Name: Picoinjection von Mikrofluidik-Tropfen ohne Metall-Elektroden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie eine neue Methode zur Picoinjektion in Mikrofluidik-Tropfen ohne Metall-Elektroden. Diese Technik ermöglicht präzise Reagenzienkontrolle bei picolitern Auflösung und vereinfacht die Geräteherstellung erheblich.

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Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Bioengineering und Therapiewissenschaften an der UCSF, dem California Institute for Quantitative Biosciences (QB3) unterstützt wird, und das Bridging the Gap Award von der Rogers-Familienstiftung.

1. Aufbau Geräte Maße und Topologien Basierend auf experimentellen Anforderungen Computer Aided Design (CAD) Software Hinweis: Wählen Emulsion Kanaldurchmesser kleiner als die der kugelförmigen Tropfen. Dies zwingt die Tröpfchen in eine zylindrische oder &quot;Wurst&quot;-Form und eine effektivere picoinjection. Für unsere Zwecke, haben wir 30 x 30 um Kanäle für Tröpfchen, 50 um im Durchmesser waren. <ol><li> Modell picoinjection Stelle (n), nachdem die von Abate et al. 3 mit der Ausnahme, daß die Kanäle für den Metallelektroden entfernt werden, da sie unnötig sind beschrieben. </li><li> Kanäle hinzufügen, die als Faraday Moat (Abbildung 1), die zwischen picoinjection Website (s) und der stromaufwärts gelegenen Emulsion, so dass sie die Tropfen aus dem elektrischen Feld abschirmen laufen zu dienen. Hinweis: Dieser verhindert ein unbeabsichtigtes Zusammenführung. </li></ol> 2. Fabrizieren Geräte mit Soft-Photolithographieographic Techniken <ol><li> Generieren Sie eine Transparenz Photolithographiemaske auf der Basis der CAD-Datei mit bestehenden kommerziellen Dienstleistungen. </li><li> Mit der Photomaske, heilen Photolack auf Silizium-Wafern, ein Gerät Master zu erzeugen, wie zuvor 4 beschrieben. </li><li> Gießen PDMS gemischt mit Härter (11.01-Verhältnis) über das Gerät Master in einem 5 cm Petrischale aus Polystyrol enthalten. </li><li> Setzen Sie den Master mit PDMS im Vakuumtrockenschrank für etwa 15 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Cure die PDMS-Gerät, indem Sie es in einer 95 ° C-Ofen für 1 Stunde. Alternativ werden die PDMS bei RT nach 24 Stunden aushärten. </li><li> Entfernen Sie das Gerät, indem um den Umfang mit einem chirurgischen Messer und sorgfältig schälen Sie das Gerät vom Master. </li><li> Punch-und Austrittslöcher in die PDMS mit einem 0,5 mm-Biopsie Punch. </li><li> Bond das Gerät auf einen Glasobjektträger mit Hilfe eines Plasma-Bonder-4. </li></ol> 3. Bereiten Sie ein LuftdruckSteuerpumpe, ein Reservoir, das die Flüssigkeit unter Druck setzen <ol><li> Ändern der Pumpleistung, so dass die Druckluft tritt über eine Länge von 2,7 mm Innendurchmesser Polyethylenschlauch. </li><li> Konstruieren, so dass der Schlauch endet an einem Luer-Lock-Spritzenspitze durch Einsetzen in das Lumen über den Nippel auf der Rückseite des Luer-Lock. </li><li> Abzudichten, indem der Raum zwischen den Luer-Lock-Gewinde und die Rohrleitung mit Epoxidharz. </li><li> Bringen Sie ein 27,5 G-Nadel. </li></ol> 4. Bereiten Sie eine monodisperse Emulsion von wässrigen (Wasser-in-Öl) Tröpfchen in einem inerten Fluorträgeröl mit 2% (w / w) Abgehängte Gelöste Biokompatible Surfactant 7 Die spezifischen Reagenzien in diesen Tröpfchen enthalten sind abhängig von der Anwendung <ol><li> In der Vorbereitung für die Wiedereinleitung, laden Sie die Emulsion in einer 1 ml-Spritze mit einer 27,5 G-Nadel. </li><li> Befestigen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und richten Sie die Pumpe vertikal (Nadel nach oben). Anmerkung: Diese Orientierung führt die Tröpfchen in einer Schicht über dem Trägeröl zu packen. Wenn die Pumpe gestartet wird, die Tröpfchen aus der Spritze bei hohen Volumenanteil von der Ölschicht unter ihnen gedrückt werden. </li></ol> 5. Bereiten Reagenzien für die Einführung in die Mikrofluidik-Chip <ol><li> Lochen Sie drei 0,5-mm-Löcher in die Kappe einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen (alle Behälter mit einem Schraubdeckel genügt) mit einer Biopsie-Punch-, Nadel-oder Bohrmaschine. </li><li> Legen Sie eine 0,5 mm Drahtelektrode und eine ~ 20 cm langen PE-Schlauch 2 durch zwei der Löcher, so daß sie den Boden des Rohrs zu erreichen. </li><li> In der verbleibende Loch, Gewinde Ø 2,5 cm von einer ~ 20 cm Länge der PE-Schlauch, so dass es oberhalb des Flüssigkeitsspiegels liegen. </li><li> Verschließen Sie alle Lücken auf der Oberseite der Kappe mit UV-gehärteten Epoxid. </li><li> Das Rohr wird mit der Flüssigkeit und picoinjection Schraube auf der Kappe. </li><li> Den Ausgang von dem Luftdruck-Regelpumpe zu dem kürzeren Schlauch durch Einsatzten der Nadel in das Lumen. Die Nadel sollte eng anliegen. </li><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 1 M NaCl als Faraday Moat zu dienen. </li><li> Schließen Sie ein 27,5 G-Nadel und sichern Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe. </li><li> Füllen Sie ein weiteres 1-ml-Spritze mit Träger / Spacer Öl, schließen Sie ein 27,5 G-Nadel, und sichern Sie sie in eine Spritzenpumpe. </li></ol> 6. Bereiten Sie die Mikrofluidik-Vorrichtung zur Picoinjection <ol><li> Verbinden der Ausgangsleitungen (Länge länger) von der Injektionsmittelbehälter mit der Einlaßöffnung des picoinjection Flüssigkeit auf der Mikrofluid-Chip. </li><li> Die Spritze, die das 1 M NaCl zu der Einlassöffnung für den Faraday Graben auf dem mikrofluidischen Chip mit einer Länge von PE-Schlauch. </li><li> Die Spritze, die das Trägeröl zu dem Einlassanschluss des mikrofluidischen Chips mit einer Länge von PE-Schlauch. </li><li> Legen PE-Schlauch in die Emulsion Austrittsöffnung auf dem Mikrofluidik-Chip. Der Schlauch sollte in einer Emulsion Sammelgefäß zu beenden, nochnormalerweise ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Legen PE-Schlauch in die Auslassöffnung für den Faraday Graben auf dem mikrofluidischen Chip. Der Schlauch sollte in einer nicht-leitenden und elektrisch isolierten Behälter, um einen Kurzschluss zu verhindern beenden. </li><li> Den Ausgang der Hochspannungs-(HV)-Verstärker über Krokodilklemme mit der Metallelektrode in die Flüssigkeit eingetaucht picoinjection. </li><li> Verbinden der Masseelektrode der Hochspannungsverstärker über Krokodilklemme mit dem Metall der Spritzennadel, die das 1 M NaCl. </li></ol> 7. Infuse Reagenzien in Mikrofluidik-Chip <ol><li> Führen Sie die 1 M NaCl (Faraday Moat) an das Gerät mit einer Geschwindigkeit von 100 ul / hr. </li><li> Führen Sie die Tröpfchen Emulsion und Trägeröl bei Raten für den Geräteabmessungen. Für unsere Demo-Gerät, führen wir die Tropfen und Öl bei 200 und 400 ul / h auf. Die Flussraten ermöglichen sollten die Tröpfchen, die in regelmäßigen Abständen picoinjector getrennt gebendurch einen Spalt von Trägeröl. </li><li> Den Druck auf die Flüssigkeit picoinjection so dass der Fluiddruck an der Öffnung picoinjection in mechanischem Gleichgewicht mit der Tröpfchen Kanal angewendet. Hinweis: Bei diesem Druck (der Laplace-Druck), ist die Injektion von Fluid in den Kanal ohne Tröpfchen Knospung aus und bildet einen eigenen Tropfen (Abbildung 2) zu wölben. Bei diesen oben beschriebenen Strömungsgeschwindigkeiten, einen Druck von ca. 13 psi wenden wir auf die Injektionsflüssigkeit bis zum Gleichgewicht an der Injektionsstelle zu erreichen. </li></ol> 8. Beginnen Picoinjection <ol><li> Wie Tröpfchen passieren die Einspritzöffnung, gelten ein 0-10 V, 10 kHz, AC-Signal verstärkt 1.000 x von der HV-Verstärker (Abbildung 3). </li><li> Modulation der Einspritzmenge durch Änderung der Amplitude der angelegten Spannung. Hinweis: Höhere Spannungen sollten mehr auf die Tröpfchen Flüssigkeit eingebracht werden können. Bei unseren Tests beobachten wir stabile und konsistente Injektion bei Spannungen seinzwischen 100 und 3.000 V mit Injektionslösungen von NaCl im Bereich von 10 bis 500 mm (Abbildung 4). </li></ol>

<ol><li>Kritikou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+cheaper+in+the+Picolab%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">It's cheaper in the Picolab.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).</li>
<li>Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocoalescence+of+drops+synchronized+by+size-dependent+flow+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).</li>
<li>Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+injection+with+microfluidics+using+picoinjectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+device+for+the+compartmentalization+of+neuron+soma+and+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons.</a> J. Vis. Exp. (7), (2007).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).</li>
<li>O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode-free+picoinjection+of+microfluidic+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrode-free picoinjection of microfluidic drops.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).</li>
<li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li>
<li>Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+dynamics+passing+through+obstructions+in+confined+microchannel+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow.</a> Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).</li>
<li>Herminghaus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+instability+of+thin+liquid+films+between+conducting+media%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamical instability of thin liquid films between conducting media.</a> Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).</li>
<li>Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+electrocoalescence+in+microfluidics%3A+Targeting+a+single+lamella%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella.</a> Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).</li>
<li>Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrowetting-controlled+droplet+generation+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condens.+Matter%22%5BJournal%5D)">Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device.</a> J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
</ol>

Wir nicht vollständig verstehen genaue physikalische Mechanismus hinter der Beziehung zwischen der angelegten Spannung und Injektionsvolumen in unseren Experimenten beobachtet. Interessen des Labors und relevante Fachgebiete sind nicht für die Fortsetzung dieser anhaltende Frage gut geeignet. Wir ermutigen diejenigen mit mehr Physik und Ingenieurscharfsinn, dieses Phänomen zu erforschen.

Die Beziehung zwischen Einspritzmenge und der angelegten Spannung ist abhängig von vielen Faktoren, einschließlich Geräteabmessungen, die Länge der Rohrleitung trägt die picoinjection Fluid zu der Vorrichtung, Molarität picoinjection Flüssigkeit und die Geschwindigkeit der Tröpfchen, wie sie passieren sie Injektors. Aus diesem Grund empfehlen wir, dass die Volumen / Spannungsbeziehung vor jedem Lauf picoinjection durch Messung Injektionsvolumina an den Rändern der Arbeitsbereiche der Spannung und Molarität charakterisie...

In tröpfchenbasierte Mikrofluidik, Mikrometermaßstab sind Wassertröpfchen als &quot;Reagenzglas&quot; für biologische Reaktionen verwendet. Der Vorteil für die Durchführung von Reaktionen in den winzigen Tröpfchen ist, dass jeder Tropfen verwendet nur wenige pl von Reagenz und mit Mikrofluidik, können die Tropfen geformt und bei 1 Kilohertz Raten verarbeitet werden. Durch Kombination dieser Eigenschaften können Millionen von Reaktionen mit einzelnen Zellen, Nukleinsäuremoleküle oder Verbindungen, die in wenigen Minuten mit ul Gesamtmaterials durchgeführt werden. Tropfen für Anwendungen wie diese verwenden, sind Techniken für das Hinzufügen kontrollierter Mengen von Reagenzien zu den Tropfen erforderlich ist; solche Operationen sind analog den in Teströhrchen pipettiert. Ein Verfahren, um dies zu erreichen ist Elektrokoaleszenz, wobei ein Tropfen des Reagenz mit dem Ziel Tropfen durch Anlegen eines elektrischen Feldes fusioniert. Das elektrische Feld stört die Anordnung der Tensidmoleküle an den Schnittstellen der Tropfen, inducing einen Dünnfilm-Instabilität und Auslösen Koaleszenz in Emulsionen, die sonst stabile 2 sind. Elektrisch induzierten Fusion ist ebenfalls in der Gestaltung des picoinjector, eine Vorrichtung, die Reagenzien in Tropfen spritzt, als sie an einem unter Druck stehenden Strömungskanal 3 ausgenutzt. Um das elektrische Feld gelten, picoinjector Geräte nutzen Metallelektroden, sondern die Integration von Metallelektroden in Mikrofluidik-Chips ist oft ein komplexer und fehleranfälliger Prozess, wie die Flüssig-Lote werden leicht durch Luftblasen oder Staub und andere Ablagerungen im Kanal beeinträchtigt sowie Frakturen von Stress oder während der Geräte-Setup Biegen. Hier stellen wir ein Verfahren zur picoinjection ohne die Verwendung von Metallelektroden führen, wodurch die Herstellung einfacher und robuster. Um picoinjection auslösen, wir verwenden stattdessen die Injektionsflüssigkeit selbst als Elektrode, da die meisten biologischen Reagenzien enthalten gelösten Elektrolyten und leitend sind. Wir haben auch eine &quot;Faraday Moa hinzufügent &quot;, um sensible Bereiche der Vorrichtung und als universelle Boden (1) abzuschirmen. Der Graben elektrisch isoliert die Tröpfchen stromaufwärts des picoinjection Website durch einen Boden und verhindert unbeabsichtigte Tröpfchen Fusion. Ein zusätzlicher Vorteil der Technik ist, dass der Menge in den Tropfen eingespritzten hängt von der Größe der angelegten Spannung, so dass sie durch Einstellen des angelegten Signals eingestellt werden. Wir fertigen unsere Geräte in Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) mit weichen Photolithographietechniken 4,5. Unser Ansatz ist mit Geräten in anderen Materialien hergestellt kompatibel, wie Harzen, Kunststoffen und Epoxidharzen. Die Kanäle weisen Höhen und Breiten von 30 um, die optimal für die Arbeit mit Tröpfchen 50 um Durchmesser (65 pl) sind. Wir stellen Reagenzien über Polyethylen-Schlauch (0.3/1.09 mm inneren / äußeren Durchmesser) in den Häfen während der Herstellung der Vorrichtung geschaffen mit 0,50 mm Biopsieausstanzungen, ähnlich descr Methoden eingesetztibed zuvor 5. Der genaue Aufbau der Einspritzfluid ist abhängig von der spezifischen Anwendung. Das Fluid braucht nur gelösten Elektrolyten in Konzentrationen, die hoch genug, um eine ausreichende Leitfähigkeit für das elektrische Signal an die picoinjector übertragen werden erhalten. In Laborversuchen wurde gefunden, dass die Ionenkonzentrationen größer als 10 mm sollte ausreichen 6, wenn dieser Wert und die Fluidleitfähigkeit auf den spezifischen Geräteabmessungen und Größe der angelegten Spannung abhängen.

<table><tbody><tr><td>1 ml Luer-Lok&trade; Spritzen</td><td>BD Medical</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>LocTite UV-härtender Klebstoff</td><td>Henkel</td><td>35241</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 Schlauch</td><td>Scientific Commodities</td><td>BB31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22363531</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 15 ml Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Luftdruckregelpumpe</td><td>Control Air Inc.</td><td></td><td>Wir empfehlen eine Spritzenpumpe unter der Kontrolle von Datenerfassung und Steuerungssoftware</td></tr><tr><td></td><td>New Era</td><td></td><td>Muss in der Lage sein, 1-ml-Spritzen zu halten und mit einer Geschwindigkeit von nur 100 &#956 zu fließen; l/h</td></tr><tr><td>HV-Verstärker</td><td></td><td></td><td>Muss in der Lage sein, Signale zwischen 0,01 und 10 V 1.000x zu verstärken</td></tr><tr><td>Plasmabonder/-reiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" Siliziumwafer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>647535</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 mit Härter sollte enthalten</td></tr> sein <tr><td>SU-8 Fotolack</td><td>MicroChem</td><td></td><td>Die Viskosität hängt von den Abmessungen des Geräts ab</td></tr></tbody></table>

picoinjection von mikrofluidik-tropfen ohne metall-elektroden

Picoinjection of Microfluidic Drops Without Metal Electrodes

Bestehende Verfahren zur picoinjecting Reagenzien in mikrofluidischen Tropfen erfordern in der mikrofluidischen Chip integrierten Metallelektroden. Die Integration dieser Elektroden fügt umständliche und fehleranfällige Schritte zum Komponenten-Herstellungsverfahren. Wir haben eine Technik entwickelt, die die Anforderungen für die Metallelektroden während picoinjection vermeidet entwickelt. Stattdessen wird die Injektionsflüssigkeit selbst als Elektrode, da die meisten biologischen Reagenzien enthalten gelöste Elektrolyte und leitend sind. Durch die Beseitigung der Elektroden reduzieren wir Gerät Herstellungszeit und Komplexität, und machen die Geräte robuster. Zusätzlich zu unserem Ansatz hängt die Einspritzvolumen auf, das mit dem picoinjection Lösung angelegt wird; dies ermöglicht es, die durch die Modulation der angelegten Spannung injizierte Volumen schnell einzustellen. Wir zeigen, dass unser Verfahren mit Reagenzien wie gemeinsame biologische Verbindungen, einschließlich Puffer, Enzyme und Nukleinsäuren kompatibel.

Mikroskopische Aufnahmen am picoinjection Website zeigen werden, dass die Elektrifizierung der picoinjection Flüssigkeit ist genug, um Injektion (Abbildung 2) auslösen. Das Injektionsvolumen kann durch Modulieren der Amplitude der angelegten Spannung, mit höheren Spannungen ermöglicht eine höhere Einspritzvolumina gesteuert werden. Zeichnen wir das Injektionsvolumen gegenüber dem Betrag der angelegten Spannung für drei repräsentative Molaritäten von Injektionsflüssigkeit in (Fig. 3). Um...

Wir haben eine Technik für picoinjecting Mikrofluidik-Tropfen, die Metallelektroden nicht auskommt. Als solche Vorrichtungen, die unsere Technik sind einfacher herzustellen und zu verwenden.

Picoinjection von Mikrofluidik-Tropfen ohne Metall-Elektroden

Existing methods for picoinjecting reagents into microfluidic drops require metal electrodes integrated into the microfluidic chip. The integration of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mikrofluidische Chips zu entwerfen, herzustellen und zu nutzen, die in der Lage sind, Reagenzien präzise und kontrolliert in Wasser-in-Öl-Tropfen einzuspritzen, ein Prozess, der als Piko-Injektion bekannt ist. Dies wird zunächst erreicht, indem ein Gerät mit einem Emulsionskanal entworfen wird, der sich auf einen Durchmesser verengt, der kleiner ist als der der kugelförmigen Tropfen, und diese gleichmäßig innerhalb eines inerten Trägeröls anordnet. Als zweiter Schritt werden die Wasser- und Öltropfen in das Gerät eingeführt und strömen zur Injektionsstelle. Ein senkrechter Kanal, der die zu injizierenden Reagenzien enth&auml;lt. Anschlie&szlig;end wird eine hohe Spannung auf die Injektionsfl&uuml;ssigkeit angewendet, w&auml;hrend die Tropfen die Injektionsstelle passieren, um die Vermischung der Tropfen mit der Injektionsfl&uuml;ssigkeit zu bewirken. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Einstellung der angelegten Spannung das Volumen des injizierten Reagenz pr&auml;zise im Pikoliter-Bereich gesteuert werden kann. Diese Technik entstand aus der Notwendigkeit heraus, die Herstellung unserer Vorrichtungen zu vereinfachen, indem der Bedarf an Metallelektroden entf&auml;llt.Die Vorteile gegenüber bestehenden Techniken liegen in der Leichtigkeit und Einfachheit des Gerätedesigns, der Herstellung und der Anwendung. Die in früheren Methoden verwendeten Metallelektroden neigten dazu, zu brechen und waren empfindlich gegenüber Staub und Rückständen in den Kanälen während der Herstellung. Durch die Eliminierung der Elektroden haben wir unsere Geräte robuster gemacht und die Effizienz unserer Herstellung verbessert. Der erste Schritt besteht darin, einen mikrofluidischen Chip basierend auf den Anforderungen des Experiments zu entwerfen.Verwenden Sie eine computergestützte Konstruktionssoftware, um später photolithografische Techniken anwenden zu können. Dieses Chip-Design weist Emulsionskanäle auf, die kleiner sind als die sphärischen Tröpfchen, die verwendet werden sollen, um eine effektivere Piko-Injektion zu ermöglichen. Die Piko-Injektionsstelle basiert auf einem aus der Literatur bekannten Design, bei dem die Metallelektroden entfernt wurden.Zusätzliche Kanäle wirken als Faraday-Graben, um stromaufwärts gelegene Tropfen vor dem elektrischen Feld abzuschirmen. Sobald die Konstruktion abgeschlossen ist, fertigen Sie die Vorrichtungen mittels weicher Fotolithographietechniken an und verbinden Sie diese mit einem Glasobjektträger, sodass die Vorrichtung betriebsbereit ist. Bereiten Sie eine Druckluftregelpumpe vor, um ein Reservoir mit Fluid unter Druck zu setzen.Ändern Sie dazu die Pumpenleistung, sodass die Druckluft durch ein Stück Polyethylen-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 2,7 Millimetern austritt. Schließen Sie den Schlauch ab, indem Sie ihn über die Hülse an der Rückseite einer Spritzenkanüle stecken. Befestigen Sie nach Abdichtung des Raums zwischen Spritze und Schlauch mit Epoxidharz eine Nadel der Größe 27,5 unter Verwendung von für das Experiment geeigneten Reagenzien.Stellen Sie eine homogene Emulsion aus wässrigen Tröpfchen, die in Trägeröl suspendiert sind, her. Füllen Sie die Emulsion in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27,5-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Befestigen Sie die Spritze anschließend in einer Spritzenpumpe und richten Sie sie mit der Nadel nach oben aus.Der nächste Schritt besteht darin, Reagenzien für die Einführung in die mikrofluidische Vorrichtung und deren Reservoire vorzubereiten. Beginnen Sie mit einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und dessen Verschluss. Verwenden Sie eine Biopsielösepunze oder ein anderes geeignetes Werkzeug, um drei 0,5-Millimeter-Lochungen in den Verschluss zu stanzen.Bereiten Sie eine Drahtelektrode mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern und einer Länge vor, die einige Zentimeter länger ist als das Zentrifugenröhrchen. Führen Sie diese Elektrode in eines der Löcher im Verschluss ein. Stellen Sie sicher, dass sie den Boden des Röhrchens erreicht und einige Zentimeter über die Oberseite hinausragt.Bereiten Sie anschließend ein etwa 20 Zentimeter langes Stück Polyethylen-Schlauch vor. Führen Sie dieses in ein zweites Loch ein. Auch hier sollte es den Boden des Rohrs im verbleibenden Loch erreichen.Führen Sie etwa 2,5 Zentimeter Polyethylen-Schlauch ein. Dieser Schlauch verbleibt oberhalb des Flüssigkeitsstands. Tragen Sie UV-härtenden Epoxidkleber auf, um Lücken auf der Oberseite des Verschlusses abzudichten.Wenn die Aushärtung abgeschlossen ist, füllen Sie das Rohr mit der gewünschten Pico-Injektionsflüssigkeit, 100 Millimolar Natriumchlorid, und schrauben Sie die Kappe fest. Verbinden Sie den Ausgang der Druckluftpumpe mit dem kürzeren Schlauchstück in der Kappe. Durch Einführen der Nadel in das Lumen sollte die Nadel fest sitzen.Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen in seinen Halter. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einmolarer Natriumchloridlösung. Verbinden Sie eine 27,5-Gauge-Nadel, um sie als Faradaygriffelflüssigkeit zu verwenden, und befestigen Sie die Spritze an einer Spritzenpumpe.Füllen Sie eine weitere Ein-Milliliter-Spritze mit Trägerabstandsöl. Befestigen Sie eine Nadel mit 27,5 Gauge und sichern Sie sie in einer Spritzenpumpe. An diesem Punkt können Verbindungen zum mikrofluidischen Chip hergestellt werden.Zunächst sicherstellen, dass der Chip auf einer flachen Oberfläche befestigt ist. Danach das offene Ende des langen Schlauchs vom Injektionsflüssigkeitsbehälter zum Chip führen. Diesen Schlauch mit dem Einlassanschluss der Pico-Injektionsflüssigkeit auf dem mikrofluidischen Chip verbinden.Danach Polyethylenschlauch an die Spritze mit Natriumchlorid anschließen und bis zum Chip verlegen. An den Einlassstutzen für den Faraday-Moat anschließen. Außerdem Schlauch verwenden, um die Spritze mit Trägeröl mit dessen Einlassstutzen am Gerät zu verbinden.Leiten Sie ein Rohr, das vom Emulsionsauslass stammt, in ein Sammelgefäß. Verbinden Sie abschließend den Auslass der Faraday-Grube mithilfe eines Schlauchs mit einem nichtleitenden, elektrisch isolierten Behälter. Am Ende sieht der mikrofluidische Chip folgendermaßen aus.Nehmen Sie nun einen Draht von der Masse eines Hochspannungsverstärkers und führen Sie ihn zur Nadel der Spritze mit Natriumchlorid. Befestigen Sie den Draht mithilfe einer Krokodilklemme an der Nadel. Führen Sie einen weiteren Draht vom Hochspannungs-Ausgang des Verstärkers zur Elektrode, die in der Pico-Injektionsflüssigkeit eingetaucht ist.Verwenden Sie eine Krokodilklemme, um die Verbindung als Eingang für den Verstärker herzustellen. Nutzen Sie den Computer-Ausgang eines softwaregesteuerten Funktionsgenerators. Beginnen Sie die Infusion des Systems, indem Sie die einmolare Natriumchlorid-Faraday-Motoren-Flüssigkeit mit 100 Mikrolitern pro Stunde in das Gerät einleiten.Danach starten Sie die Tropfen-, Emulsions- und Trägerölzufuhr, sodass die Tropfen in regelmäßigen Abständen, durch eine Lücke mit Trägeröl getrennt, die Piko-Injektionseinheit passieren. Stellen Sie den Druck des Piko-Injektionsfluids so ein, dass das Fluid an der Piko-Injektionsöffnung in den Tropfenkanal hineinwölbt, sich jedoch nicht ablöst, um eigene Tropfen zu bilden. Nutzen Sie den Wellengenerator, um ein 10-Kilohertz-Wechselstromsignal mit einer Amplitude von null bis 10 Volt zu erzeugen, das anschließend von dem Hochspannungsverstärker tausendfach verstärkt wird.Um die Pikoinjektion durchzuführen, wird dieses Signal auf die Tropfen angewendet, während sie die Injektionsöffnung passieren, wobei die Amplitude als Parameter genutzt wird. Dieser Film zeigt die selektive Injektion von Tropfen in Abhängigkeit vom Vorhandensein eines fluoreszierenden Farbstoffs.In diesem Fall passierten 200 Tropfen pro Sekunde den Injektor, aber Raten von bis zu 10.000 pro Sekunde sind bei geeigneter Tröpfchenerkennung möglich. Diese Diagramme zeigen den injizierten Volumenanteil in Abhängigkeit von der angelegten Spannung für Injektionsflüssigkeiten unterschiedlicher Molarität. Es wird angenommen, dass höhere Spannungen ein früheres Einsetzen der Koaleszenz verursachen, was zu längeren Injektionsdauern und größeren Volumina führt.Diese zweidimensionale Wärmekarte zeigt die Beziehung zwischen der Molarität der ionischen Lösung und der Spannung, die erforderlich ist, um Injektionsvolumina zu erreichen. Lösungen mit niedrigerer Molarität erfordern höhere Spannungen, da sie das elektrische Feld an der Injektionsstelle leichter reduzieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mikrofluidische Vorrichtungen schnell und robust entwirft und herstellt, die eine präzise und kontrollierbare Injektion von Reagenzien in Ihre Tropfen ermöglichen.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Hochspannung äußerst gefährlich sein kann; Vorsichtsmaßnahmen wie ordnungsgemäße Erdung, persönliche Schutzausrüstung und eingebaute Sicherheitssysteme sollten stets angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Ein neuartiger Mikrofluidik-System wurde entwickelt, mit dem Phänomen der passiven Pumpen und einem Benutzer gesteuert Flüssigkeit Delivery-System. Das Mikrofluidik-System hat das Potenzial, in einer Vielzahl von biologischen Anwendungen aufgrund ihrer niedrigen Kosten, einfache Handhabung, volumetrische Genauigkeit, hohe Geschwindigkeit, Reproduzierbarkeit und Automatisierung eingesetzt werden.

High Speed ​​Droplet-based Delivery System für Passive Pumping in Mikrofluidiksysteme

Quelle: Vanegas, M. I., et al. Mikroinjektrodensystem für kombinierte Wirkstoffinfusion und Elektrophysiologie. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt ein mikroelektrodenbasiertes mikrofluidisches Gerät, das eine Arzneimittellösung durch ein Kapillarrohr abgibt, wobei eine ölbasierte Markerlösung für eine präzise Volumenverfolgung verwendet wird und eine gleichzeitige neuronale Aufzeichnung und Wirkstoffinfusion ermöglicht wird.

Mikrofluidik-basiertes Mikroinjektrodensystem für die kombinierte Wirkstoffinfusion und Elektrophysiologie

Das Protokoll für die Herstellung und den Betrieb von Feldentnetzungsgeräten (Field-DW) wird beschrieben, sowie die vorläufigen Studien über die Auswirkungen elektrischer Felder auf den Tröpfchengehalt.

Vorteilhafte Reduzierte Droplet-Oberflächen-Wechselwirkung, um den Transport Bioanalyten in Digitale Mikrofluidik Optimieren

Wir präsentieren eine diskrete Tröpfchen Probeneinführungssystem für induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS). Es basiert auf einem günstigen und Einweg-Mikrofluidik-Chip, hochmonodispersen Tröpfchen von 90 bis 7000 Hz erzeugt in einem Größenbereich von 40 bis 60 &amp; mgr; m bei Frequenzen basiert.

Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

Wir stellen eine Methode vor, um die Grenzflächenenergie eines flüssigen Metalls in einem Elektrolyten durch elektrochemische Abscheidung (oder Entfernung) einer Oberflächenoxidschicht zu kontrollieren. Diese einfache Methode kann das Kapillarverhalten von flüssigen Metallen auf Galliumbasis steuern, indem die Grenzflächenenergie mit moderaten Spannungen schnell, signifikant und reversibel abgestimmt wird.

Eine Methode, die Oberflächenspannung eines Liquid Metal manipulieren via Oberfläche Oxidation und Reduktion

Wir zeigen, eine mikrofluidische Plattform mit einem Elektrodennetz integriert Oberfläche, die resistive Pulserfassungs kombiniert (RPS) mit Codemultiplex-Vielfachzugriff (CDMA), Auffinden und Ausmessen von Partikeln in mehrere mikrofluidische Kanäle zu multiplexen.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Wir präsentieren ein Mikroinjektionssystem für die Elektrophysiologie und die unterstützte Lieferung von experimentellen Sonden (d. h. Nanosensoren, Mikroelektroden) mit optionaler Medikamenteninfusion. Weit verbreitete mikrofluidische Komponenten sind mit einer Kanüle gekoppelt, die die Sonde enthält. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Mikroinjektionskonstruktion ist enthalten, mit Ergebnissen während der Muscimol-Infusion in Makaken-Kortex.

Microinjectrode System für kombinierte Arzneimittelinfusion und Elektrophysiologie

Wir beschreiben ein Schulungspaket, mit dem Benutzer mehrere Experimente durchführen und praktische Erfahrungen mit digitaler Mikrofluidik sammeln können.

Ein vielseitiges Kit basierend auf digitaler Mikrofluidics Droplet-Betätigung für die wissenschaftliche Bildung

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von glasbasierten mikrofluidischen Geräten vorgestellt, die zur Erzeugung von hochmonodispersen Emulsionen mit kontrollierter Tropfengröße verwendet werden.

Glasbasierte Geräte zur Erzeugung von Tropfen und Emulsionen

Die Herstellung einer auf Polydimethylsiloxan (PDMS) basierenden Doppelschichtbaurichtung zur Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken in Wasser-in-Öl-Emulsionen (Plugs) wird hier vorgestellt. Die notwendige Hard- und Software, die zur Automatisierung der Steckerproduktion erforderlich ist, wird im Protokoll detailliert beschrieben, und die Herstellung einer quantitativen Bibliothek von Leuchtstoffsteckern wird ebenfalls demonstriert.

Zweischichtiges mikrofluidisches Gerät für die kombinatorische Steckerproduktion

Das Protokoll beschreibt eine fortschrittliche mikrofluidische Plattform zur quantitativen Messung der Zytokinsekretionsdynamik einzelner mononukleärer Zellen des menschlichen peripheren Blutes. Die Plattform misst bis zu drei Zytokine parallel (IL-6, TNFα und IL-1β) für jede einzelne Zelle, die beispielsweise mit Lipopolysaccharid stimuliert wird.

Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen 

Erfahren Sie eine neue Methode zur Picoinjektion in Mikrofluidik-Tropfen ohne Metall-Elektroden. Diese Technik ermöglicht präzise Reagenzienkontrolle bei picolitern Auflösung und vereinfacht die Geräteherstellung erheblich.

Picoinjection von Mikrofluidik-Tropfen ohne Metall-Elektroden

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