Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anwendung einer Dehnverletzung als Modell für eine traumatische Hirnverletzung zu demonstrieren. Dies wird zunächst durch die Kultivierung von mikrovaskulären endothelialen Zellen in flexiblen Bodenmulden erreicht, die eine Spiegelung ermöglichen. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen durch Verringerung des Fötales-Rinderserum-Anteils im Kulturmedium zu differenzieren.

Anschließend werden die Zellen mithilfe der Zelldehnvorrichtung verletzt. Der letzte Schritt besteht in der Beurteilung des Ausmaßes der Zellschädigung. Letztendlich wird die durch Dehnung verursachte Schädigung von Gehirnendothelzellen verwendet, um die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke in vitro darzustellen.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von traumatischen Hirnverletzungen, da sie den tatsächlichen Einfluss modelliert, der während einer traumatischen Hirnverletzung (TBI) an der Blut-Hirn-Schranke auftritt, mithilfe einer Dehnverletzung von marinen Hirnendothelzellen. Die Durchführung der Prozedur wird Dr. Elaine Salvador, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie diese Prozedur, indem Sie die marinen mikrovaskulären Hirnendothelzellen in einem T-75-Kulturfläschchen kultivieren.

Ersetzen Sie das Medium zweimal wöchentlich, bis die Konfluenz erreicht ist. Waschen Sie die Zellen danach mit PBS. Entfernen Sie anschließend den PBS und tryps.

Versetzen Sie die Zellen mit zwei Millilitern warmer Trypsin-EDTA-Lösung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten oder bis die Zellschicht aufgelöst ist. Danach fügen Sie acht Milliliter Kulturmedium zu den Zellen hinzu und klopfen Sie mehrmals leicht auf das Kolben, um die Zellen zu lösen.

Unter dem Mikroskop die Zellen überprüfen, um sicherzustellen, dass sie vollständig vom Kolben abgelöst sind. Anschließend das Medium mit den abgelösten Zellen mehrmals auf- und abpipettieren. Danach den Kolben vorsichtig schwenken, um die Zellsuspension zu homogenisieren.

Gebe 20 Mikroliter der Zellsuspension in ein Hämozytometer und zähle die Anzahl der Zellen. Bestimme die Zelldichte und sähe 20.000 Zellen pro Quadratzentimeter in die Vertiefung ein. Übertrage anschließend die Zellsuspension in Kollagen.

Eine vorkodierte Sechsfachplatte mit flexiblen Böden und einer Gesamtvolumenkapazität von drei Millilitern pro Vertiefung. Erneuern Sie das Kulturmedium zweimal wöchentlich und kultivieren Sie die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius, bis sie konfluent sind.

Für die Zell-Differenzierung wechseln Sie das Kulturmedium der Zellen durch Differenzierungsmedium und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie in diesem Verfahren das Zellschädigungs-Regelgerät ein und stellen Sie die Verzögerung auf 50 Millisekunden ein. Stellen Sie anschließend den Reglerdruck auf 15 PSI ein und betätigen Sie den Auslöser mehrmals, bis der gemessene Spitzendruck stabil ist.

Danach die Reglerdruck auf den gewünschten Wert einstellen. Anschließend die Kulturplatte mit sechs flexiblen Bodenmulden in den Plattenträger stellen. Sicherstellen, dass der Muldenwähler auf die korrekte Muldengröße eingestellt ist.

Danach den Adapterstecker fest aufsetzen, wobei der Stecker mit einer Hand festgehalten wird, während mit der anderen Hand der Auslöser betätigt wird, um den danach erzeugten Spitzenwert des Drucks aufzuzeichnen. Die Platte unverzüglich wieder in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator für die gewünschte Dauer zurückstellen oder sofort für nachfolgende Experimente oder die Auswertung verwenden, um die Dehnverletzung mittels DI-Aufnahmetest zu bewerten. Unmittelbar nach der Dehnung der Zellen 30 µL einer Ein-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung des Vitalitätsfarbstoffs, der als Zytotoxizitätsmarker im Zellkulturmedium wirkt, hinzufügen.

Um die Dehnungsverletzung anhand der Freisetzung von Lactatdehydrogenase zu bewerten. Unmittelbar nach der Dehnung entnehmen Sie 200 Mikroliter Zellkulturmedium aus dem Ansatz und verfahren ebenso mit jedem gewünschten Zeitpunkt nach der Verletzung, den Sie in Ihre Untersuchung der LDH-Freisetzung einbeziehen möchten. Anschließend zentrifugieren Sie das Zellkulturmedium fünf Minuten lang bei der höchsten Einstellung eines Mikrozentrifugens.

Um Zelltrümmer zu entfernen, entfernen Sie das Überstand und verwenden Sie ihn für die nachfolgenden Schritte. Sobald die erforderlichen Proben aus verschiedenen Zeitpunkten entnommen wurden, lysieren Sie die Zellen mithilfe der im LDH-Assay-Kit enthaltenen Lysepufferlösung. Danach geben Sie 100 Mikroliter des im Assay-Kit enthaltenen Assay-Mediums in jedes Brunnen einer im Kit bereitgestellten 96-Loch-Platte.

Anschießend 100 Mikroliter des zellfreien Zellkulturmediums in zwei parallele Vertiefungen der 96-Loch-Platte geben, die Platte 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Extinktion bei 492 Nanometern messen. Gezeigt ist hier die lichtmikroskopische Untersuchung von normalen im Vergleich zu geschädigten Zellen.

Die normale, ungedehnte Zellmonolayer ist dicht gepackt und die Zellen sind langgestreckt. Wenn eine Spitzen-Druckpuls von 1,8 bis 2,0 PSI angelegt wird, erscheinen die Zellen weniger kompakt. Bei moderater Verletzung durch einen Spitzen-Druckpuls von 2,5 bis 3,0 erscheinen einige Zellen geschwollen und deformiert. Bei starker Dehnung von 3,5 bis 4,5 PSI ziehen sich die Zellen zurück.

Hier ist die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von normalen im Vergleich zu verletzten Zellen. Die Zellen wurden zwei Stunden nach der Verletzung mit einer Vitalitätsfärbung behandelt. Dies sind die Kontrollzellen ohne Dehnung, die mäßig gedehnten Zellen und die stark gedehnten Zellen.

Diese Abbildung zeigt die Freisetzung des LDH-Enzyms in das snat nach einer Dehnverletzung. Die ins Kulturmedium freigesetzte LDH-Menge wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der durch Dehnung verursachten Verletzung gemessen und als Prozentsatz der gesamten freisetzbaren L-D-H-L-DH, die aus Zellen freigesetzt wurde, die geringer oder mäßiger Dehnung ausgesetzt waren, angegeben. Die Unterschiede zwischen den gedehnten Proben und den ungedehnten Kontrollen sowie zwischen den beiden Dehnungsgruppen waren nicht signifikant.

Zellen, die stark gestreckt wurden, setzten eine signifikant größere Menge an LDH frei als alle anderen Proben, mit Ausnahme der mäßig gestreckten Probe nach einer Stunde nach ihrer Herstellung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg, um traumatische Hirnverletzungen in marinen zerebralen endothelialen Zellen in vitro zu untersuchen.