Name: Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Doppelbrechung und berührungsempfindliche Escape-Response-Assays nutzen, um Skelettmuskeldefekte bei Zebrafischlarven zu analysieren. Diese nichtinvasiven Methoden ermöglichen die schnelle Bewertung der Muskelintegrität in vivo.

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Wir danken Behzad Moghadaszadeh für seine wunderbare Hilfe bei der Quantifizierung von Doppelbrechungsbildern. Diese Arbeit wurde von der Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) und dem National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345) sowie mit großzügiger Unterstützung von A Foundation Building Strength, Cure CMD und der AUism Charitable Foundation finanziert. VAG wird von K01 AR062601 des National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases unterstützt, und LLS wird von F31 NS081928 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke unterstützt.

1. In vivo Analyse der Skelettmuskelstruktur durch Doppelbrechung
<ol>
	Bereiten Sie am <li>späten Nachmittag nach der Fütterung Paarungskäfige vor, in denen das Männchen vom Weibchen der gewünschten Zebrafischlinie(n) getrennt wird.
	<ol>
		<li>Unterscheiden Sie Weibchen an ihrem größeren Unterbauch und der leichten blau-weißen Färbung und Männchen an ihrer schlanken Körperform und ihren rosa/gelben Farbtönen.</li>
		<li>Der Erfolg bei paarweisen Kreuzungen (ein Männchen und ein Weibchen) kann nur etwa 50% betragen. Für eine höhere Erfolgsquote verpaaren Sie ein Männchen mit 2-3 Weibchen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Entfernen Sie die Käfigtrennwände am nächsten Morgen kurz nach Lichteinbruch und lassen Sie die Fische ungestört laichen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Eier mit einem Sieb, wenn eine ausreichende Anzahl befruchteter Eier auf den Boden des Tanks gelegt wurde.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen in eine tiefe Petrischale, indem Sie das Sieb mit Fischwasser spülen, und setzen Sie die Elternfische in ihre Tanks zurück. Legen Sie die Schalen mit den Embryonen in einen 28,5 °C heißen Inkubator.</li>
	<li>Reinigen Sie die unbrauchbaren Eier und Ablagerungen später am Tag oder am nächsten Morgen und legen Sie die Embryonen für das weitere Wachstum in den Inkubator zurück.</li>
	<li>Embryonen/Larven erreichen das geeignete Alter, um 3-7 Tage nach der Befruchtung (dpf) eine Doppelbrechung zu beobachten, da die Ergebnisse vor 3 dpf möglicherweise unter einem begrenzten Kontrast leiden können. Wildtyp-Embryonen schlüpfen zwischen 48 und 60 Stunden nach der Befruchtung (hpf) aus ihren Chorionen, gefolgt von einer Aufrichtung der Körperachse. Spät geschlüpfte Wildtyp- oder mutierte Embryonen können eine manuelle Dechorionierung erfordern.
	<ol>
		<li>Machen Sie mit einer scharfen Pinzette vorsichtig einen Riss in den Chorion und drehen Sie ihn auf den Kopf, so dass der Embryo herausfällt.</li>
		<li>Lassen Sie dechorionierte Embryonen sich begradigen, bevor Sie mit dem Assay beginnen.</li>
		<li>Betäuben Sie die Embryonen mit Tricain (0,04 % in Fischwasser), um ihre korrekte Positionierung zu unterstützen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Statten Sie ein Präpariermikroskop mit einer polarisierten Linse aus, die gedreht werden kann, um den Winkel des polarisierten Lichts einzustellen (Abbildung 1A).</li>
	<li>Platzieren Sie dechorionierte, anästhesierte Embryonen direkt auf einer zweiten polarisierten Linse entlang der lateralen Achse des Körpers. Die zweite Linse sollte unterhalb der oberen Linse auf dem Mikroskoptisch positioniert werden (Abbildung 1B). Verwenden Sie während des Doppelbrechungstests zu keinem Zeitpunkt Petrischalen aus Kunststoff, da Kunststoff kein geeignetes Medium für die Übertragung von gebrochenem Licht ist.</li>
	<li>Drehen Sie die obere Linse mit dem interessierenden Embryo im Blickfeld, bis die Polarisationsachsen der beiden Linsen im 90°-Winkel zueinander ausgerichtet sind und der Hintergrund vollständig dunkel ist.</li>
	<li>Die optimale Ausgabe des Assays hängt von der Ausrichtung der Fische zwischen zwei polarisierten Linsen ab. Bewegen Sie den Fisch herum, um sicherzustellen, dass er so flach wie möglich liegt.
	<ol>
		<li>Wenn der Fisch gekrümmt ist, lassen nur die Segmente mit dieser flachen Ausrichtung das polarisierte Licht durch und weisen eine Doppelbrechung auf. In solchen Fällen ist die Doppelbrechung in den flachen Bereichen zu messen und die Doppelbrechung der entsprechenden Fläche bei den Wildtyp-Fischen (z. B. Somiten 1-10 sowohl bei Wildtyp- als auch bei mutierten Fischen) zu erfassen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Beobachten Sie den doppelbrechenden Phänotyp des Fisches.
	<ol>
		<li>Wildtyp-Fische mit hochorganisierter Skelettmuskulatur zeigen eine helle Doppelbrechung, da der Brechungsindex für das Licht parallel zu den Myofilamenten höher ist als das polarisierte Licht senkrecht zu diesen Strukturen.</li>
		<li>Fische mit einer desorganisierten Skelettmuskulatur, die auf eine nicht-degenerative Myopathie oder einen Entwicklungsdefekt hindeuten, zeigen typischerweise eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung.</li>
		<li>Fische mit unorganisierter Skelettmuskulatur, die für eine Muskeldystrophie charakteristisch sind, weisen häufig ein fleckenartiges Muster der Doppelbrechung auf, wobei dunkle Bereiche eine Muskeldegeneration zwischen hellen Bereichen normaler Muskelarchitektur darstellen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Doppelbrechung, indem Sie Bilder von Wildtyp- und mutierten Fischen unter polarisiertem Licht bei gleichen Belichtungseinstellungen und Vergrößerungen aufnehmen. Speichern Sie Bilder als .tiff Dateien.
	<ol>
		<li>Öffnen Sie Doppelbrechungsbilder in der ImageJ-Software (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>Wählen Sie für jedes Bild den Bereich des Zebrafischmuskels aus, indem Sie mit der Option "Polygonauswahl" in der Symbolleiste eine Linie um den Körper ziehen.</li>
		<li>Verwenden Sie "Messungen festlegen" im Dropdown-Menü "Analysieren", um die erforderlichen Statistiken für das Bild auszuwählen.
		<ol>
			<li>Die Mindestauswahl erfordert, dass die Kontrollkästchen für "Bereich", "Mittlerer Grauwert" und "Minimaler und maximaler Grauwert" aktiviert sind.</li>
			<li>Ein maximaler Grauwert von >255 gibt die Pixelsättigung an. Verwenden Sie daher Bilder mit maximalen Grauwerten von weniger als 255.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Normalisieren Sie die mittlere Intensität mit dem ausgewählten Bereich und wiederholen Sie das gleiche Quantifizierungsverfahren für jedes Doppelbrechungsbild.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Assay für berührungsevoziertes Fluchtverhalten
<ol>
	<li>Bilden Sie Paarungen der entsprechenden Zebrafischlinie(n) und entnehmen Sie Embryonen, wie oben in den Schritten 1.1-1.5 beschrieben.</li>
	<li>2-7 Tage nach der Befruchtung legen Sie dechorionierte Embryonen/Larven einzeln in eine tiefe Petrischale oder in die Kammern von Multiwell-Platten.</li>
	<li>Wenn Sie jeweils nur mit einem Embryo arbeiten, zentrieren Sie den Embryo im Sichtfeld eines Nikon SMZ1500-Stereomikroskops mit einem SPOT RT3 Digitalkamerasystem oder ähnlichem und beginnen Sie mit der sequentiellen Bildgebung.
	<ol>
		<li>Die gleiche Häufigkeit der Bildgebung sollte sowohl für Wildtyp- als auch für mutierte Fische verwendet werden. Es werden Bildraten >30 Hz empfohlen, da langsamere Raten in der Regel nicht ausreichen, um das schnelle Schwimmen von Wildtyp-Fischen einzufangen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Geben Sie mechanosensorische Reize an den Embryo ab, indem Sie den Schwanz mit einer Insektennadel berühren.</li>
	<li>Beenden Sie die Bildgebung, wenn der Embryo aufgehört hat zu schwimmen oder aus dem Sichtfeld geschwommen ist.</li>
	<li>Konvertieren Sie sequenzielle Bilder in eine Videodatei oder analysieren Sie einzelne Frames von Zeitrafferbildern offline mit der Software SPOT 5.1 Advanced. Ähnliche Softwarepakete umfassen Open Lab, NIS Elements oder das frei verfügbare ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
	<li>Quantifizieren Sie das Schwimmverhalten, indem Sie die berührungsprovozierte Reaktion in mehreren Embryonen durchführen.
	<ol>
		<li>Dies kann erreicht werden, indem die Entfernung, die Embryonen innerhalb eines festgelegten Zeitintervalls schwimmen können, mit Hilfe einer Software oder eines metrischen Lineals gemittelt wird, um den Start- und Endpunkt des Schwimmtrainings zu markieren.</li>
		<li>Vermeiden Sie, dass sich Embryonen im Laufe der Zeit an den Berührungsreiz gewöhnen, indem Sie den Assay bei jeder experimentellen Wiederholung mit einem neuen Embryo durchführen. Das Verhalten in Wildtyp- und zuverlässigen Mutantenmodellen ist in der Regel hochgradig reproduzierbar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Primäre neuromuskuläre Erkrankungen werden traditionell als dystrophische oder nicht-dystrophische Prozesse klassifiziert. Muskeldystrophien sind gekennzeichnet durch eine Myofaserdegeneration, gefolgt von wiederholten Regenerationsrunden, die schließlich zu einem Prozess im Endstadium führt, der durch Fibrose und Ersatz durch Fettgewebe gekennzeichnet ist14. Nichtdystrophische Myopathien sind im Gegensatz dazu nicht mit Nekrosen oder regenerativen Veränderungen verbunden, führen jedoch zu unorganisierten Myof...

<table><tbody><tr><td>Tricain </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>Insektenstift</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>Polarisierte Linsen</td><td>Ritz Camera</td><td>Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>Isotemp Inkubator Modell 630D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kamera-Diagnoseinstrumente Inc.</td><td>SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT 5.1 Fortgeschritten</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von skelettmuskeldefekten bei zebrafischlarven mittels doppelbrechung und berührungsempfindlichen escape-response-assays

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafische (Danio rerio) sind zu einem besonders effektiven Werkzeug für die Modellierung menschlicher Krankheiten geworden, die die Skelettmuskulatur betreffen, einschließlich Muskeldystrophien1-3, angeborene Myopathien4,5 und Störungen in der sarkomerischen Assemblierung6,7, aufgrund hoher genomischer und struktureller Konservierung bei Säugetieren8. Muskeldesorganisation und Beeinträchtigung des Bewegungsapparates können beim Zebrafisch in den ersten Tagen nach der Befruchtung schnell beurteilt werden. Zwei Assays zur Charakterisierung von Skelettmuskeldefekten beim Zebrafisch sind die Doppelbrechung (strukturell) und die berührungsevozierte Fluchtreaktion (verhaltensbezogen).
Doppelbrechung ist eine physikalische Eigenschaft, bei der Licht beim Durchgang durch geordnete Materie, wie z.B. die pseudokristalline Anordnung von Muskelsarkomeren9, gedreht wird. Es handelt sich um einen einfachen, nicht-invasiven Ansatz zur Beurteilung der Muskelintegrität bei durchscheinenden Zebrafischlarven in einem frühen Entwicklungsstadium. Wildtyp-Zebrafische mit hochorganisierten Skelettmuskeln erscheinen sehr hell vor einem dunklen Hintergrund, wenn sie zwischen zwei polarisierten Lichtfiltern visualisiert werden, während Muskelmutanten Doppelbrechungsmuster aufweisen, die spezifisch für die primäre Muskelerkrankung sind, die sie modellieren. Zebrafische, die Muskeldystrophien modellieren, Krankheiten, die durch Myofaserdegeneration gefolgt von wiederholten Regenerationsrunden gekennzeichnet sind, zeigen degenerative dunkle Flecken in der Skelettmuskulatur unter polarisiertem Licht. Nichtdystrophische Myopathien sind nicht mit Nekrosen oder regenerativen Veränderungen verbunden, sondern führen zu unorganisierten Myofasern und Skelettmuskelschwäche. Myopathische Zebrafische zeigen typischerweise eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung, was die Desorganisation der Sarkomere widerspiegelt.
Der berührungsevozierte Escape-Assay beinhaltet die Beobachtung des Schwimmverhaltens eines Embryos als Reaktion auf taktile Stimulation10-12. Im Vergleich zu Wildtyp-Larven zeigen mutierte Larven häufig eine schwache Fluchtkontraktion, gefolgt von langsamem Schwimmen oder einer anderen Art von Bewegungseinschränkung, die die Larven nicht mehr als eine kurze Strecke vorantreibt12. Der Vorteil dieser Assays besteht darin, dass das Fortschreiten der Krankheit bei derselben Fischart mehrere Tage lang in vivo überwacht werden kann und dass eine große Anzahl von Fischen in kurzer Zeit im Vergleich zu höheren Wirbeltieren analysiert werden kann.

Doppelbrechung kann als effiziente, nichtinvasive Methode verwendet werden, um Aufschluss über den Zustand der Myofibrillenorganisation in lebenden Zebrafischembryonen zu erhalten. Es werden Beispiele für Wildtyp-Zebrafische sowie für Zebrafische mit verringertem Ausmaß der Expression von Genen, die für die Entwicklung und Funktion der Skelettmuskulatur entscheidend sind, präsentiert. Wildtyp-Zebrafische im Alter von 5 Tagen postfertilisation (dpf) weisen unter polarisiertem Licht stark doppelbrechende Skelettmuskeln auf...

Der Zebrafisch ist mittlerweile ein etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug zur Modellierung von Muskeldystrophien, angeborenen Myopathien und verwandten neuromuskulären Erkrankungen. Doppelbrechung und berührungsevoziertes Fluchtverhalten sind zwei gängige nicht-invasive Assays, die verwendet werden, um den Grad der Muskeldesorganisation und der Beeinträchtigung des Bewegungsapparates von Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung zu bestimmen.

Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Ausmaß der myofibrillären Organisation in durchsichtigen Zebrafisch-Larven zu bewerten und für beide Methoden die zurückgelegte Schwimmstrecke als Reaktion auf taktile Stimulation zu quantifizieren. Dies wird zunächst erreicht, indem die Zebrafische gepaart und im zweiten Schritt des Assays zur Beurteilung der Muskelstruktur lebensfähige Eier gesammelt werden. Ein beschichtetes, anästhesiertes Zebrafisch-Embryo wird direkt zwischen zwei polarisierte Linsen auf einem Stereomikroskop-Objektträger positioniert, sodass der Fisch entlang der seitlichen Körperachse ausgerichtet ist und sich in einer möglichst flachen Position befindet. Die Doppelbrechung wird anschließend visualisiert und die Muskelintegrität quantifiziert. Im zweiten Schritt des berührungsinduzierten Fluchtversuchs wird eine einzelne beschichtete Larve in eine tiefe Petrischale gegeben und dann im Sichtfeld des Stereomikroskops zentriert. Ein mechanischer Reiz wird den Larven verabreicht, indem man mit einer Insektennadel an den Schwanz tippt, und die Reaktion des Tieres wird aufgezeichnet, bis der Embryo mit dem Schwimmen aufhört oder aus dem Sichtfeld schwimm

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Birefringenz- und Berührungsvermeidungstest

Dieses Video beschreibt den Tast-Evoke-Response-Assay, der die Reaktion der Zebrafischlarve auf Berührungsreize misst.

Escape Response Assay: Eine Methode zur Untersuchung der Reaktion von Zebrafischlarven auf Berührungsreize

Das Video beschreibt die Vermeidung und den Thigmotaxis-Assay von Zebrafischlarven. Das Video untersucht das Verhalten von Zebrafischlarven als Reaktion auf visuelle aversive Reize.

Zebrafischvermeidung und Thigmotaxis-Assay: Eine Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung des Larvenverhaltens als Reaktion auf aversiven visuellen Reiz

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Kraftmessungen können verwendet werden, um Veränderungen in Muskel-Funktion aufgrund der Entwicklung, Verletzungen, Krankheit, Behandlung oder chemische Toxizität nachzuweisen. In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Kraft während einer maximalen Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Wir präsentieren eine Methode zur elektroretinographischen (ERG) Analyse von Zebrafischlarven unter Verwendung von Mikromanipulations- und Elektroretinographie-Techniken. Dies ist eine einfache und unkomplizierte Methode, um die Sehfunktion von Zebrafischlarven in vivo zu bestimmen.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven.  Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Zebrafische sind ein hervorragendes Modell, um Muskelfunktionen und -krankheiten zu untersuchen. Während der frühen Embryogenese beginnen Zebrafische regelmäßige Muskelkontraktionen, die ein rhythmisches Schwimmverhalten erzeugen, das sich verändert, wenn der Muskel gestört wird. Hier beschreiben wir einen berührungsevozierten Reaktions- und Fortbewegungsassay, um die Schwimmleistung als Maß für die Muskelfunktion zu untersuchen.

Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Charakterisierung eines Zebrafischmodells der Epilepsie vor, das aus der vorübergehenden Hemmung des DEPDC5-Gens resultieren.

Verhaltens- und physiologische Analyse in einem Zebrafischmodell der Epilepsie

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Eine neue vielseitige Methode zur Beobachtung der Mikrozirkulation wird vorgestellt. Es gilt als geeignet für eine langfristige Beobachtung und für die Kombination mit pharmacophysiological oder molekularbiologische Eingriffe.

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

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