Name: Kultur von isolierten Bodenplatte Tissue und Produktion von konditioniertem Medium, um funktionelle Eigenschaften von Bodenplatte aufgelegt Signale beurteilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von isoliertem Bodenplatten-Gewebe zur Produktion von konditioniertem Medium für biochemische Analysen von Rückenmarksentwicklung bei Maus-Embryonen.

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Wir danken Karine Kindbeiter, Muriel Bozon und Florie Reynaud für ihre Hilfe. Die Arbeit wird von CNRS, ANR YODA Programm und Labex DevWeCan unterstützt.

TAG 1 1. Dissektion der Spinal Cord Bodenplatte (FP) aus E12.5 Maus Embryonen Hinweis: Das gesamte Verfahren erfordert die Verwendung von sterilen Bedingungen. Es ist bevorzugt, die Dissektion unter einer Haube Dissektion durchführen, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Oberfläche der Abzugshaube mit Ethanol gereinigt werden. Alle Dissektionsinstrumente sterilisiert und aufbewahrt werden in einer sterilen Petrischale. Die Flüssigkeiten (medium, mittel Dissektion) geschlossen gehalten und in einem Eisbad gestellt werden. Jeder Embryo in einzelnen Tropfen frisch gesammelt werden. Dies ist wichtig für die Gewebeerhaltung. Die Präparation wird mit Dumont Nr. 5 Zange durchgeführt. Um die Embryonen zwischen Gerichten, Griff die Nabelschnur oder der Kopf, ohne Schäden an der Hinterhirn übertragen. Es ist wichtig, nicht zu beschädigen das Rückenmark, die Dissektion erfolgreich abgeschlossen. Vorbereitung kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS), Kälte Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -6,5% Glucose und Raumtemperatur Neurobasalmedium. 1.1 Rückenmark Dissektion Tiere sind nach den Richtlinien der Tierpflege des Centre National de la Recherche Scientifique folgenden europäischen Richtlinien behandelt. Das Verfahren nach Euthanasie zervikale Dislokation, es besteht aus Aufbringen von Druck auf den Hals und Dislokation der Wirbelsäule aus dem Gehirn. Dieses Verfahren ist für Maus Tiermodell empfohlen und kann in einer schnellen und effizienten Weise durchgeführt werden. <ol><li> Euthanize eine schwangere Maus auf E12.5 der Schwangerschaft (E0.5 = Tag nach Matten). Platzieren Sie die Maus Bauchseite auf. </li><li> Weichen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Klemmen Sie die Haut des Bauches mit Adson Pinzette und Messer durch die Haut und die Bauchfellschichten mit chirurgischer Schere. Einen Einschnitt machen und es verwenden, um sowohl auf Seite der Maus geschnitten, um die Bauchhöhle aus. </li><li> Eine Reihe von Embryonen ist auf jeder Seite der Maus vorhanden ist. Fassen Sie ein Horn des uterus im Gewebe zwischen zwei Embryonen und sezieren sie ausgehend von den äußeren Teil. Übertragen Sie die intakte Gebärmutter auf eine 100 mm Petrischale mit kaltem PBS auf Eis. </li><li> Extrahieren Sie die Embryonen aus extra-embryonalen Geweben. Fassen Sie die Plazentagewebe (in dunkelrot) mit zwei Pinzetten und ziehen leise, um das Gewebe reißen, und entfernen Sie die Embryonen von der Gebärmuttersack. </li></ol> Hinweis: Für eine bessere Erhaltung, sammeln die Embryonen aus ihrer Gebärmutter-sac eine nach der anderen. <ol start="5"><li> Die nächsten Schritte werden unter binokularen Lupe und Dissektion Haube getan. Legen Sie ein Embryo in einem Tropfen kaltem HBSS-6,5% Glucose. </li><li> Mit einer Pinzette, den Embryo zu enthaupten. </li></ol> Hinweis: zwischen Unterkiefer und Hinterhirn Schneiden, ist der hintere Teil des Hinterhirn wichtig für die nächsten Schritte. <ol start="7"><li> Setzen Sie den Embryo ventralen Seite nach unten mit dem vorderen Teil mit Blick auf den Experimentator. </li><li> Klemmen Sie die Hautdes Embryos mit einer Zange und mit dem anderen Paar ziehen weg die Haut. </li></ol> Anmerkung: Dieser Schritt ist zu wiederholen, bis die Haut vollständig von dem vorderen Teil des Embryos entfernt. <ol start="9"><li> Drehen des Embryos vorderen Seite zu der linken Seite. Mit einer Pinzette &quot;festzunageln&quot;, den Embryo in den vorderen Teil. Mit der anderen Pinzette greifen die Haut und ziehen in Richtung der rostralen Seite des Embryos. Das Rückenmark ist dann zugänglich. </li><li> Verwenden Sie eine Seite der Zange, um die Hirnhäute, die noch wickeln Sie das Rückenmark zu schneiden. Das Rückenmark ist jetzt geöffnet. </li><li> Drehen des Embryos Vorderseite nach rechts. </li><li> Lösen das Gewebe aus dem Rückenmark ausgehend von der zervikalen Seite des Embryos. Schieben der Zange unter dem Rückenmark (die Zange geschlossen gehalten werden sollte, um Schädigung des Rückenmarks zu verhindern). Die Zange haben unter dem Rückenmark zu sehen sein. Kleine Drehbewegungen unter dem Rückenmark sind ausreichend, um das zu lösenumliegende Gewebe und die dorsale Wurzelganglien (DRG). </li></ol> Hinweis: Leaving angebracht umliegende Gewebe Gewicht auf das Rückenmark, wodurch die Wahrscheinlichkeit, im nächsten Schritt bricht es zu. <ol start="13"><li> Legen Sie die isolierten Rückenmark in einem frischen Tropfen kaltem HBSS-6,5% Glucose. </li><li> Legen Sie das Rückenmark in einer flachen Position, Hirnhaut auf der Oberseite und vordere Seite vom Experimentator. </li><li> &quot;Festzunageln&quot;, die das Rückenmark mit dem restlichen Hinterhirn mit einer Zange und mit den zweiten Pinzette greifen die Hirnhäute. Ziehen Sie die Hirnhaut ab dem rostralen Seite des Rückenmarks. </li></ol> Hinweis: Die Bewegung sollte langsam und konstant jede Brechen der Wirbelsäule zu vermeiden. Schwingbewegungen kann die Ablösung der Meningen erleichtern. 1.2 FP-Dissektion <ol><li> Drücken Sie den Hinterhirn mit einer Pinzette. </li><li> Die FP ist die zentrale transparent Teil des Gewebes. Mit einem Skalpell schneiden Sie die Bodenplatte. </li></ol> Hinweis: Um beide Seiten mit der gleichen Qualität zu schneiden, gehen von der rostralen Seite und abwechselnd schneiden die rechte Seite und die linke Seite der Bodenplatte. <ol start="3"><li> Schützen Sie die FP seziert in Neurobasalmedium bei Raumtemperatur. </li></ol> 2. FP Kultur Hinweis: Alle Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube durchgeführt werden. Verwenden Sie frisches Medium und frisch aufgetaut Ergänzungsmittel und Reagenzien. Bereiten sterilen Glasdeckgläser, warm Neurobasalmedium + B27, Plasma und HBSS-Thrombin. 2.1 FP Kultur <ol><li> Legen Sie mehrere sterile Deckgläschen in einer 100 mm Petrischale und Pipette 20 ul Plasma in der Mitte jedes Deckglas. </li><li> Bringen Sie zwei vor vier FP in jeder Plasmaverlust und mit 20 ul HBSS-Thrombin neben dem Plasmaabfall und vorsichtig mischen. Halten Sie die Deckgläserfür mindestens zehn Minuten bei Raumtemperatur zur Gerinnung des Plasmas zu ermöglichen. </li></ol> Hinweis: Transfer beiden FPs bei vollständiger Dissektion und mehr bei Teilzerlegung. Mischen Sie langsam mit einer Pipettenspitze und Kontakt mit den FP-Explantate zu vermeiden. Die Plasmagerinnsel fährt wenigen um als ein Zeichen der Koagulation. Die Koagulation nicht vorzeitig abgebrochen werden, um ein Ablösen der Plasmagerinnsel zu vermeiden. <ol start="3"><li> Übertragen Sie jede Deckglas in einer 24-Well-Platte und fügen Sie 500 ul Neurobasal + B27. Inkubiere 48 Stunden bei 37 ° C. </li></ol> TAG 3 3. FP-konditioniertem Medium (FP cm) Ernten Hinweis: Die Ernte sollte unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube durchgeführt werden. Wenn der Überstand wird während der Kultur peri verunreinigt oder Bodenplatten sind schwimmende (das heißt, sie hätte sterben könnenod), dann haben die FP cm nicht ernten von diesem auch. FP 3.1 cm Ernte <ol><li> Ernten Sie sorgfältig das Medium aus jedem Well. </li></ol> Hinweis: die polymerisierte Plasma-Thrombin-Mix oder keine FP-Fragmente pipettieren. <ol start="2"><li> Speichern 100 ul Aliquots bei -80 ° C. </li></ol> TAG 4 4. Dissektion der Spinal Cord Commissural Neuronen aus E12.5 Maus Embryonen Hinweis: Die Zubereitung muss nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Folgen Sie der oben beschriebenen, um die Embryonen zu sammeln Verfahren. Bereiten kaltem PBS, kaltem HBSS-6.5% Glucose und kalt Neurobasalmedium. 4.1 Rückenmark Dissektion <ol><li> Mit einer Pinzette, den Embryo zu enthaupten. </li></ol> Hinweis: zwischen Unterkiefer und Hinterhirn Schneiden, ist der hintere Teil des Hinterhirn wichtig für dienächsten Schritte. <ol start="2"><li> Setzen Sie den Embryo ventralen Seite nach unten in einem frischen Tropfen mit dem vorderen Teil mit Blick auf den Experimentator. </li><li> Klemmen Sie die Haut der Embryo mit einer Pinzette und mit der anderen ziehen weg die Haut. </li></ol> Anmerkung: Dieser Schritt ist zu wiederholen, bis die Haut vollständig von dem vorderen Teil des Embryos entfernt. <ol start="4"><li> Drehen des Embryos vorderen Seite zu der linken Seite. Mit einer Pinzette &quot;festzunageln&quot;, den Embryo in den vorderen Teil. Bei den anderen Zangen, greifen die Haut und ziehen in Richtung der rostralen Seite des Embryos, um das Rückenmark aus. </li><li> Verwenden Sie eine Seite der Zange, um die Hirnhäute, die noch wickeln Sie das Rückenmark zu schneiden. Das Rückenmark liegt nun frei und offen. </li><li> Positionieren des Embryos Vorderseite nach rechts. </li><li> Lösen das Gewebe aus dem Rückenmark ausgehend von der zervikalen Seite des Embryos. Schieben Sie die Zange unter dem Rückenmark (halten die Zange geschlossen). FürSteinpilze müssen unter dem Rückenmark sichtbar. Kleine Drehbewegungen unter der Wirbelsäule ausreichend, um das angrenzende Gewebe und die dorsalen Wurzelganglien (DRG) zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die isolierten Rückenmark in einem neuen Tropfen kaltem HBSS-6,5% Glucose. </li><li> Legen Sie das Rückenmark in einer flachen Position, Hirnhaut auf der Oberseite und vordere Seite vom Experimentator. </li><li> &quot;Festzunageln&quot;, die das Rückenmark mit dem restlichen Hinterhirn mit einer Zange, mit der zweiten Zange greifen die Hirnhäute. Ziehen Sie die Hirnhaut ab dem rostralen Seite des Rückenmarks. </li></ol> 4.2 Commissural Neuron Dissektion <ol><li> Drücken Sie den Hinterhirn mit einer Pinzette. </li><li> Die Commissural Neuronen in der am Seitenteil des Rückenmarks (der Rückenseite). Schneiden Sie dieses Seitenteil mit einem feinen Skalpell. </li></ol> Hinweis: Das Rückenteil des Rückenmarks können aus dem ventralen Teil durch die Differenz der Zell d unterschieden werdenichte, wobei der ventrale Teil mehr undurchsichtig. Hinweis: Um beide Seiten mit der gleichen Qualität zu schneiden, gehen von der rostralen Seite und abwechselnd schneiden Sie ein kleines Länge der rechten Seite und der linken Seite. <ol start="3"><li> Schützen Sie die sezierten Gewebes in Neurobasalmedium auf Eis für den sofortigen Einsatz. </li></ol> 5. Die Behandlung von Commissural Tissue mit der FP cm Hinweis: Dieses Verfahren gilt nicht sterilen Bedingungen. Das Gewebe sollte im Einzel 1,5-ml-Röhrchen gesammelt werden. Der gefrorene FP cm sollte nur einmal verwendet werden. Vermeiden Sie mehrfache Wiedereinfrieren. Bereiten warmen FP cm (37 ° C). 5.1 Behandlungen von kommissuralen Neuronen <ol><li> Dilacerate die kommissuralen Gewebe mit kleinen Schere. </li></ol> Hinweis: Schneiden Sie das Gewebe so klein wie möglich, um die Zugänglichkeit der Zellen verstärken. <ol start="2"><li> Verteilen ziemlich das Gewebe zwischen den verschiedenen experimentellen Bedingungen Kontrollbehandlung und FP cm Behandlung. </li><li> Zentrifugieren Gewebefragmente bei 800 × g für 1 min bei 4 ° C </li><li> Überprüfen Sie die Aufteilung zwischen den Röhren. </li></ol> Hinweis: Bei Bedarf umverteilen und Zentrifuge wieder, bis Fragmente werden gleichmäßig verteilt. <ol start="5"><li> Entfernen Sie den Überstand. </li><li> In den warmen FP cm und Kontrollbehandlungen zu den Geweben. </li></ol> Hinweis: Das Volumen bezieht sich auf die Menge der Pellets eingestellt werden und sollte mindestens das Doppelte des Volumens der Tablette sein. <ol start="7"><li> Inkubieren bei 37 ° C für 30 min. </li></ol> Hinweis: Behutsam alle 10-15 min schütteln <ol start="8"><li> Zentrifugieren bei 800 g für 1 min und entfernen Sie die Behandlung. </li><li> Fügen Sie die Lyse-Puffer </li></ol> Hinweis: Die Lautstärke muss auf die eine eingestellt werdenHalterung des Pellets und sollte mindestens das doppelte Volumen des Pellets sein. <ol start="10"><li> Pipette auf und ab, um das Pellet zu resuspendieren. </li></ol> Hinweis: Ein Wirbel kann ebenfalls verwendet werden. <ol start="11"><li> Inkubation 15 min auf Eis. </li><li> Zentrifugieren bei 14000 × g für 15 min bei 4 ° C </li><li> Halten Sie den Überstand und messen die Menge des Proteins mit einem Bradford-Test 9. </li><li> In 6x Laemmli-Puffer. </li><li> Inkubieren bei 95 ° C für 5 min auf den Proteingehalt zu denaturieren. </li></ol> Hinweis: Die Proben können sofort verwendet werden oder bei -80 ° C gelagert werden <ol start="16"><li> Bewerten Sie die Auswirkungen der Behandlung durch Western-Blot-10. </li></ol> Hinweis: Mindestens 50 ug Gesamt-Proteine ​​sollten für jede Bahn geladen werden.

<ol><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system%3A+how+to+cross+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li>
<li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+floor+plate%3A+multiple+cells%2C+multiple+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li>
<li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li>
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<li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li>
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<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
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<li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Die Produktion von Bodenplatte konditionierten Medium bietet eine effiziente und einfache Möglichkeit für die Beurteilung der biologischen Eigenschaften der Bodenplatte frei Signale. Das Plasma-Thrombin-Matrix bietet eine hervorragende Voraussetzung für die Gewebeüberlebens. Dennoch könnte diese angereicherten Umgebung eine Beschränkung für einige Typen von Experimenten. So kann die Bodenplatte Gewebe auch in Agarose-Matrix kultiviert werden. Die Qualität der Bodenplatte konditionierte Mediu...

Die Bodenplatte ist eine bekannte Muster Zentrum der Entwicklung von Rückenmark, spielen Schlüsselrollen in der Spezifikation von Vorläufern und postmitotische Zelllinien und Steuerung Axon Navigation 7,8. Die hier beschriebene FP cm erzeugen experimentelle Verfahren ermöglicht Forschern, die funktionellen Eigenschaften der Bodenplatte abgeleiteten Signale in einem verschiedenen Kontexten von Entwicklungsprozessen von Zelle Strukturierung und das Überleben zu Zelle und Axon Migration zu beurteilen. Um die Verwendung solcher FP cm erläutern, werden dorsalen Rückenmarksgewebe enthält kommissuralen Neuronen seziert, dilacerated und mit der FP cm stimuliert. Die Gewebe können dann zur Western-Blot-Analyse verarbeitet. Dies ermöglicht die Untersuchung Bestimmungen des Axon Führung Maschinen durch Bodenplatte freigegeben Signale. Das Verfahren zur Behandlung von dilacerated frischem Gewebe hält den großen Vorteil der Erhaltung der Mikroumgebung der Zellen innerhalb the Gewebe. Somit werden die Auswirkungen der Behandlung von FP cm oder jede Behandlungsarten werden in einer physiologischen Weise als in Zell-und Gewebekulturbedingungen geprüft.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien erforderlich</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Ca2+/Mg2+- frei</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Sigma</td><td>P-3266</td><td>1 mg/ml (Rekonstitution in H2O und Filtrat)</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T-4648</td><td>10 mg/ml(Rekonstitution in H2O und Filtrat)</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>50x</td></tr><tr><td>HEPES (260 g/mol)</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5513</td><td>0,5 M, pH 8</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Euromedex</td><td>2189</td><td>1M</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>VWR</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten</td><td>Roche</td><td>04 693 116 001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat (Na3VO4)</td><td>Sigma</td><td>S-6508</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes H 2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 1.Reagenzien erforderlich. </td></tr><tr><td colspan="4">Werkzeuge und Materialien</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Adson-Zange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Tips Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Microknives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10136-14</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4">Tabelle 2. Werkzeuge und Materialien. </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Dissektion und FP-Kultur</td> </tr> <tr> <td>Ethanol 70%</td> <td></td> </tr><tr> <td>dissektion Haube</td> <td></td> </tr><tr> <td>Dissektionsmikroskop</td> <td></td> </tr><tr> <td>Petrischale</td> <td></td> </tr><tr> <td>Glasdeckgläser</td> <td>18 mm x 18 mm</td> </tr><tr> <td> Bunsen-Gasbrenner</td> <td></td> </tr><tr> <td>24-Well-Platte</td> <td></td> </tr><tr> <td>Gewebekultur-Inkubator (37 &Grad; C, 5% CO2, feuchtekontrolliert)</td> <td></td> </tr><tr> <td>Zentrifuge</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Recipes</td> </tr> <tr> <td colspan="2" >FP Nährmedien</td> </tr> <tr> <td>Neurobasal</td> <td></td> </tr><tr> <td>B27</td> <td>1/50e Verdünnung aus dem Stock</td> </tr><tr> <td colspan="2">HBSS-thrombin </td> </tr> <tr> <td>HBSS</td> <td>1 ml </td> </tr><tr> <td>Thrombin 10 mg/ml</td> <td>30 &mu; l</td> </tr><tr> <td colspan="2">Lysepuffer pH 7,4</td> </tr> <tr> <td>HEPES (260 g/mol) </td> <td>25 mM</td> </tr><tr> <td>EDTA (pH 8) </td> <td>5 mM</ td> </tr><tr> <td>MgCl2 </td> <td>1 mM</td> </tr><tr> <td>Glycerin </td> <td>10%</td> </tr><tr> <td>IGEPAL (NP40) </td> <td>0,10%</td> </tr>< tr> <td>Protease-Inhibitor-Cocktail </td> <td>1x</td> </tr><tr> <td>Natriumorthovanadat </td> <td>0,2 M</td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Laemmli Puffer</td> </tr> <tr> <td>Tris 0,5 M, pH 6,8 </td> <td>375 mM</td> </tr><tr> <td>SDS</td> <td>6%</td> </tr><tr> <td>Glycerin</td> < td>60%</td> </tr><tr> <td>DTT</td> <td>0,6 M</td> </tr><tr> <td>Bromphenol blue</td> <td></td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </ tr></tbody> </Tabelle></td></tr></tbody></table>

kultur von isolierten bodenplatte tissue und produktion von konditioniertem medium, um funktionelle eigenschaften von bodenplatte aufgelegt signale beurteilen

Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

Während der Entwicklung Vorfahren und post-mitotischen Neuronen empfangen Signale von benachbarten Gebieten, die ihr Schicksal zu regulieren. Die Bodenplatte ist eine Gruppe von Gliazellen entlang der Ependymzellen Kanal in Bauchlage. Die Bodenplatte drückt Taste Morphogenen Beitrag zur Strukturierung der Zelllinien in das Rückenmark. In späteren Entwicklungsstadien, die Bodenplatte regelt die Navigation der Axone im Rückenmark, als ein Hindernis für die Überquerung des ipsilateralen Axone und Controlling Mittellinie Kreuzung von kommissuralen Axone 1 zu verhindern handeln. Diese Funktionen werden durch die Sekretion verschiedener Führungssignale erreicht. Einige dieser Hinweise dienen als Lockmittel und Repellentien für die wachsenden Axone während andere regeln Führung Rezeptoren und nachgeschalteten Signal, um die Empfindlichkeit der Axone zu den lokalen Führungssignale 2,3 modulieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Untersuchung der Eigenschaften von Boden-Platte abgeleiteten Signale in einer Vielzahl von Ent erlaubtlopmental Zusammenhänge, bezogen auf die Produktion von Boden-Platte konditionierten Medium (FP cm) 4-6. Wir veranschaulichen dann die Verwendung dieses FP cm im Rahmen der Axon Führung. Zunächst wird das Rückenmark von Mausembryo bei E12.5 isoliert und der Boden-Platte herauspräpariert und in einem Plasma-Thrombin-Matrix (Abbildung 1) kultiviert. Zweite zwei Tage später, sind kommissuralen Gewebe aus E12.5 Embryonen seziert, zerrieben und mit der FP cm ausgesetzt. Drittens werden die Gewebe für die Western-Blot-Analyse der Kommissuren Marker verarbeitet.

Kommissur-Gewebe wurden durch das FP cm behandelt, und die Proben wurden zur Analyse der Rezeptorspiegel im Western-Blot bearbeitet. Die Anwendung der FP cm wurde gezeigt, um die Ebenen eines Führungs Rezeptor, PlexinA1, die die Empfindlichkeit des kommissuralen Axone der Mittellinie abweisend Semaphorin3B nach der Überquerung (Abbildung 2) vermittelt zu erhöhen. Dies zeigte, dass Signale, die von der FP veröffentlicht regulieren PlexinA1 Ebenen 4,6. <p class="jove_c...

Die Bodenplatte ist eine wichtige Struktur der Entwicklung des Rückenmarks und bietet diffusionsfähige Signale an Vorläuferzellen und Neuronen differenzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Bodenplatte konditionierten Medium zu produzieren, um es an die frische Rückenmarksgewebe anzuwenden und die Auswirkungen auf die Proteine ​​von Interesse durch Biochemie beurteilen.

Kultur von isolierten Bodenplatte Tissue und Produktion von konditioniertem Medium, um funktionelle Eigenschaften von Bodenplatte aufgelegt Signale beurteilen

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Eigenschaften von von Bodenplatten abgeleiteten Signalen in einer Vielzahl von Entwicklungskontexten zu untersuchen, die auf der Produktion von Bodenplatten-konditioniertem Medium basieren. Dazu wird zunächst das Rückenmark vom Mausembryo bei E 12,5 isoliert und die Bodenplatte präpariert. Der zweite Schritt besteht darin, die Bodenplatte in einer Plasma-Thrombin-Matrix zu kultivieren, um konditionierte Medien für die Bodenplatte herzustellen.Als nächstes wird das Rückenmark von Mausembryonen bei E 12,5 isoliert und dorsales Gewebe, das komm, chorale Neuronen enthält, präpariert. Der letzte Schritt ist die Tation und Exposition von präpariertem Kommunikationsgewebe mit Proben von Bodenplatten-konditioniertem Medium. Letztendlich wird das Gewebe für biochemische Analysen wie den Western Blot aufbereitet, um die Expression der Kommissuralmarker zu zeigen.Diese Methode kann zuki bei der Frage im Bereich der Entwicklungsbiologie helfen. Signale, die von der Bodenplatte freigesetzt werden, spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Zellfett, Differenzierung, Proliferation und Axonführung von Geweben und Zellen unterschiedlicher Herkunft. ZA werden dem Bodenplatten-Zustandsmedium ausgesetzt, was zeigt, dass das Verfahren für einen A-Techniker aus dem Labor freundlich ist.Beginnen Sie diesen Eingriff, indem Sie eine euthanasierte schwangere E 12,5-schwangere Maus mit der Bauchseite nach oben legen. Tränken Sie den Bauch mit 70%Ethanol. Kneifen Sie anschließend mit einer Pinzette in die Haut des Bauches und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere durch die Haut und die Bauchfellschichten.Machen Sie einen Schnitt, um die Bauchhöhle freizulegen. Auf jeder Seite der Maus befindet sich eine Reihe von Embryonen. Fassen Sie ein Horn der Gebärmutter in das Gewebe zwischen zwei Embryonen und präparieren Sie es vom äußeren Teil aus.Übertragen Sie dann die intakte Gebärmutter in eine 100 Millimeter große Petrischale mit kaltem PBS auf Eis. Als nächstes extrahieren Sie die Embryonen aus dem extraembryonalen Gewebe. Fassen Sie das dunkelrote Plazentagewebe mit zwei Pinzettenpaaren und ziehen Sie sanft, um das Gewebe zu zerreißen und die Embryonen aus dem Gebärmuttersack zu entfernen.Legen Sie einen Embryo in eine Sezierhaube in einen Tropfen kalte HBSS-Glukose. Nachdem Sie den Embryo enthauptet haben, platzieren Sie den Embryo mit der Bauchseite nach unten, wobei der vordere Teil dem Versuchsleiter zugewandt ist. Mit einer Pinzette die Haut des Embryos einklemmen und mit dem anderen Paar die Haut wegziehen.Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Haut vollständig vom vorderen Teil des Embryos entfernt ist. Drehen Sie dann die vordere Seite des Embryos mit einer Pinzette nach links. Fixieren des Embryos im vorderen Teil.Lassen Sie die andere Pinzette die Haut greifen und zur rostralen Seite ziehen, um das Rückenmark freizulegen. Als nächstes schneidest du mit einer Seite der Pinzette die Hirnhäute durch, die das Rückenmark noch umschließen. Das Rückenmark ist nun offen.Drehen Sie dann die Embryonen mit der Vorderseite Ihrer Seite nach rechts. Lösen Sie das Gewebe vom Rückenmark, beginnend mit der zervikalen Seite des Embryos, indem Sie die Pinzette unter das Rückenmark schieben und das umgebende Gewebe und die Spinalganglien mit kleinen Drehbewegungen lösen. Legen Sie dann das isolierte Rückenmark in einen frischen Tropfen kaltes HBSS in einer flachen Position, mit Hirnhäuten oben und der vorderen Seite vom Experimentator weg.Anschließend wird mit einer Pinzette das Rückenmark über das verbleibende Hinterhirn fixiert und mit der zweiten Pinzette die Hirnhäute gegriffen. Dann ziehen Sie die Hirnhäute beginnend von der rostralen Seite des Rückenmarks mit langsamer und konstanter Bewegung für die Dissektion der Bodenplatte ab. Kneifen Sie das Hinterhirn mit einer Pinzette ein und schneiden Sie die Bodenplatte mit einem Skalpell heraus.Konservieren Sie dann die präparierte Bodenplatte in neurobasalem Medium. Fügen Sie Raumtemperatur hinzu. Legen Sie bei diesem Verfahren mehrere sterile Deckgläser in eine 100 Millimeter Petrischale.Pipettieren Sie anschließend 20 Mikroliter Plasma in die Mitte jedes Deckblatts. Übertragen Sie dann zwei bis vier Bodenplatten auf jeden Plasmatropfen. Fügen Sie dem Plasmatropfen 20 Mikroliter HBSS-Thrombin hinzu Mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze und vermeiden Sie den Kontakt mit den Explantaten der Bodenplatte und bewahren Sie die Deckgläser mindestens 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, um eine Koagulation des Plasmas zu ermöglichen.Das Plasmagerinnsel zieht sich als Zeichen der Gerinnung um einige Mikrometer zurück und die Gerinnung darf nicht vorzeitig gestoppt werden, um eine Ablösung des Plasmagerinnsels zu vermeiden. Übertragen Sie anschließend jeden Deckglas auf eine Vier-Well-Platte und fügen Sie 500 Mikroliter Neurobasal plus B 27 hinzu. Inkubieren Sie sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Ernten Sie nach 48 Stunden in einer Gewebekulturhaube das Medium von beiden. Nun, vorsichtig. Achten Sie darauf, das polymerisierte Plasma-Thrombin-Gemisch oder Fragmente der Bodenplatte nicht zu pipettieren.Lagern Sie dann 100 Mikroliter Aliquots bei minus 80 Grad Celsius. Die Kommissuralneurone befinden sich im äußersten seitlichen Teil des Rückenmarks. Um die Kommissuralneurone zu präparieren, kneift man das Hinterhirn mit einer Pinzette zusammen und schneidet den lateralen Teil mit einem feinen Skalpell heraus.Konservieren Sie dann das präparierte Gewebe in neurobasalem Medium auf Eis. Für den sofortigen Einsatz zur Behandlung der comm choralen Neuronen das Chorgewebe mit einer kleinen Schere zerreißen. Schneiden Sie das Gewebe so klein wie möglich, um die Zugänglichkeit der Zellen zu potenzieren.Verteilen Sie anschließend das Gewebe gleichmäßig auf die verschiedenen Versuchsbedingungen. Kontrollbehandlung und Bodenplattenbehandlung mit konditioniertem Medium. Anschließend zentrifugieren Sie die Gewebefragmente bei 800 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius.Überprüfen Sie dann gegebenenfalls die Aufteilung zwischen den Rohren. Umverteilen und erneut zentrifugieren, bis die Fragmente gleichmäßig verteilt sind. Entfernen Sie danach den Überstand, fügen Sie dem Gewebe eine warme Bodenplatte, ein konditioniertes Medium hinzu oder kontrollieren Sie die Behandlungen.Inkubieren Sie das Gewebe anschließend 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es alle 10 bis 15 Minuten vorsichtig. Zentrifugieren Sie sie dann eine Minute lang bei 800 mal G und entfernen Sie die Behandlung am Ende. Fügen Sie den Lysepuffer hinzu.In diesem Experiment wurde dorsales spinales Gewebe entnommen, dilaceziert und mit dem Bodenplattenkonditionierungsmedium bzw. Kontrollmedium stimuliert. Die Proben wurden lysiert und für Western Blot aufbereitet. Die Proteine wurden dann mit Antikörpern, Plex und einem Ein- und Beta-Aktin untersucht.Hier zeigt der Western Blot eine Zunahme des Plex und einen Spiegel von eins in der Probe, die mit dem mit der Bodenplatte konditionierten Medium stimuliert wurde. Der Dot-Blot zeigt die Expression von GDNF in einem mit Bodenplatten konditionierten Medium im Vergleich zu seinem Kontrollmedium. Nach diesem Verfahren oder der Methode könnte die Methode durchgeführt werden, anstatt für westliches Blut stimuliert und verarbeitet zu werden.Das Gewebe, das die interessierenden Zellen enthielt, konnte dissoziiert werden, und isolierte Zellen konnten auf Deckgläsern plattiert werden. Das Bodenplatten-Bedingungsmedium kann auf Kulturzellen aufgebracht werden, und die Modifikation des Zellverhaltens oder der Proteinexpression könnte beispielsweise durch Immunchemie bewertet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene Teile des Rückenmarks mögen und wie Sie akutes frisches Gewebe stimulieren können, bevor Sie mit der Biochemie fortfahren.

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir stellen ein neues Verfahren für die Pflege der menschlichen Darmschleimhaut in Kultur und Überwachung der Reaktion auf verschiedene Arten von Stimuli über mindestens 24 Stunden. Mit unserer Methode wird die Polarität des Gewebes aufrechterhalten wird, so dass für eine physiologische Stimulation über die apikale Route.

Eine neue Methode für die Kultur und polarisierte Stimulation der menschlichen Darmschleimhaut Explantate

Bakterien produzieren sezernierten Verbindungen, die das Potenzial, die Physiologie der Mikroorganismen ihre Nachbarn beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur Bildschirm, der Nachweis solcher chemisch vermittelte Inter Wechselwirkungen durch Mischen von Bodenmikroben mit fluoreszierenden Reporter-Transkriptions Stämmen von Bacillus subtilis auf festen Medien ermöglicht.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

Das folgende Protokoll beschreibt das Verfahren zum Assemblieren von sandwichartigen Kulturen, die als Zwischenstufe zwischen zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) zellulären Umgebungen verwendet werden sollen. Die technischen Systeme können in der Mikroskopie, Biomechanik, Biochemie und Zellbiologie eingesetzt werden.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Die extrazelluläre Matrix spielt eine wichtige Rolle bei der Definition der Mikroumgebung von Zellen und bei der Modulation des Zellverhaltens und des Phänotyps. Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Isolierung zelleigener extrazellulärer Matrix, die für mikroskopische, biochemische, proteomische oder funktionelle Studien an verschiedene Skalen angepasst werden kann.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

Dieses Protokoll bietet eine kostengünstige Möglichkeit zu isolieren und zu charakterisieren Maus primäre renale tubuläre Zellen, die anschließend südlich kultiviert werden können, um renale biologischen Funktionen ex Vivo, einschließlich der mitochondrialen Bioenergetik zu beurteilen.

Isolierung, Charakterisierung und hohem Durchsatz extrazelluläre Flux-Analyse der Maus primäre renale tubuläre Epithelzellen

Enterochromaffinen (EG) Zellen umfassen eine kleine Teilmenge der Magen-Darm-Epithelzellen. EG-Zellen elektrisch erregbar sind und Serotonin, noch Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Identifizierung von EG-Zellen physiologische Studien beschränkt haben. Die hier vorgestellte Methode stellt eine Primärkultur Modell zur Untersuchung von Einzelzellen EG zugänglich durch Elektrophysiologie.

Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Entwicklung und den Einsatz einer Phalloidin-basierten filamentösen Aktin-Färbetechnik mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) zur Visualisierung der adhärenten Zellschichtstruktur in mikrofluidischen dynamischen Kulturkanälen und traditionellen statischen Fix-Well-Kulturkammern. Dieser Ansatz hilft bei der Bewertung der Zellschichtkonfluenz, der Monolagenbildung und der Gleichmäßigkeit der Schichtdicke.

Präparation und strukturelle Bewertung von Epithelzell-Monoschichten in einer physiologisch dimensionierten mikrofluidischen Kulturanlage

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Kultivierung von IDG-SW3-Zellen in einer dreidimensionalen (3D) extrazellulären Matrix vor.

IDG-SW3 Zellkultur in einer dreidimensionalen extrazellulären Matrix

Erfahren Sie die Kultivierung von isoliertem Bodenplatten-Gewebe zur Produktion von konditioniertem Medium für biochemische Analysen von Rückenmarksentwicklung bei Maus-Embryonen.

Kultur von isolierten Bodenplatte Tissue und Produktion von konditioniertem Medium, um funktionelle Eigenschaften von Bodenplatte aufgelegt Signale beurteilen (Video) | JoVE Journal

Kultur von isolierten Bodenplatte Tissue und Produktion von konditioniertem Medium, um funktionelle Eigenschaften von Bodenplatte aufgelegt Signale beurteilen

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