Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Ausmaß der myofibrillären Organisation in durchsichtigen Zebrafisch-Larven zu bewerten und für beide Methoden die zurückgelegte Schwimmstrecke als Reaktion auf taktile Stimulation zu quantifizieren. Dies wird zunächst erreicht, indem die Zebrafische gepaart und im zweiten Schritt des Assays zur Beurteilung der Muskelstruktur lebensfähige Eier gesammelt werden. Ein beschichtetes, anästhesiertes Zebrafisch-Embryo wird direkt zwischen zwei polarisierte Linsen auf einem Stereomikroskop-Objektträger positioniert, sodass der Fisch entlang der seitlichen Körperachse ausgerichtet ist und sich in einer möglichst flachen Position befindet.

Die Doppelbrechung wird anschließend visualisiert und die Muskelintegrität quantifiziert. Im zweiten Schritt des berührungsinduzierten Fluchtversuchs wird eine einzelne beschichtete Larve in eine tiefe Petrischale gegeben und dann im Sichtfeld des Stereomikroskops zentriert. Ein mechanischer Reiz wird den Larven verabreicht, indem man mit einer Insektennadel an den Schwanz tippt, und die Reaktion des Tieres wird aufgezeichnet, bis der Embryo mit dem Schwimmen aufhört oder aus dem Sichtfeld schwimmt.

Schließlich können Unterschiede in der Muskelorganisation und den lokomotorischen Reaktionen quantifiziert werden. Die Hauptvorteile dieser nicht-invasiven Techniken bestehen darin, dass eine große Anzahl von Fischen schnell analysiert werden kann und dass Skelettmuskeldefekte beim selben Fisch über mehrere Tage hinweg in vivo verfolgt werden können. Visuelle Demonstrationen der richtigen Einstellung polarisierender Linsen und der korrekten Positionierung der Larven sind entscheidend, um den Erfolg sicherzustellen.

Mit diesen Assays entfernen Sie die nicht lebensfähigen Eier aus allen Gelegen, die von adulten Fischen nach der Paarung gesammelt wurden. Diese erscheinen im Allgemeinen mit bloßem Auge weiß und undurchsichtig oder als Ansammlung dunkler, ungeordneter Zellen unter dem Mikroskop. Bringen Sie die Embryonen anschließend zurück in den Inkubator, um sie drei bis sieben Tage nach der Befruchtung weiter wachsen zu lassen. Wenn sich der gewünschte Embryo noch in seiner Chorionhülle befindet, verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um vorsichtig einen Riss in das Chorion des gewünschten Embryos zu machen, und drehen Sie ihn dann um, sodass der Embryo herausfällt.

Narkotisieren Sie die beschichteten Embryonen mit Trica, um ihre korrekte Positionierung zu erleichtern, und rüsten Sie ein Stereomikroskop mit einer rotierbaren polarisierten Linse aus, um den Winkel des polarisierten Lichts anzupassen. Sobald sich die Embryonen gestreckt haben, platzieren Sie eine zweite polarisierte Linse direkt unterhalb der oberen Linse auf dem Mikroskoptisch und legen Sie die Embryonen direkt auf die zweite Linse. Jeder interessierende Embryo sollte dann entlang der Seitenachse seines Körpers ausgerichtet werden.

Drehen Sie die obere Linse, während das Embryo von Interesse im Blickfeld ist, bis die Polarisationsachsen der beiden Linsen um 90 Grad zueinander ausgerichtet sind und der Hintergrund vollständig dunkel erscheint. Bewegen Sie den Fisch leicht, um sicherzustellen, dass er so flach wie möglich liegt. Wenn der Fisch gekrümmt ist, werden nur die Abschnitte mit flacher Ausrichtung das polarisierte Licht durchlassen und mittels frt sichtbar werden.

Beobachten Sie nun das Birefringenz-Phänotyp des Wildtyp-Fisches. Hochgradig organisierte Skelettmuskeln zeigen eine starke Birefringenz, da der Brechungsindex für Licht, das parallel zu den Myofilamenten verläuft, höher ist als der für polarisiertes Licht, das senkrecht zu diesen Strukturen verläuft. Fische mit ungeordneten Skelettmuskeln, was auf eine neurodegenerative Myopathie oder einen Entwicklungsdefekt hindeutet, weisen typischerweise eine allgemeine Verminderung der Birefringenz auf, wie sie bei Fischen mit ungeordneten Skelettmuskeln beobachtet wird.

Charakteristisch für eine Muskeldystrophie. Zeigen üblicherweise ein fleckiges Muster der Doppelbrechung mit dunklen Bereichen, die Muskeldystrophie darstellen, inmitten heller Bereiche mit normalem Muskelbau. Erfassen Sie Bilder der Fische im polarisierten Licht, um die Doppelbrechung zu quantifizieren.

Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien. Öffnen Sie die Doppelbrechungsbilder in einer Bildverarbeitungssoftware. Wenn wie hier ImageJ verwendet wird, verwenden Sie zunächst das Polygon-Auswahlwerkzeug, um eine Linie um den Körper des Fisches zu zeichnen, um den Bereich des Zebrafischmuskels für die Messung festzulegen.

Danach im Dropdown-Menü „Analyze“ die Option „Messungen festlegen“ wählen, um die erforderlichen Statistiken für das Bild auszuwählen. Die Felder für Fläche, mittlerer Grauwert sowie minimaler und maximaler Grauwert aktivieren, um den test für das berührungsevokierten Fluchtverhalten zwei bis sieben Tage nach der Befruchtung vorzubereiten. Die beschichteten Fische der Untersuchung einzeln in tiefe Petrischalen geben und jeweils nur mit einem Embryo gleichzeitig arbeiten.

Zentrieren Sie den Fisch im Sichtfeld eines Stereomikroskops, das mit einem digitales Kamera-System ausgestattet ist, und beginnen Sie die sequenzielle Aufnahme mit einer Bildrate von größer als oder gleich 30 Hertz. Berühren Sie anschließend mit einer Insektennadel das Schwanzende des Embryos, um den mechanischen sensorischen Reiz zu applizieren, und stoppen Sie die Aufnahme, sobald der Embryo mit dem Schwimmen aufgehört hat oder das Sichtfeld verlassen hat. Konvertieren Sie abschließend die sequenziellen Bilder in eine Videodatei oder analysieren Sie die einzelnen Einzelbilder der Zeitrafferaufnahmen.

Die Offline-Doppelbrechung kann als effizienter, nichtinvasiver Test verwendet werden, um Aufschluss über den Zustand der Myo-Fibrillenorganisation in lebenden Zebrafischembryonen zu erhalten. Wildtyp-Zebrafische weisen fünf Tage nach der Befruchtung unter polarisiertem Licht eine starke Doppelbrechung in den Skelettmuskeln auf, was auf die geordnete Anordnung der Myofilamente zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu zeigen gleichaltrige Embryonen, die homozygot für eine pathogene Mutation im Dystroglycan- oder DAG1-Gen sind, eine fleckige Doppelbrechung, die auf Bereiche von Muskeldegeneration hinweist. Dieses fleckige Muster und das schnelle Fortschreiten der Muskeldegeneration während der frühen Entwicklung stimmen mit anderen dystrophischen Fischmodellen überein.

Die Quantifizierung der Doppelbrechung bei fünf Tage post Befruchtung dystrophischer DAG1-Mutanten zeigt eine signifikante Abnahme der Helligkeit auf 27,9 ± 5,3 % der maximalen Doppelbrechung im Vergleich zu ihren wildtypischen Geschwistern. Diese Abnahme ist stärker ausgeprägt als die auf 52,4 ± 5,5 %, die bei drei Tage post Befruchtung myopathischen mtm1-Morpholinos beobachtet wird. Myopathische Fischmodelle weisen hingegen tendenziell eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung im Vergleich zum Wildtyp auf, da häufig eine Desorganisation der Myofibrillen in den großen axialen Skelettmuskeln vorliegt, jedoch kein Hinweis auf degenerative Veränderungen besteht. Berührungsempfindliche Fluchtverhalten können genutzt werden, um zu zeigen, dass Zebrafischmodelle von Skelettmuskelkrankheiten motorische Defekte und Schwimmstörungen aufweisen.

Dieses erste Video zeigt einen durch Berührung ausgelösten Fluchtverhaltens-Test an Zebrafischen vom Wildtyp. Achten Sie darauf, wie die normalen Larven fünf Tage nach der Befruchtung sehr schnell davon schwimmen. Als Reaktion auf eine Berührung wurde in diesem zweiten Video das berührungsinduzierte Fluchtverhalten von dag1-Larven aufgezeichnet.

Beachten Sie, wie sich die Mutanten-Embryonen fünf Tage nach der Befruchtung durch eine beeinträchtigte Reaktion auf Berührung auszeichnen und nach der Stimulation das Sichtfeld nicht verlassen. Die Videos wurden anschließend Bild für Bild analysiert, um zu bestätigen, dass DAG1-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen eine eingeschränkte Bewegung als Reaktion auf taktile Reize zeigen. Die Distanzen, die beide Embryonentypen innerhalb eines festgelegten Zeitintervalls zurücklegen konnten, wurden gemittelt und deuten auf eine verminderte motorische Funktion bei DAG1-Mutanten hin.

Nachdem diese Techniken einmal beherrscht werden, können sie an großen Mengen von Fischen über einen kurzen Zeitraum durchgeführt werden, was entscheidend ist, wenn Hochdurchsatz-Screenings mit Chemikalien oder Mutagenese durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können aufwändigere Methoden wie Immunhistochemie oder Elektronenmikroskopie angewendet werden, um Defekte im Skelettmuskel auf molekularer und struktureller Ebene zu untersuchen.