Name: In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Elektroporation und Zeitraffer-Imaging zur Analyse der Neuroblastenmigration in akuten Hirnschnitten der Maus. Diese Methode ermöglicht die quantitative Untersuchung zellulärer Dynamiken in der postnatalen Neurogenese.

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MS und YZ werden von KCL KCL-und PhD student China unterstützt. MO wurde von einem Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council Doktoranden-Stipendium gefördert. Wir danken Masaru Okabe und Jun-ichi Miyazaki für die pCX-EGFP-Plasmid und Alain Chedotal und Athena Ypsilanti für wertvolle Erfahrungsberichte Elektroporation.

Dieses Verfahren steht im Einklang mit den britischen Home Office Verordnungen (Tier Scientific Procedures Act, 1986). Wissenschaftler sollten die etablierten und durch ihre institutionelle und nationale Regulierungsorganisationen Tier genehmigten Richtlinien zu folgen. 1. Postnatale Elektroporation 1.1. Herstellung von Glas-Kapillaren, DNA-Lösung und Electroporator <ol><li> Bereiten zogene Glaskapillaren (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) für die DNA-Injektion. (Richt Einstellungen für eine Sutter P-97-Kapillare Zieher sind: Wärme 283; Ziehen 50; Velocity 90; Zeit 50). Machen Sie eine Markierung an der Kapillare entspricht einem Volumen von ca. 2 ul. </li><li> Stellen Sie die Spannung des Elektroporator bis 5 Rechteckimpulse, 50 ms / Puls bei 100 V, mit 850 ms Intervallen (100 V, 50 ms Puls ON, Puls 850 ms OFF, Puls 5). </li><li> Verdünnen hochreinen (OD 260/280&gt; 1,80) Endotoxin-freiem Plasmid-DNA bis zu einer Endkonzentration von 1-2 ug / ulmit Endotoxin frei Tris-EDTA-Puffer oder PBS. Es wird empfohlen, 0,1% Fast Green zu der DNA-Lösung (der Farbstoff in der Kammer verteilt, wenn erfolgreich injiziert) hinzuzufügen. </li><li> Bereiten Sie die Elektroden 5-7 mm, das Elektroden-Gel und erwärmen Sie das Heizkissen. </li></ol> 1.2. Elektroporation <ol><li> Entfernen einer postnatalen Tag 2 Maus-Welpe aus Käfig und betäuben sie durch Isofluran-Inhalation (bei einem Fluß von ~ 0,6 l / min). </li><li> Nach ca. 1 min, bestimmen den Zustand der Betäubung mit dem Fuß Prise Antwort. Wenn keine Bewegung stattfindet, fahren Sie mit intraventrikuläre Injektion. </li><li> Laden Kapillarnadel mit 1-2 &amp;mgr; l DNA mit einem Saugrohr mit der Kapillare verbunden ist. </li><li> Unter einer Kaltlichtquelle, halten Sie den Kopf des Welpen zwischen Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand. Etwas ziehen Sie die Haut wieder auf den Kopf, um die Identifizierung des richtigen Injektionsstelle zu helfen. </li><li> Betrachten Sie eine virtuelle Linie zwischen dem Auge und ter craniometric Wahrzeichen Lambda (Abbildung 1A). Legen Sie die Kapillarnadel bei etwa einem Drittel der Länge dieser Linie aus dem Lambda (ca. 1 mm von der Linie Mittelpunkt) 15. Legen Sie die Kapillare etwa 2 mm tief, achten Sie darauf, ein tiefes Eindringen in das Gehirn zu verhindern. </li><li> Injizieren Plasmid durch Blasen langsam durch den Mund (eine Spritze mit der Kapillare verbunden ist, kann auch verwendet werden). Während dieser Prozedur sicher, dass Ihre Finger nicht zu viel Druck auf das Gehirn, da dies erfolgreich Plasmid-Injektion zu verhindern. </li><li> Injektions stoppen, wenn eine minimale Menge an DNA-Lösung wird in die Kapillare verlassen. Es ist ratsam, weniger als 1 &amp;mgr; l injiziert, um schädliche Hirndruckanstieg zu vermeiden. </li><li> Mantel beide Elektroden mit Gel und sie mit der positiven Seite an der Seitenfläche der Halbkugel, wo die DNA injiziert wurde (Fig. 1A). Für die DNA-Einbau in den rostralen SVZ, Ort Elektroden etwas rostral derEinspritzstelle. Unterschiedliche Elektrodenposition regionale Spezifität der Elektroporation in verschiedenen Bereichen des SVZ 22,25 zu erreichen. </li><li> Initiieren Stromübertragung durch Drücken der Puls Fußschalter. Wenn die Elektroporation abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Spannung auf der Elektroporator Anzeige (Spannungswerte sollte nicht unter 90 V sein, da niedrigere Spannungswerte korrelieren mit schlechten Elektroporation Effizienz). </li><li> Reanimate den Welpen unter Sauerstoff auf Heizkissen für ein paar Minuten und wieder in den Käfig, indem sie weg von der Mutter. Achten Sie darauf, die Mutter ruft den Welpen und vereint sie mit dem Rest des Wurfes. Nach der Elektroporation verlassen Welpen mit ihrer Mutter für 4-7 Tage vor dem nächsten Schritt. </li></ol> 2. Vorbereitung der akuten Hirnschnittkulturen 2.1. Herstellung von Lösungen und Werkzeuge <ol><li> Die folgenden Lösungen erforderlich sind (es ist auch möglich, mit hohem Glucose DMEM zum Präparieren und Bildgebung17): Dissection Medium (500 ml) Gey-Balanced Medien - 500ml 45% Glukose - 5ml Film-Medium (10 ml) 45% Glukose - 0.110 ml HEPES 1 M - 0.100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutamin - 0.200 ml Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (Phenol-frei), - 8,89 ml </li><li> Warm up Film-Medium bei 37 ° C </li><li> Zeigen Milli fügt in eine 35 mm Glasbodenkulturschale mit 1 ml Medium Film und in einem befeuchteten Brutschrank bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Bereiten Vibratoms Zubehör (Schraubendreher, Kammer, Rasierklingen, Kleber). </li><li> Bereiten Dissektion Werkzeuge: Schere, Spachtel, gerade Pinzette. </li><li> Bereiten Sie Werkzeuge für den Umgang mit Scheiben: kleinen Pinsel oder weichen Impföse (Größe: 10 ul), Kunststoff-Pasteurpipetten, ein Eis-Box und mehrere 6 cm Plastikschalen. </li><li> Vorkühlung der Dissektion Mediumbei 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Herstellung von Hirnschnitten <ol><li> Füllen Sie eine 6 cm Schale mit vorgekühlten Dissektion Medium und auf Eis (mit frisch geschnittenen Scheiben zu halten). </li><li> Nach Genickbruch, mit einer Schere, um die Maus pup enthaupten. Entfernen Sie die Kopfhaut mit einem Skalpell, schneiden Sie den Schädel entlang der Mitte der Pfeilnaht von der OB an das Kleinhirn und entfernen Sie vorsichtig die Schädellappen mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gehirn ausgesetzt ist und sorgfältig sezieren sie mit Hilfe einer Spachtel, die besondere Sorgfalt, nicht um das Gewebe zu beschädigen. Die Präparation muss sorgfältig durchgeführt werden, aber zur gleichen Zeit sehr schnell (weniger als eine Minute, wenn möglich). Genickbruch ist unsere bevorzugte Methode, weil Terminalanästhesie mit Drogen / Gas-Anästhetika können die Migrationseigenschaften der Neuroblasten und dem gesunden Zustand der Hirnschnittkulturen, die relativ schnell nach Tieropfer abgebildet werden müssen, beeinflussen. </li><li> Hemisect das Gehirn mit einem razoder Klinge (2). Entsorgen Sie nicht injizierten Hemisphäre oder Verwendung für andere Experimente. </li><li> Legen Sie ein kleines Stück Klebeband auf der Vibratom Halter und verwenden Sie die minimal notwendige Menge an Klebstoff, um die Gehirnhälfte oben drauf (Abbildung 2) zu befestigen. Dies verhindert eine Beschädigung der Halteroberfläche aufgrund von wiederholten Klebeanwendungen. </li><li> Lassen Sie den Kleber trocknen für ein paar Sekunden. </li><li> Zeigen Halter in der Vibratom Tablett mit vorgekühlten Dissektion Lösung gefüllt. Weisen den Riechkolben in Richtung der Klinge (2). </li><li> Beginnen Schneiden der Gehirnhälfte mit geeigneten Einstellungen. Die folgenden Parameter werden empfohlen: Schichtdicke 300 um; Geschwindigkeit ~ 3-5; Frequenz ~ 9. Hochfrequenz-und Niedergeschwindigkeits werden empfohlen, um eine Beschädigung der Scheibe zu vermeiden. </li><li> Sammeln Scheiben mit einem kleinen Pinsel oder einem weichen Impföse. Nur halten Scheiben mit sichtbaren OB (in der Regel 2-3 Scheiben / Gehirn). Typischerweise wird die Scheibe enthält die meisten der RMS can bei ~ 300 &amp;mgr; m von der Bodenfläche festgestellt werden. </li><li> Überprüfen Scheiben unter einem Fluoreszenzmikroskop Standard für GFP-Signal (achten Sie darauf, um sie umzudrehen, um die Fluoreszenz auf beiden Seiten überprüfen) und wählen Sie diejenigen, die helle Fluoreszenz entlang des größten Teils der RMS. </li></ol> 2.3. Kultivierung Hirnschnitten <ol><li> In einer Zellkultur Kapuze, schneiden Sie den meisten Schwanz Drittel der Hirnschnitt zu entfernen und mit feinen Pinzette oder gerade eine Mikrodissektion Skalpell keine Kleberspuren. </li><li> Zart absaugen Scheibe mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette (schneiden Sie die Spitze der Pipette, um eine größere Öffnung zu schaffen, wird dies eine Beschädigung der Scheibe) und legen Sie es auf die Mitte eines vorgewärmten Millicell-Einsatz. </li><li> Sicherzustellen, dass die Seite mit der hellsten Fluoreszenzsignal wird in Kontakt mit der Millicell Einsatz (für die Bildgebung mit einem umgekehrten Mikroskop) angeordnet ist. </li><li> Entfernen überschüssiger Lösung Präparation auf der Oberseite des Einsatzes mit einer Pipette. </li><li> Lassen Schnittkulturen zulassen sich in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator für mindestens 1 Stunde vor der Bildgebung. </li></ol> 3. Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration <ol><li> Mindestens zwei Stunden vor der Bildgebung, schalten Sie den Perkin Elmer UltraViewVoX konfokale Spinning-Disk-System, invertiert Nikon Ti-E-Mikroskop, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) gekühlten CCD-Digitalkamera und Heizung (Solent Scientific) mit der konstanten eingestellt Temperatur von 37 ° C. </li><li> Öffnen Sie die Volocity Software Anschaffungs Modul, und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Viz&quot; und wählen Sie den Laser (s) für die Bildgebung. </li><li> Innerhalb von 2 h von Hirnschnittpräparat, legen Sie das Glasbodenschale mit den Hirnschnitt in der Imaging-Kammer auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Verwenden Sie ein Super-Nikon CFI Plan Fluor ELWD 20X/0.45 Ziel unter der entsprechenden Fluoreszenzlicht zu wählen und sich die Fläche der Scheibe, der abgebildet werden soll (z. B. der ersten absteigenden Teil des RMS kurz nach der Injektionsstelle, oder die elbow Bereich der RMS, oder einfach nur nach dem Ellenbogen vor Neuroblasten geben Sie die OB). </li><li> Richten Sie die Zeitraffer-Bildgebung mit den folgenden Aktionen: <ol><li> Auf dem Mikroskop, klicken Sie auf die Schaltfläche, um L100 Laser-Abtastung der Probe zu ermöglichen. </li><li> In Volocity, öffnen Sie das Ultraview Laser Changer von der Auswahl des geeigneten Laser (z. B. 488 nm Laser für GFP). </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit (in der Regel zwischen 100-500 ms) und die Laserintensität (in der Regel 20-30%) in Abhängigkeit von der Intensität des Fluoreszenzsignals. </li><li> Passen Sie die Bild digitale Verstärkung zu Zelle Visualisierung zu verbessern. </li><li> Wählen Sie die Z-Stapel-Intervall auf Bild im Hirnschnitt (in der Regel über ein Intervall um 100-120). Wähle ein Intervall mit einer geeigneten Anzahl von isolierten Zellen möglich zu vermeiden, überlagert, so viel wie möglich (dies die nachfolgenden Tracking-Analyse zu erleichtern). </li><li> Wählen Sie den Abstand zwischen den einzelnen Bild Z-Stapel (in der Regel 2-4 um). </li><li> Wählen Sie die Zeit interval zwischen jeder z-Stapelerfassung (z. B. 3 Minuten), und die Gesamtbilderzeugungszeitdauer (z. B. 3 Stunden). </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Speichern&quot;-Symbol, um die Änderungen der Bildparameter zu speichern. </li><li> Drücken Sie die Aufnahme-Taste, um Bild starten. </li></ol></li><li> Alternative Abbildung der Kontroll-und experimentellen Proben (z. B. Fahrzeug / Arzneimittelbehandlung oder verschiedenen Plasmiden durch Elektroporation) während des gleichen Tages. </li></ol> 4. Analyse Neuroblast Migration <ol><li> In der Volocity Quantifizierung Modul, öffnen Sie die gewünschte Bibliothek nach Abschluss einer Zeitraffer-Experiment erstellt. Wählen Sie &quot;Erweiterte Tiefenschärfe&quot; von der linken oberen Feld (Abbildung 4A, Schritt 1). </li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;Messungen&quot;, um das Messfenster angezeigt (Abbildung 4A, Schritt 2). </li><li> Eine Liste der Aufgaben ist in der unteren linken Ecke des Bildschirms sichtbar. Ziehen Sie &quot;Track&quot; (unter dem &quot;Verschiedenes&quot; vorhanden Überschrift am unteren Rand desdie Liste) auf dem Raum über. Dies wird die Eröffnung eines neuen Fenster namens &quot;Track&quot; in der oberen linken Bereich des Bildschirms (Abbildung 4A, Schritt 3) aufgefordert. </li><li> Wählen Sie &quot;Punkte&quot; von der &quot;Input&quot;-Reiter in der Track-Fenster (Abbildung 4A, Schritt 4). </li><li> Klicken Sie auf das Point Tool (Abbildung 4A, Schritt 5). </li><li> Starten Sie die Verfolgung der Migration Neuroblast, indem Sie mit der Maus auf den zentralen Bereich der Zellkörper und halten die Verfolgung der Zellbewegung bis zum letzten Zeitpunkt der Zeitraffer-erreicht wird (zum Beispiel Punktzahl 61 für eine 3 Stunden lange Film) . </li><li> Um Daten zu erhalten, wählen Sie &quot;Make Mess Item&quot; aus dem Menü Messungen (4B, Schritte 6-7). Ein Fenster in der Mitte des Bildschirms angezeigt. </li><li> In diesem Fenster wählen Sie &quot;Ein neues Messpunkt genannt:&quot; und geben Sie einen Namen ein (4C, Schritt 8). Denken Sie daran, die Option &quot;Alle Zeitpunkten&quot; vor pr wählenEssing OK (4C, Schritt 9). Ein Messpunkt Datei wird unter der Zeitraffer-Datei angezeigt und Parameter zur quantitativen Analyse (zB Migrations-Distanz, Geschwindigkeit, Weg und Verschiebungsrate) enthalten. </li><li> Doppelklicken Sie auf die Messpunkt Datei, um sie wie ein Fenster (4D, Schritt 10) zu öffnen. </li><li> Um die einzelnen Tracks der analysierten Zellen sichtbar zu machen, wählen Sie &quot;Raupen Point&quot; von den &quot;Display&quot;-Optionen (4D, Schritt 11). </li><li> Rechtsklick auf die Mess Artikel-Datei und exportieren es als Text-Datei, die dann in Programmen wie Excel, um die Migration zu analysieren Parameter importiert werden kann. </li><li> Um Bewegungen zwischen aufeinanderfolgenden Frames und Pausen von jeder Zelle während der Dreharbeiten Frist, in der Mess-Artikel-Datei aus den &quot;Display&quot; Optionen &quot;Punkt&quot; oder &quot;Populationen&quot;, und klicken Sie auf ID (jeder Track hat eine eindeutige ID) zu messen. Exportieren Sie die resultierende Datei durch gehenten, wie in Schritt 4.10 erläutert. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Effiziente Migration von neuralen Vorläuferzellen entlang der RMS sorgt für deren anschließende Reifung in funktionelle Neuronen 10. Prominent Streams von neuralen Vorläuferzellen in Richtung des OB gerichtet sind, sind in der menschlichen Kindheit sichtbar und werden wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der frühen postnatalen Entwicklung des menschlichen Gehirns 27 zu spielen. Darüber hinaus sind diese Zellen in der Lage, Websites des Gehirns durch Verletzungen und Neurodegeneration betroffen <su...

Im Säugerhirn, die Erzeugung von neuen Neuronen (Neurogenese) erfolgt nach der Geburt vor allem in zwei Regionen, die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und der Subgranularzone im Gyrus dentatus des Hippocampus 1. Deutliche Beweise in den letzten Jahren gesammelt unterstützt eine entscheidende Rolle für die postnatalen Neurogenese im Hippocampus und Riechkolben Speicherfunktionen 1-3. Wichtig ist, daß die postnatale Neurogenese auch therapeutisches Potential aufgrund der Beziehung mit degenerativen neurologischen Störungen, und die Fähigkeit von Neuroblasten an verletzten Stellen im Gehirn 4-6 migrieren. Die Subventrikularzone (SVZ) hat vor kurzem als ein entscheidender neurogenen Nische. SVZ abgeleiteten Neuroblasten wandern zur Riechkolben (OB) über dem rostralen Migrationsstrom (Effektivwert), so dass dies die längste Migration in der postnatalen Gehirn 1,7,8. Die Säugetier SVZ / RMS / OB-System hat sich zu einemnützliches Modell, um verschiedene Schritte der Neurogenese, wie Proliferation, Migration und Differenzierung 1,8 studieren. Viele Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Signale regulieren SVZ Neurogenese und Migration entlang der RMS, aber die intrazellulären molekularen Mechanismen sind bei weitem nicht vollständig verstanden 1,9. Proper Migration entlang der RMS ist entscheidend für die spätere Reifung neugeborener Neuronen 10. Darüber hinaus haben einige Studien gezeigt, dass SVZ-derived Neuroblasten kann der RMS-Hirn-Verletzungen Websites 4-6,11-13 migrieren. So untersucht die Signalmechanismen Regelneuroblast Migration ist von grundlegender Bedeutung nicht nur für die Neurogenese zu verstehen, sondern auch für mögliche therapeutische Anwendungen. Hier ein ausführliches Protokoll zu SVZ neuralen Vorläuferzellen durch in vivo Elektroporation postnatale beschriften und Überwachung ihrer Wanderung entlang der RMS in akuten Hirnschnittkulturen mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie drehenden Scheibe beschreiben wirpy. Elektroporation ist weit verbreitet in Entwicklungsstudien aus embryonalen zu adulten Stadien 14-18 verwendet. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um gezielt manipulieren SVZ neuralen Vorläuferzellen und ist ein kostengünstiger und wesentlich schnellere Alternative zu stereotaktische Injektion von viralen Vektoren oder Erzeugung transgener Modelle 1,15,19,20. Es ist ein relativ einfaches Verfahren, das nicht braucht, Chirurgie und hat eine hohe Überlebensraten. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Maus-Modellen Verwendung der genetischen LoxP System kann verwendet werden, um gezielt Gene von Interesse oder dauerhafte Kennzeichnung von SVZ Vorläuferzellen zu erreichen, stellt somit ein nützliches Werkzeug für die adulte Neurogenese Studien 21,22 werden. RMS Imaging Neuroblast Migration im intakten Gehirn ist immer noch eine Herausforderung aufgrund der aktuellen technischen Einschränkungen. Allerdings kann dieser Prozess mit Hilfe der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie von akuten Hirnschnitten, die eine geeignete syst bieten überwacht werdenem sehr ähnlich der in vivo-Zustand, der auch offen für pharmakologische Manipulation 23,24. Kopplung in vivo Elektroporation mit postnatalen Zeitraffer-Imaging wird das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Beweglichkeit erleichtern und dazu beitragen, die Entwicklung von neuartigen Ansätzen zur Heilung des Gehirns zu fördern.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Kulturschale mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gey's Balanced media</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glukose, 45%</td><td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Stift/ Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (phenolrotfrei)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren für Injektion</td><td>Harvard Apparat</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratorschlauch</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 Kapillarabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Rechteckwellen-Elektroporator</td><td>Harvard Apparat</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Platinpinzette 7 mm</td><td>Harvard Apparat</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Fußschalter Modell 1250F</td><td>Harvard Gerät</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Gel für Elektroden</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Kleber</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>UltraViEW VoX Spinning Disk System</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Kundenspezifisches Setup (mehrere Laserquellen können verwendet werden) ausgestattet mit Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD-Kamera</td></tr><tr><td>Volocity-Software</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Erfassungs-, Quantifizierungs- und Visualisierungsmodule</td></tr><tr><td>Klimakammer für die Mikroskopie</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td>Maßgeschneidertes</td></tr><tr><td>ti-E inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Für die in diesem Dokument beschriebene Anwendung wird das CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0,45 NA Objektiv empfohlen</td></tr></tbody></table>

in-vivo-elektroporation und postnatale zeitraffer-imaging neuroblast von migration in maus akute hirnschnitten

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Die Subventrikularzone (SVZ) ist einer der wichtigsten neurogenen Nischen in der postnatalen Gehirn. Hier neuralen Vorläuferzellen vermehren sich und führen zu Neuroblasten in der Lage, entlang des rostralen Migrationsstrom (RMS) zum Bulbus olfactorius (OB) zu bewegen. Diese Fern Migration für die anschließende Reifung neugeborener Neuronen im OB benötigt, aber die molekulare Mechanismen, die diesen Prozess sind noch unklar. Untersuchung der Signalwege steuern Neuroblast Motilität kann nicht nur helfen, zu verstehen, einen entscheidenden Schritt in der Neurogenese, sondern auch therapeutische regenerative Potenzial, da die Fähigkeit der Neuroblasten zu Hirn Websites durch Verletzung, Schlaganfall oder Degeneration betroffen Ziel. In dieser Handschrift beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für in vivo-Elektroporation und anschließender postnatale Zeitraffer-Bildgebung Neuroblast von Migration in den Maus RMS. Postnatale Elektroporation kann SVZ Vorläufer effizient transfizierenZellen, die wiederum erzeugen Neuroblasten Migration entlang der RMS. Mit der konfokalen Spinning-Disk-Zeitraffer-Mikroskopie an akuten Hirnschnittkulturen, können Neuroblast Migration in einer Umgebung, sehr ähnlich der in vivo-Zustand überwacht werden. Außerdem kann Neuroblasten Motilität verfolgt und quantitativ analysiert werden. Als Beispiel beschreiben wir, wie man in vivo Elektroporation postnatale einer GFP-exprimierenden Plasmid verwenden, um zu kennzeichnen und zu visualisieren Neuroblasten Migration entlang der RMS. Elektroporation von shRNA oder CRE-Rekombinase-exprimierenden Plasmiden in Knockout-Mäusen unter Verwendung der loxP-System kann auch verwendet werden, um Gene von Interesse abzuzielen. Pharmakologische Manipulation von akuten Hirnschnittkulturen durchgeführt werden, um die Rolle der verschiedenen Signalmoleküle in Neuroblasten Migration zu untersuchen. Durch die Kopplung von In-vivo-Elektroporation mit Zeitraffer-Bildgebung, hoffen wir, die molekularen Mechanismen, die die Neuroblast Motilität verstehen und dazu beitragen, die Entwicklunglung neuer Ansätze zur Heilung des Gehirns zu fördern.

Kennzeichnung von SVZ-abgeleiteten Migrationsneuroblasten entlang der RMS beobachtet werden, in der Regel 4-8 Tage nach einer erfolgreichen Elektroporation (Abbildung 1B). Längere Zeitpunkte können auch gewählt werden, weniger Zellen werden in den RMS gefunden werden, da die meisten von ihnen die OB eingegeben. Neuroblasten starten Erwerb typische Morphologie und Eigenschaften von reifen Körnerzellen im OB etwa 2-3 Wochen nach der Elektroporation (nicht gezeigt). Nach Kultivierung für ~ 1 Stunde, kann H...

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Migration von Neuroblasten entlang des rostralen Migrationsstroms im postnatalen Mausgehirn sichtbar zu machen und zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein elektroporiertes, ein DNA-Plasmid ENC-beschichtetes grün fluoreszierendes Protein in der Seitenkammer der Maus poppt. Der zweite Schritt besteht darin, Gehirnschnitte von den elektroporierten Mäusen vorzubereiten.Als nächstes werden die Schichten mit dem besten GFP-Signal für die Kultivierung ausgewählt. Der letzte Schritt ist die Zeitrafferbildgebung der Hirnschnitte, die den GFP-markierten wandernden Neuroblasten enthalten, mit einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop. Letztendlich werden die Zeitrafferfilme für die Zellverfolgung und die quantitative Analyse der Neuroblastenmigration verwendet.Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurogenese zu beantworten, z. B. wie die Bewegung von Stammzellen abgeleiteten Neuroblasten im postnatalen Gehirn gesteuert und reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verabreichung viraler Vektoren besteht darin, dass sie einfacher, billiger und weniger zeitaufwändig ist. Darüber hinaus ermöglicht es eine spärliche Markierung von Neuroblasten, was eine detaillierte Analyse ihrer Migrationsdynamik ermöglicht.Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Spannung des Elektroporators auf fünf Quadratimpulse einstellen, 50 Millisekunden pro Impuls bei 100 Volt mit 850 Millisekunden-Intervallen. Laden Sie dann eine Kapillarnadel mit ein bis zwei Mikrolitern DNA mit einem Aspiratorschlauch, der mit der Kapillare verbunden ist. Nehmen Sie als Nächstes ein postnatales Mausjunges am zweiten Tag aus dem Käfig und betäuben Sie es durch Fluorinhalation.Halten Sie danach den Kopf des Welpen zwischen Daumen und Zeigefinger Ihrer weniger dominanten Hand. Ziehen Sie die Haut am Kopf leicht zurück, um die Identifizierung des richtigen Injektionspunkts zu erleichtern. Stellen Sie sich eine virtuelle Linie zwischen dem Auge und dem kraniometrischen Orientierungspunkt Lambda vor.Führen Sie dann die Kapillarnadel in etwa einem Drittel der Länge dieser Linie vom Lambda bis zu einer Tiefe von etwa zwei Millimetern ein, injizieren Sie das Plasmid, indem Sie langsam durch den Mund blasen. Achten Sie bei diesem Eingriff darauf, dass Ihre Finger nicht zu viel Druck auf das Gehirn ausüben. Stoppen Sie die Injektion, wenn eine minimale Menge DNA-Lösung in der Kapillare verbleibt.Bestreichen Sie dann beide Elektroden mit Gel und platzieren Sie sie mit der positiven Seite auf der lateralen Seite der Halbkugel, wo die DNA injiziert wurde. Für den DNA-Einbau in die Rostral SVZ platzieren Sie die Elektroden leicht rostral zum Injektionspunkt. Starten Sie anschließend die Stromübertragung, indem Sie das Pedal des Impuls-Fußschalters drücken.Wischen Sie dann das Gel vom Kopf des Welpen ab und reanimieren Sie den Welpen einige Minuten lang mit Sauerstoff auf einem Heizkissen. Setzen Sie es anschließend wieder in den Käfig ein und platzieren Sie es von der Mutter entfernt. Stellen Sie sicher, dass die Mutter den Welpen zurückholt und ihn wieder mit dem Rest des Wurfs zusammenbringt.Bei diesem Verfahren werden Millizellinserts in eine 35 Millimeter große Kulturschale mit Glasboden gegeben, die einen Milliliter Filmmedium enthält. Stellen Sie dann die Kulturschale in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid. Nachdem Sie den Mäusewelpen enthauptet haben, entfernen Sie die Kopfhaut mit einem Skalpell.Schneiden Sie als Nächstes den Schädel entlang der mittleren sagittalen Naht vom Kleinhirn bis zum Riechkolben. Machen Sie einige zusätzliche Querschnitte am Schädel und entfernen Sie die Schädellappen vorsichtig mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gehirn freigelegt ist, und sezieren Sie es vorsichtig mit einem Spatel, wobei Sie besonders darauf achten sollten, das Gewebe nicht zu beschädigen.Danach präparieren Sie das Gehirn mit einer Rasierklinge und verwerfen die nicht injizierte Hemisphäre. Legen Sie anschließend ein kleines Stück Klebeband auf den Vibramhalter. Verwende die minimale Menge an Kleber, die notwendig ist, um die Gehirnhälfte darauf zu befestigen.Beginnen Sie, die Gehirnhälfte in 300-Mikrometer-Scheiben zu schneiden. Sammeln Sie dann die Scheiben mit einem kleinen Pinsel oder einer weichen Impfschlaufe. Überprüfen Sie anschließend beide Seiten der Schichten unter einem Standard-Fluoreszenzmikroskop auf GFP-Signal und wählen Sie diejenigen aus, die entlang des größten Teils des rostralen Migrationsstroms helle Fluoreszenz zeigen.Schneiden Sie in einer Selbstkulturhaube das am meisten verhätschelte Drittel der Gehirnscheibe ab und entfernen Sie alle Klebespuren. Aspirieren Sie anschließend die Scheibe mit einer Kunststoffpipette und platzieren Sie sie in der Mitte eines vorwarmen Millizelleinsatzes. Entfernen Sie überschüssige Dissektionslösung auf dem Einsatz mit einer Gilson-Pipette.Lassen Sie die Scheibenkulturen dann mindestens eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid ruhen. Vor der Bildgebung innerhalb von zwei Stunden nach der Vorbereitung des Hirnschnitts. Stellen Sie die Glasbodenschale mit der Gehirnscheibe in die Bildgebungskammer auf den Mikroskoptisch.Verwenden Sie als Nächstes ein 20 x 0,45-Objektiv unter dem entsprechenden Leuchtstofflicht, um den Bereich des Schichts, der abgebildet werden soll, auszuwählen und zu fokussieren. Um die Zeitraffer-Bildgebung am Mikroskop einzurichten, klicken Sie auf die Schaltfläche L 100, um das Laserscannen der Probe zu ermöglichen. Öffnen Sie anschließend in der Geschwindigkeit den Ultra View-Laserwechsler, indem Sie den entsprechenden Laser auswählen.Stellen Sie die Belichtungszeitverstärkung und die Laserintensität ein. Wählen Sie dann das Zack-Intervall aus, das im Gehirn abgebildet werden soll. Wählen Sie anschließend den Abstand zwischen den einzelnen ZS-Stapelbildern aus.Wählen Sie das Zeitintervall zwischen den einzelnen ZS-Stack-Aufnahmen und der Gesamt-Imaging-Dauer aus. Klicken Sie dann auf das Symbol Speichern, um die Änderungen an den Bildparametern zu speichern. Drücken Sie am Ende die Aufnahmetaste, um die Bildgebung im Velocity-Quantifizierungsmodul zu starten.Öffnen Sie die gewünschte erstellte Bibliothek. Nachdem Sie ein Zeitrafferexperiment abgeschlossen haben, wählen Sie im Feld oben links die Option "Erweiterter Fokus" aus. Klicken Sie auf die Registerkarte Messungen, um das Messfenster anzuzeigen.Eine Liste der Aufgaben wird unten links auf dem Bildschirm angezeigt. Ziehen Sie die Spur auf den Bereich darüber. Daraufhin wird ein neues Fenster mit dem Namen track geöffnet.Wählen Sie im oberen linken Bereich des Bildschirms Punkte aus der Registerkarte "Eingabe" im Spurfenster aus. Klicken Sie auf das Punktwerkzeug, klicken Sie auf die Registerkarte Werkzeuge und wählen Sie die Option Objekte manuell verfolgen. Es öffnet sich ein Fenster, in dem der Bediener mit der Verfolgung der Zellen beginnen kann. Beginnen Sie mit der Verfolgung des wandernden Neuroblasten, indem Sie mit der Maus auf den zentralen Bereich des Zellkörpers klicken und verfolgen Sie die Zellbewegung bis zum letzten Zeitpunkt des Zeitraffers.Um Daten zu erhalten, wählen Sie Messartikel erstellen. Im Menü "Messungen" erscheint ein Fenster in der Mitte des Bildschirms. Wählen Sie in diesem Fenster ein neues Messelement mit dem Namen aus, und geben Sie einen Namen für das Messelement ein.Die Datei mit den Parametern für die quantitative Analyse wird unter der Zeitrafferdatei angezeigt. Doppelklicken Sie auf diese Messelementdatei, um sie als Fenster zu öffnen, in dem Sie die einzelnen Spuren der analysierten Zellen visualisieren können. Wählen Sie in den Anzeigeoptionen den verfolgten Punkt aus und wählen Sie die Zellen aus, die für ihren Migrationspfad visualisiert werden müssen.Um die Migrationsparameter zu analysieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Messelementdatei und exportieren Sie sie als Textdatei, die dann in Programme wie Excel importiert werden kann. Dies sind die Zeitrafferbilder der rotierenden Scheibe eines Neuroblasten, die aus einem sagittalen Hirnschnitt einer Maus aufgenommen wurden. Fünf Tage nach der Elektroporation von A liegen die Plasmidbilder im Abstand von einer Stunde auseinander.Jedes Panel ist eine Zack-Projektion von 28 aufeinanderfolgenden Bildern im Abstand von vier Mikrometern. Die Pfeilspitzen zeigen vier repräsentative Neuroblasten, die entlang des RMS in Richtung des Riechkolbens wandern. Dies sind die repräsentativen Migrationswege, die aus der Zeitraffer-Bildgebung von vier Neuroblasten gewonnen wurden.Dieses Diagramm zeigt die mit der Zeit gewanderte Entfernung von zwei repräsentativen Neuroblasten. Diese Zellen zeigen ein typisches saltatorisches bewegliches Verhalten. Dieser Film zeigt einen Abschnitt des RMS der Maus mit der Bezeichnung GFP migring.Neuroblast, der fünf Tage nach der Elektroporation von A GFP exprimierendes Plasmid erhalten wurde. Der Riechkolben befindet sich außer Sichtweite in der unteren rechten Ecke. Die konfokalen Z-Stapel wurden auf einer konfokalen Spinning-Disc erfasst.Mit einem 20-fach-Objektiv alle drei Minuten für drei Stunden über ein Intervall von 120 Mikrometern beträgt die Spielgeschwindigkeit 10 Bilder pro Sekunde. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Elektroporation vor Beginn der Experimente zu üben und die akuten Hirnschnittkulturen in kürzester Zeit sorgfältig vorzubereiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Neuroblastenmigration im postnatalen Mäusegehirn visualisieren und analysieren können.

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben ein Protokoll für Echtzeit videoimaging neuronaler Migration im Vorderhirn Maus. Die Migration von viral etikettiert oder aufgepfropft wurde neuronalen Vorläuferzellen in akuten Live Scheiben unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung mit einer relativ schnellen Erfassungsintervall, um die unterschiedlichen Phasen der Zellmigration, einschließlich der Dauer der stationären und Migration Phasen und der Geschwindigkeit aufgezeichnet studieren Migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

Quelle: Wiegreffe, C., et. al.,  Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen in der organotypischen Schnittkultur des embryonalen Mausgehirns unter Verwendung von In utero{ Elektroporation. {{}}J. Vis. Exp.{{TAG_ 44}} (2017) Dieses Video zeigt die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die radiale Migration kortikaler Neuronen von der subventrikulären Zone zur kortikalen Platte über radiale Gliagerüste in transduzierten embryonalen Hirnschnitten der Maus zu beobachten.

Zeitraffer-Bildgebung der radialen Migration kortikaler Neuronen in transduzierten embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Neuroblast Migration ist ein entscheidender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration durch den Einsatz von DNA / kleine Haarnadel-RNA (shRNA) Nukleofektion und eine 3D-Migrationsassay mit Neuroblasten aus dem Nagetier postnatale rostralen Migrationsstrom getrennt zu untersuchen.

Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em&gt; In-vitro-</em

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

Lernen Sie die In-vivo-Elektroporation und Zeitraffer-Imaging zur Analyse der Neuroblastenmigration in akuten Hirnschnitten der Maus. Diese Methode ermöglicht die quantitative Untersuchung zellulärer Dynamiken in der postnatalen Neurogenese.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

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