Neuartiger quantitativer Ganzgewebe-Assay des Stickoxid-Spiegels bei neuroinflammatorischer Reaktion von Drosophila

Dieses Protokoll bietet Forschern kleiner Organismen eine empfindliche, quantitative und kosteneffiziente Methode zum Nachweis der Induktion der Stickoxid-Synthase-Aktivität. Zuerst wird das gesamte Gewebe wie die adulte Drosophila des Gehirns präpariert, das intakte Gewebe wird in Insektenkulturmedium inkubiert, um die Diffusion von Stickstoffmonoxid zu ermöglichen. Trennen Sie nun das Kulturmedium und die Gewebeprobe.

Mischen Sie dann das konditionierte Nährmedium mit modifiziertem Fettreagenz, um den Nitritgehalt und den Indikator für die Stickoxidproduktion zu ermitteln. Messen Sie anschließend die Resorption des farbigen Reaktionsprodukts und quantifizieren Sie die Werte anhand einer Standardkurve für die Nitritkonzentration. Letztendlich wird diese Farbmetrik verwendet, um die endogene katalytische Aktivität der Stickstoffmonoxidsynthase zu zeigen.

Während diese Methode entwickelt wurde, um nützliche Einblicke in die GSOF- und Neurobiologie und die angeborene Immunität zu liefern, kann sie auch auf andere Modellsysteme angewendet werden, wie z. B. Wirbellosenmodelle menschlicher Krankheiten und Entwicklung sowie auf Gewebe außerhalb des zentralen Nervensystems. Aliquotieren Sie 50 Mikroliter des Insektenmediums von Grace in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte oder in Zentrifugenröhrchen, wie hier gezeigt, und beschriften Sie die Fliegen entsprechend vollständig. Übertragen Sie dann mehrere Fliegen auf einen Objektträger.

Fügen Sie eine kleine Menge PBS als Präparierpuffer hinzu, enthaupten Sie dann die Fliegenköpfe unter einem Präpariermikroskop, vermeiden Sie Austrocknung, und entsorgen Sie die Fliegenkörper. Extrahieren Sie nun das gesamte Gehirn und entfernen Sie vorsichtig die Nagelhaut, Partikel und jegliches Gewebe, das nicht zum Gehirn gehört, wie z. B. das Augenpigmentgewebe. Übertragen Sie das präparierte Gehirn in das entsprechend beschriftete Röhrchen und wiederholen Sie die Dissektionen für mindestens 20 Gehirne pro Gruppe.

Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, sobald die Ernte eines Arbeitssets abgeschlossen ist, und inkubieren Sie die Gehirnproben sechs Stunden lang bei 25 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Bereiten Sie das modifizierte Fettreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und bewahren Sie es bis zur Verwendung im Dunkeln auf. Erstellen Sie dann eine Nitrit-Standardkurve unter Verwendung einer Reihe von acht Reihen der Verdünnung von Natriumnitrit.

Beschriften Sie außerdem zwei sterile 0,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen für jede Behandlungsgruppe sowie die Kontrolle zu den entsprechenden Zeitpunkten. Übertragen Sie das Gnadenmedium jeder Probe aus der Mikrotitervertiefung in das entsprechende Mikrozentrifugenröhrchen, um Gehirn- oder Gewebepartikel durch Zentrifugation bei 8, 175-facher Schwerkraft für zwei Minuten zu zerkleinern, ohne das Pellet zu stören. Übertragen Sie 30 Mikroliter der Überstände in den zweiten Satz entsprechender Röhrchen.

Geben Sie nach fünf bis 10 Minuten, jedoch innerhalb von 30 Minuten, ein gleiches Volumen Fettreagenz in jede Vertiefung. Messen Sie die Extinktion bei 548 Nanometern. Wiederholen Sie jeden Messwert mindestens dreimal und durchschnittlich drei Outs.

Stellen Sie sicher, dass Sie das Gerät zwischen sechs und 10 Messwerten ausblenden, und führen Sie die Blindsteuerung für die Bestimmung der Standardabweichung durch. Berechnen Sie nun den relativen Nitritgehalt in jeder Probe. Zuerst werden die Werte der bekannten Konzentrationen aus der Nitrit-Standardkurve unter Verwendung der Absorption auf der Y-Achse und der Konzentration auf der x-Achse aufgetragen.

Bestimmen Sie die Steigung der am besten passenden Linie und lösen Sie die Gleichung für X.Ersetzen Sie nun einfach die Absorptionswerte durch Y und lösen Sie nach X, was die Konzentration darstellt. Dieses erwachsene männliche Gehirn wurde zwei bis drei Tage nach der Eclo präpariert, wobei das Mittelhirn und der Sehlappen intakt waren. Eine typische Paraquat-Toxizitätskurve legt eine wirksame letale Dosis und einen toxischen Behandlungsbereich zwischen 1,25 und 10 Millimolar fest.

Co-Behandlung von Fliegen mit Paraquat und lna. Ein kompetitiver Inhibitor der Stickstoffmonoxid-Synthase führte zu einer signifikanten Rettung der Lebensdauer. Die durch Paraquat-Verschlucken verursachte Haltung von Fliegen, die mit Paraquat und inaktivem DA-Isomer behandelt wurden, zeigten keine Verbesserung des Überlebens.

Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass die Unterdrückung von Entzündungen durch die Hemmung von NOS das Überleben von mit Paraquat behandelten Fliegen erhöht, was eine weitere Bestätigung für eine NOS-vermittelte Paraquat-Reaktion darstellt. Veränderungen der NOS-Proteinspiegel wurden direkt gemessen. Der NOS-Proteinspiegel stieg in Abhängigkeit von der Paraquat-Konzentration an.

Die Behandlung von Fliegen mit 10 Millimolar Paraquat über eine Expositionsdauer von sechs bis 30 Stunden führt zu einer anfänglichen Zunahme und dann zu einer Abnahme mit zunehmender Expositionszeit. Diese Daten stimmen mit den Mustern der Nitritgehalte überein, die in unserer Variante des Fetttests beobachtet wurden. Interessanterweise gibt es eine lineare Beziehung zwischen dem Anstieg der Paraquat-Konzentration und dem Ausmaß der Entzündungsreaktion, wie sie durch die Sekretion und den Nachweis von Stickstoffmonoxid definiert wird.

Im basalen Spiegel sezernieren heterozygote Punch-Mutanten, die eine geringere Menge des NOS-Cofaktors BH vier produzieren, etwas geringere Mengen an Stickstoffmonoxid. Eine Variation, die mit früheren Nachweismethoden wie NAD pH und Diaphra HISTOCHEMICAL Assay nur schwer zu erkennen wäre. Bei der Fütterung mit Paraquat wurde in der Punch-Mutante ein ausgeprägter Anstieg der Stickoxidwerte beobachtet, jedoch deutlich geringer als bei den mit Wildtyps behandelten Fliegen, wenn mit Toxinen oder Chemikalien gearbeitet wurde.

Es ist wichtig, sowohl eine Expositionszeitkurve als auch eine konzentrationsbasierte Toxizitätskurve zu erstellen, da diese Bedingungen die Empfindlichkeit des Assays dramatisch verändern können. So führt beispielsweise eine Behandlung mit fünf Millimol oder Paraquat nach 24 Stunden Exposition zu einem maximalen NO-Nachweis. Im Vergleich dazu führte die Exposition gegenüber 10 millimolaren Paraquat zu einer schnelleren Induktion, aber auch zu einem schnelleren Abklingen der Aktivität bei längerer Exposition.

Kein Molekül ist instabil und hochreaktiv. Ein erfolgreicher Assay muss daher Inkubationsbedingungen beinhalten, die ein optimales Gleichgewicht zwischen der fortgesetzten Induktion von NOS und dem schnellen Umsatz von no bieten. In diesem Experiment, in dem präparierte Gehirne vor der Zugabe des Fettreagenzes im Nährmedium inkubiert wurden, erzeugte eine sechsstündige Inkubation bei Raumtemperatur maximale Nitritwerte in der nachfolgenden Fettreaktion.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Stickstoffmonoxid extrem instabil ist und einen schnellen Umsatz erfährt, was zu einem Verlust der Assay-Empfindlichkeit führen kann. Wenn die Inkubationszeiten nicht sorgfältig kontrolliert und überwacht werden, sollten Sie mehrere Bedingungen in Ihrem Modell testen, um reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.