter körnige Zone des Hippocampus gelten als die beiden wichtigsten neurogenen Regionen 8,9 sein. Zellen aus diesen Standorten isoliert zeigen die klassische Merkmal der embryonalen oder fötalen abgeleitet VZ, Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial. Im Fall von neuralen Stammzellen (NSC), können sie in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren. Darüber hinaus sind diese VZ Fleck positive fötale NSC Marker wie der Zwischen Filamentprotein Nestin 10. Neuere Arbeiten betont, dass SCs vielleicht nicht zu diesen t begrenzt werdenWO Bereiche auf und sind in der Tat im gesamten Gehirn lokalisiert als weitgehend ruhenden Zellpopulation fest mit dem Gefäßsystem 11 verbunden. Die Beobachtungen, die VZ in Reaktion auf eine Verletzung mobilisiert legt die Möglichkeit, in der Lage, diese Zellen für regenerative Zwecke zu nutzen, um bei der Rückgewinnung von neurodegenerativen Erkrankung und Schlaganfall 12, 13 zu unterstützen. Das ist nicht anders als die Rolle, die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) bei der Heilung von Bindegewebe spielen, die als perivaskuläre Zellen, die das Potenzial haben, Osteoblasten, Chondrozyten, und Fettzellen werden 14 zu finden sind. Jedoch NSC nicht in der gleichen Weise wie MSCs aus dem Knochenmark durch Routine Aspiration und Dichtegradientenzentrifugation Techniken geerntet und anschließend in autologe Zelltherapien verwendet. Als Folge müssen auch andere Zellen, wie etwa die Verwendung von fetalen NSC oder neuronalen Vorläuferzellen abgeleitet von embryonic Stammzellen wurden ausführlich in der Tier Krankheiten und Verletzungen Modelle mit unterschiedlichem Erfolg 15 erforscht. Induzierte pluripotente Stammzellen-Technologien nutzen somatischen Zellquellen bieten eine weitere Möglichkeit dazu bietet der zur Herstellung therapeutisch nützlichen Zell-basierte Therapien für eine Vielzahl von Anwendungen, die Überwindung der begrenzten Verfügbarkeit und ethische Bedenken hinsichtlich der Verwendung von embryonalen Zellen und fetalen Gewebe 16. Allerdings klinische Umsetzung dieser Erkenntnisse hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, wie in den Kämpfen der Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungen mit SC-basierten therapeutischen Ansätze gezeigt, 17,18 sowie einen gewundenen Pfad zu Regulierungsfreiheit. Als Alternative kann die Einführung von spezifischen pharmakologischen Behandlungen NSC Zahlen modulieren und zu erleichtern Erholung in Modellen der Parkinson-Krankheit und Schlaganfall 19. Was auch immer die Strategie könnte sein, zu verstehen, wie diese Zellen effektiv zu manipulierenerfordert eine in vitro-System zugänglich. Kulturen von NSC kann entweder als Aggregatkulturen, auch bekannt als Neurosphären, oder als Monoschicht 8,20 durchgeführt werden. Beide Verfahren sind weit verbreitet, die die Einführung von definierten Kulturbedingungen, zB die Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) oder basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) als Mitogen Quelle, die für die Expansion von multi Vorstufen bereitzustellen. Während Neurosphärenkulturen zur Untersuchung klonale Vermehrung Fähigkeit eines isolierten Zelltyp besser geeignet ist das System gezeigt, um eine gemischte Population von Zellen während der Expansion 21 zu erzeugen. Darüber hinaus ist die geschlossene Struktur von Neurosphären die pharmakologische Manipulation der Zellen unpraktisch, und die Interpretation der Einfluss diese Faktoren haben könnten, aufgrund der in der Neurosphäre etabliert Mikroumgebung verwechselt werden. Monolayer-Kulturen, andererseits kann seinin der Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle verwendet, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Signalübertragungsmechanismen, die SC Wachstum und Differenzierung regulieren und eröffnet die Möglichkeit, neue Verbindungen, die speziell auf diese Zellpopulation entdecken, zu erkunden. Als Folge kann die Fähigkeit, reproduzierbar Kulturen adulter NSC aus unterschiedlichen Bereichen von Interesse im Gehirn generiert in einem breiten Spektrum von Forschungsanwendungen verwendet werden, die von Entwicklungsstudien des zentralen Nervensystems (ZNS) zu erforschen neuartige regenerative Medizin Ansätze . Die hier vorgestellte Protokoll zeigt, wie zu sezieren und bewerten die Differenzierungspotenzial von ZNS-VZ von der erwachsenen Gehirn von Nagetieren isoliert.

<table><tbody><tr><td>6-Well-Gewebekulturschalen</td><td>BD Biosciences</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3655</td><td> 5 mg/ml Stammlösung, hergestellt in doppelt destilliertem Wasser (mehrere Monate stabil bei -20 & Grad; C). Arbeitskonzentration 0,5 mg/ml in Wasser (Stabil für 1 Monat bei 4 > C). </td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>R& D Systems</td><td>1030-Fn</td> Nicht <td>rühren Stammlösung</td></tr><tr><td>Filtrationsapparat</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-090-CV</td><td>Siehe Hinweis unten für die vollständige Vorbereitung des N2-Mediums</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0516</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td>1 M Stammlösung in ddH2O (stabil bei 20 &de; C für 6 Monate)</td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5261</td><td>500 &micro; M Stammlösung in ddH2O (stabil bei -20 &deg; C für 6 Monate)</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>100 &micro; M Stammlösung in Ethanol (stabil bei -20°; C für 6 Monate)</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>Arbeitskonzentration 20 ng/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Delta4 (Dll4)</td><td>R& D Systems</td><td>1389-D4</td><td>Arbeitskonzentration & nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Angiopoetin 2 (Ang2)</td> <td>F& D Systems</td><td>623-AN</td><td>Arbeitskonzentration & nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>JAK Inhibitor</td><td>Calbiochem</td><td>420099</td><td>Arbeitskonzentration 200 nM & nbsp;</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2058</td><td></td></tr><tr><td>15- und 50-ml-Konische Röhrchen</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430053, 430829</td><td></td></tr><tr><td>Weitere notwendige Gegenstände sind: Allgemeine Sezierinstrumente, einschließlich Rasierklinge und Pinzette, Erwachsene Ratte (3-6 Monate alt; Sprague-Dawley oder Long Evans), CO2 Intoxikationskammer, Laminar-Flow-Haube für Zellkultur und Inkubator Inkubator (befeuchtet, 37 Grad; C, 5 % CO2, 5 % O2). Hinweis: Für eine vollständige Aufbereitung des N2-Mediums geben Sie zu einer Flasche DMEM/F-12 (500 ml) 0,05 g Apotransferin, 0,0125 g Insulin (frisch vorgelöst in 1 ml 10 mM NaOH), 50 μm; L von Putrescin, 30 &mu; l Natriumselenit, 100 &mu; l Progesteronaktien und 5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf auf 7,2 ein. Filtersterilisieren und bei 4 Grad lagern; C bis zu 3 Wochen einwirken lassen und vor Licht schützen.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunfluoreszenz-Reagenzien Tabelle</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselserum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8417</td><td>5 mg/ml Lager Lösung in Methanol</td></tr><tr><td colspan="4">Primäre Antikörpertabelle</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon</td><td>MAB353</td><td> Verdünnungsfaktor: 1:400 Spezies: Maus IgG1 </td></tr><tr><td>Hes3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25393</td><td> Verdünnungsfaktor: 1:100 Spezies: Kaninchen IgG </td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D</td><td></td><td> Systems MAB2018 Verdünnungsfaktor: 1:100 Spezies: Maus IgG2a </td></tr><tr><td>CNPase</td><td>Chemicon</td><td>MAB326</td><td> Verdünnungsfaktor: 1:200 Spezies: Maus IgG1 </td></tr><tr><td>&beta;-Tubulin III (TUJ1)</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1195</td><td> Verdünnungsfaktor: 1:500 Spezies: Maus IgG2a </td></tr><tr><td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td><td>Dako Nordamerika</td><td>Z0334</td><td> Verdünnungsfaktor 1:500 Spezies: Kaninchen </td></tr><tr><td colspan="4">Sekundäre Antikörpertabelle</td></tr><tr><td>Alexa&nbsp; &nbsp; 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td> Verdünnungsfaktor: 1:200 Spezies: Ziege anti Maus IgG1 </td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21131</td><td> Verdünnungsfaktor: 1:200 Spezies: Ziege anti Maus IgG2a </td></tr><tr><td>Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>59883</td><td> Verdünnungsfaktor: 1:200 Spezies: Ziege anti Rabbit </td></tr></tbody></table>

wachsende neuronale stammzellen aus konventionellen und nonconventional regionen der volks nagetier gehirn

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Neuere Arbeiten zeigen, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) Regeneration und Tumorgenese beinhaltet Populationen von Stammzellen (SC) mit Wohnsitz im erwachsenen Gehirn. Aber die Mechanismen, diese normalerweise ruhenden Zellen beschäftigen, um die ordnungsgemäße Funktionsweise von neuronalen Netzwerken, sowie ihre Rolle in der Erholung von Verletzungen und Eindämmung von neurodegenerativen Prozessen sicherzustellen wenig verstanden. Diese Zellen befinden sich in Regionen als &quot;Nischen&quot;, die eine tragende Umwelt mit modulierenden Signale sowohl von der Gefäß-und Immunsystem bieten bezeichnet. Die Isolierung, die Wartung und die Differenzierung von ZNS VZ unter definierten Kulturbedingungen, die unbekannte Faktoren auszuschließen, zugänglich macht Behandlung durch pharmakologische oder genetische Mittel, um Einblicke in ihre in vivo-Verhalten. Hier bieten wir detaillierte Informationen über die Methoden zur Erzeugung von Kulturen von ZNS-VZ aus verschiedenen Regionen des erwachsenen Gehirns und Ansätze zu ihrer d beurteilenifferentiation Potential in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in vitro. Diese Technik ergibt eine homogene Zellpopulation als eine Monokultur, die sichtbar auf einzelne SCs und ihre Nachkommen zu untersuchen. Darüber hinaus kann es in verschiedenen Tiermodellsystemen und klinischen Proben angewendet werden kann, wobei zuvor zur regenerativen Antworten in der geschädigten adulten Nervensystems vorherzusagen.

Identifizieren des interessierenden Bereichs, von dem neuralen Stammzellen zu ernten ist die kritische erste Stufe und die Zeit, die es braucht, um einen konfluenten Platte von Zellen zu definieren. Zum Beispiel ist das SVZ eine klassische neurogener Bereich und hat daher einen höheren relativen Anteil von neuralen Stammzellen. Jedoch kann das hier vorgestellte Verfahren mit anderen Regionen nicht oft eine robuste neurogene Potential im Erwachsenenalter erkannt werden. Für die Zwecke dieses Protokolls haben wir die Comm...

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, neurale Stammzellkulturen aus verschiedenen Bereichen des Gehirns adulter Nagetiere zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem Gewebe aus einer Region von Interesse entnommen wird, um es auf das Vorhandensein und Potenzial von neuralen Stammzellen zu untersuchen. In einem zweiten Schritt wird das Gewebe zu einer Zellsuspension für die Beschichtung als Monolayer-Kultur verarbeitet.Als nächstes verwenden Sie definierte Kulturbedingungen, um die neuralen Stammzellen selektiv zu vermehren und ihr Selbsterneuerungspotenzial zu validieren. In vitro werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die neuralen Stammzellen aufgrund ihres Differenzierungspotenzials multipotent sind und wie verschiedene Faktoren ihre Selbsterneuerung und ihr Schicksal beeinflussen können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Neurowissenschaften und der regenerativen Medizin zu beantworten, z. B. wo sich endogene Neurostammzellen befinden und wie sie manipuliert werden können.Wir dachten zum ersten Mal an diese Technik, als wir Signalreduktionswege entdeckten. Dies ermöglichte es uns, sowohl mutmaßliche endogene Neuros-Stammzellen zu identif

growing-neural-stem-cells-from-conventional-nonconventional-regions

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video-Protokoll zeigt die Neurosphäre Assay-Methode zu generieren und zu erweitern neurale Stammzellen aus dem erwachsenen Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Dieses Video stellt eine Methode zur Isolierung von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen aus dem periventrikulären Gewebe des Rückenmarks bei erwachsenen Ratten vor. Die Technik beinhaltet die Inkubation der Gewebefragmente in einer Lösung, die proteolytische Enzyme enthält, um die extrazelluläre Matrix zu zerstören und die Zellen freizusetzen. Anschließend werden die freigesetzten Zellen in ein Medium überzogen, das spezifische Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von neuralen...

Isolierung von neuralen Stammvorläuferzellen aus der periventrikulären Region des Rückenmarks einer erwachsenen Ratte

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen mechanischen Schneideverfahren, das die Erweiterung der sphärischen neuralen Stamm-und Vorläuferzellaggregate ohne Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension ermöglicht. Die Aufrechterhaltung Zell / Zell-Kontakt ermöglicht eine schnelle und stabile Wachstum seit über 40 Passagen.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Wir berichten über eine auf Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) basierende Methode, um neurale Stammzellen (NSCs) und ihre Nachkommen aus der subventrikulären Zone (SVZ) des adulten Mäusegehirns zu isolieren. Angewendet auf FUCCI-transgene Mäuse (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) ermöglicht es die Untersuchung des Zellzyklusverlaufs durch Live-Bildgebung.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Die Etablierung von Kultursystemen für die Expansion adulter neuraler Stammzellen (aNSCs) ermöglicht die Untersuchung und Anwendung von aNSCs für die Therapie. Die subkallosale Zone (SCZ) wurde kürzlich als neuartige Neuroblasten-bildende Region bei erwachsenen Mäusen erkannt. Hier werden Methoden zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von SCZ-aNSCs beschrieben.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Der Eckzahn Gehirn ist ein wertvolles Modell, bei dem die adulte Neurogenese zu studieren. Präsentiert hier sind Protokolle zur Isolierung und erweitert erwachsenen Hunde-Hippocampus-neuralen Vorläuferzellen aus primären Hirngewebe.

Isolierung und Expansion von adulten Canine Hippocampus Neural Precursors

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Erfahren Sie, wie neuronale Stammzellen aus verschiedenen Regionen des erwachsenen Nagetiergehirns kultiviert werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial für Neurowissenschaften und regenerative Medizin.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Weitere Videos entdecken