Picoinjection von Mikrofluidik-Tropfen ohne Metall-Elektroden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mikrofluidische Chips zu entwerfen, herzustellen und zu nutzen, die in der Lage sind, Reagenzien präzise und kontrolliert in Wasser-in-Öl-Tropfen einzuspritzen, ein Prozess, der als Piko-Injektion bekannt ist. Dies wird zunächst erreicht, indem ein Gerät mit einem Emulsionskanal entworfen wird, der sich auf einen Durchmesser verengt, der kleiner ist als der der kugelförmigen Tropfen, und diese gleichmäßig innerhalb eines inerten Trägeröls anordnet. Als zweiter Schritt werden die Wasser- und Öltropfen in das Gerät eingeführt und strömen zur Injektionsstelle.

Ein senkrechter Kanal, der die zu injizierenden Reagenzien enthält. Anschließend wird eine hohe Spannung auf die Injektionsflüssigkeit angewendet, während die Tropfen die Injektionsstelle passieren, um die Vermischung der Tropfen mit der Injektionsflüssigkeit zu bewirken. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Einstellung der angelegten Spannung das Volumen des injizierten Reagenz präzise im Pikoliter-Bereich gesteuert werden kann. Diese Technik entstand aus der Notwendigkeit heraus, die Herstellung unserer Vorrichtungen zu vereinfachen, indem der Bedarf an Metallelektroden entfällt.

Die Vorteile gegenüber bestehenden Techniken liegen in der Leichtigkeit und Einfachheit des Gerätedesigns, der Herstellung und der Anwendung. Die in früheren Methoden verwendeten Metallelektroden neigten dazu, zu brechen und waren empfindlich gegenüber Staub und Rückständen in den Kanälen während der Herstellung. Durch die Eliminierung der Elektroden haben wir unsere Geräte robuster gemacht und die Effizienz unserer Herstellung verbessert. Der erste Schritt besteht darin, einen mikrofluidischen Chip basierend auf den Anforderungen des Experiments zu entwerfen.

Verwenden Sie eine computergestützte Konstruktionssoftware, um später photolithografische Techniken anwenden zu können. Dieses Chip-Design weist Emulsionskanäle auf, die kleiner sind als die sphärischen Tröpfchen, die verwendet werden sollen, um eine effektivere Piko-Injektion zu ermöglichen. Die Piko-Injektionsstelle basiert auf einem aus der Literatur bekannten Design, bei dem die Metallelektroden entfernt wurden.

Zusätzliche Kanäle wirken als Faraday-Graben, um stromaufwärts gelegene Tropfen vor dem elektrischen Feld abzuschirmen. Sobald die Konstruktion abgeschlossen ist, fertigen Sie die Vorrichtungen mittels weicher Fotolithographietechniken an und verbinden Sie diese mit einem Glasobjektträger, sodass die Vorrichtung betriebsbereit ist. Bereiten Sie eine Druckluftregelpumpe vor, um ein Reservoir mit Fluid unter Druck zu setzen.

Ändern Sie dazu die Pumpenleistung, sodass die Druckluft durch ein Stück Polyethylen-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 2,7 Millimetern austritt. Schließen Sie den Schlauch ab, indem Sie ihn über die Hülse an der Rückseite einer Spritzenkanüle stecken. Befestigen Sie nach Abdichtung des Raums zwischen Spritze und Schlauch mit Epoxidharz eine Nadel der Größe 27,5 unter Verwendung von für das Experiment geeigneten Reagenzien.

Stellen Sie eine homogene Emulsion aus wässrigen Tröpfchen, die in Trägeröl suspendiert sind, her. Füllen Sie die Emulsion in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27,5-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Befestigen Sie die Spritze anschließend in einer Spritzenpumpe und richten Sie sie mit der Nadel nach oben aus.

Der nächste Schritt besteht darin, Reagenzien für die Einführung in die mikrofluidische Vorrichtung und deren Reservoire vorzubereiten. Beginnen Sie mit einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und dessen Verschluss. Verwenden Sie eine Biopsielösepunze oder ein anderes geeignetes Werkzeug, um drei 0,5-Millimeter-Lochungen in den Verschluss zu stanzen.

Bereiten Sie eine Drahtelektrode mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern und einer Länge vor, die einige Zentimeter länger ist als das Zentrifugenröhrchen. Führen Sie diese Elektrode in eines der Löcher im Verschluss ein. Stellen Sie sicher, dass sie den Boden des Röhrchens erreicht und einige Zentimeter über die Oberseite hinausragt.

Bereiten Sie anschließend ein etwa 20 Zentimeter langes Stück Polyethylen-Schlauch vor. Führen Sie dieses in ein zweites Loch ein. Auch hier sollte es den Boden des Rohrs im verbleibenden Loch erreichen.

Führen Sie etwa 2,5 Zentimeter Polyethylen-Schlauch ein. Dieser Schlauch verbleibt oberhalb des Flüssigkeitsstands. Tragen Sie UV-härtenden Epoxidkleber auf, um Lücken auf der Oberseite des Verschlusses abzudichten.

Wenn die Aushärtung abgeschlossen ist, füllen Sie das Rohr mit der gewünschten Pico-Injektionsflüssigkeit, 100 Millimolar Natriumchlorid, und schrauben Sie die Kappe fest. Verbinden Sie den Ausgang der Druckluftpumpe mit dem kürzeren Schlauchstück in der Kappe. Durch Einführen der Nadel in das Lumen sollte die Nadel fest sitzen.

Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen in seinen Halter. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einmolarer Natriumchloridlösung. Verbinden Sie eine 27,5-Gauge-Nadel, um sie als Faradaygriffelflüssigkeit zu verwenden, und befestigen Sie die Spritze an einer Spritzenpumpe.

Füllen Sie eine weitere Ein-Milliliter-Spritze mit Trägerabstandsöl. Befestigen Sie eine Nadel mit 27,5 Gauge und sichern Sie sie in einer Spritzenpumpe. An diesem Punkt können Verbindungen zum mikrofluidischen Chip hergestellt werden.

Zunächst sicherstellen, dass der Chip auf einer flachen Oberfläche befestigt ist. Danach das offene Ende des langen Schlauchs vom Injektionsflüssigkeitsbehälter zum Chip führen. Diesen Schlauch mit dem Einlassanschluss der Pico-Injektionsflüssigkeit auf dem mikrofluidischen Chip verbinden.

Danach Polyethylenschlauch an die Spritze mit Natriumchlorid anschließen und bis zum Chip verlegen. An den Einlassstutzen für den Faraday-Moat anschließen. Außerdem Schlauch verwenden, um die Spritze mit Trägeröl mit dessen Einlassstutzen am Gerät zu verbinden.

Leiten Sie ein Rohr, das vom Emulsionsauslass stammt, in ein Sammelgefäß. Verbinden Sie abschließend den Auslass der Faraday-Grube mithilfe eines Schlauchs mit einem nichtleitenden, elektrisch isolierten Behälter. Am Ende sieht der mikrofluidische Chip folgendermaßen aus.

Nehmen Sie nun einen Draht von der Masse eines Hochspannungsverstärkers und führen Sie ihn zur Nadel der Spritze mit Natriumchlorid. Befestigen Sie den Draht mithilfe einer Krokodilklemme an der Nadel. Führen Sie einen weiteren Draht vom Hochspannungs-Ausgang des Verstärkers zur Elektrode, die in der Pico-Injektionsflüssigkeit eingetaucht ist.

Verwenden Sie eine Krokodilklemme, um die Verbindung als Eingang für den Verstärker herzustellen. Nutzen Sie den Computer-Ausgang eines softwaregesteuerten Funktionsgenerators. Beginnen Sie die Infusion des Systems, indem Sie die einmolare Natriumchlorid-Faraday-Motoren-Flüssigkeit mit 100 Mikrolitern pro Stunde in das Gerät einleiten.

Danach starten Sie die Tropfen-, Emulsions- und Trägerölzufuhr, sodass die Tropfen in regelmäßigen Abständen, durch eine Lücke mit Trägeröl getrennt, die Piko-Injektionseinheit passieren. Stellen Sie den Druck des Piko-Injektionsfluids so ein, dass das Fluid an der Piko-Injektionsöffnung in den Tropfenkanal hineinwölbt, sich jedoch nicht ablöst, um eigene Tropfen zu bilden. Nutzen Sie den Wellengenerator, um ein 10-Kilohertz-Wechselstromsignal mit einer Amplitude von null bis 10 Volt zu erzeugen, das anschließend von dem Hochspannungsverstärker tausendfach verstärkt wird.

Um die Pikoinjektion durchzuführen, wird dieses Signal auf die Tropfen angewendet, während sie die Injektionsöffnung passieren, wobei die Amplitude als Parameter genutzt wird. Dieser Film zeigt die selektive Injektion von Tropfen in Abhängigkeit vom Vorhandensein eines fluoreszierenden Farbstoffs.

In diesem Fall passierten 200 Tropfen pro Sekunde den Injektor, aber Raten von bis zu 10.000 pro Sekunde sind bei geeigneter Tröpfchenerkennung möglich. Diese Diagramme zeigen den injizierten Volumenanteil in Abhängigkeit von der angelegten Spannung für Injektionsflüssigkeiten unterschiedlicher Molarität. Es wird angenommen, dass höhere Spannungen ein früheres Einsetzen der Koaleszenz verursachen, was zu längeren Injektionsdauern und größeren Volumina führt.

Diese zweidimensionale Wärmekarte zeigt die Beziehung zwischen der Molarität der ionischen Lösung und der Spannung, die erforderlich ist, um Injektionsvolumina zu erreichen. Lösungen mit niedrigerer Molarität erfordern höhere Spannungen, da sie das elektrische Feld an der Injektionsstelle leichter reduzieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mikrofluidische Vorrichtungen schnell und robust entwirft und herstellt, die eine präzise und kontrollierbare Injektion von Reagenzien in Ihre Tropfen ermöglichen.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Hochspannung äußerst gefährlich sein kann; Vorsichtsmaßnahmen wie ordnungsgemäße Erdung, persönliche Schutzausrüstung und eingebaute Sicherheitssysteme sollten stets angewendet werden.