Name: Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als In Vitro Traumatische Hirnverletzung Modell der Blut-Hirn-Schranke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Stretchverletzung als In-vitro-Modell für traumatische Hirnverletzungen an mikrovaskulären Endothelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke und therapeutischer Ansätze.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) unter dem Förderkennzeichen FO 315/4- und der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. HEALTH-F2-2009-241778 unterstützt CF.

1. Seeding von Endothelzellen in Well Platten <ol><li> Kultivieren Mausgehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) in T75 Kulturflasche, Wechsel des Mediums (DMEM mit 10% FCS, 50 U / ml Penicillin / Streptomycin, 1% L-Glutamin) zweimal pro Woche, bis zum Erreichen der Konfluenz. (Für die Erzeugung und Immortalisierung Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen finden Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005, 21,19.). </li><li> Die Zellen werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und trypsinize die Zellen mit 2 ml warmem Trypsin-EDTA-Lösung. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 5 Minuten oder bis die Zelle Schicht dispergiert ist. </li><li> In 8 ml Kulturmedium in die Zellen. Tippen Sie auf den Kolben mehrmals, um die Zellen zu lösen. </li><li> Sehen Zellen unter dem Mikroskop, um eine vollständige Loslösung von Kolben zu gewährleisten. </li><li> Pipette Medium mit abgelösten Zellen nach oben und unten. Schwenken Sie die Flasche, um die Zelle Sus mischenauf. </li><li> Nehmen Sie 20 ul der Zellsuspension, legte in einem Hämocytometer und zählen Sie die Anzahl der Zellen. </li><li> Bestimmen Sie die Zelldichte und Saatgut 20.000 Zellen / cm 2 in den Brunnen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in collagen1 vorbeschichteten 6-well flexible Boden Kulturplatten (57,75 cm 2) in einem Gesamtvolumen von 3 ml / Vertiefung. Jedes der gut hat eine Fläche von 9,62 cm 2. </li><li> Wachsen die Zellen bei 37 ° C für eine Woche bis zur Konfluenz. Ändern Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche. </li></ol> 2. Zelldifferenzierung Vor Stretch-induzierte Verletzung <ol><li> Ändern des Kulturmedium der Zellen, die mit Differenzierungsmedium (DMEM mit 1% Serum-fetalem Kälberserum (ssFCS), 50 U / ml Penicillin / Streptomycin). </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 24 Stunden. </li></ol> 3. Stretch-induzierte Verletzung von Endothelzellen <ol><li> Schalten Sie das Gerät Zellverletzung Controller. </li><li> Stellen Sie die Verzögerung auf 50 ms. </li><li> Stellen Sie den Regler Druck bis 15 psi und drücken Sie den Auslöser ein paar Mal, bis der registrierten Druckspitzen stabil wird. </li><li> Stellen Sie den Regler auf den gewünschten Wert. Verwenden Sie Tabelle 1 als Leitfaden zur Erzeugung von verschiedenen Graden der Strecke Verletzungen. </li><li> Legen Sie die 6-well flexible Boden Kultur Platte (57,75 cm 2) in den Tablett-Halter. Stellen Sie sicher, dass das auch auf die richtige und Größe (dh große gut) gesetzt ist. </li><li> Setzen Sie den Adapter-Stecker fest auf den Brunnen. Halten Sie den Stecker fest in Stelle mit einer Hand, während die andere Hand drückt den Auslöser. </li><li> Notieren Sie sich die Druckspitzen erzeugt. </li><li> Sofort stellte den Teller zurück in die 37 ° C-Inkubator für die gewünschte Länge der Zeit, oder verwenden Sie sofort für nachfolgende Experimente oder Auswertung. </li></ol> 4. Beurteilung der Stretch Verletzung durch Farbstoffaufnahme Assay <ol><li> Unmittelbar nachdem die Zellen strgeätzt (Schritt 3.7), fügen Sie 30 ul einer 1 mg / ml Lösung der Lebensfähigkeit Fleck, dass die Handlungen als Marker Zytotoxizität (bitte sehen ergänzenden Tabelle von Materialien und Ausrüstung) zum Zellkulturmedium (Anmerkung: 10 ul der Farbstofflösung ist für jeden ml Zellkulturmedium verwendet werden). </li><li> Nach der Zugabe des Farbstoffs zu den Zellen unmittelbar unter einem Fluoreszenzmikroskop anzuzeigen. </li></ol> 5. Beurteilung der Stretch Verletzung von Lactatdehydrogenase (LDH) Veröffentlichungsdatum <ol><li> Unmittelbar nach dem Dehnen die Zellen (Schritt 3.7), entfernen Sie 200 ul Zellkulturmedium aus dem Brunnen. Machen Sie dasselbe für jeden Zeitpunkt nach der Verletzung, das Sie in Ihrer Untersuchung der LDH-Freisetzung umfassen würde (dh zB 30 min, 1 h, 2 h, etc.) </li><li> Zentrifuge das Zellkulturmedium bei der höchsten Einstellung von einer Mikrozentrifuge für 5 min auf eine beliebige Zelle Ablagerungen zu entfernen. Entfernen Sie den Überstand und nutzen diese für die nachfolgenden Schritte. </li><li> Sobald Sie have Schritt 5.1 abgeschlossen und haben die notwendigen Proben, die Sie gerne von den verschiedenen Zeitpunkten Sie gerne genauer untersuchen, lysieren die Zellen mit dem Lyse-Lösung in der LDH-Assay-Kit (siehe zusätzliche Tabelle der Werkstoffe und Ausrüstung) enthalten würde hätte. </li><li> Setzen Sie 100 ul der Assay-Medium im Assay kitto enthalten jede Vertiefung einer 96-Brunnen Platte im Kit enthalten. </li><li> Setzen 100 ul der zellfreien Kulturmedium in zwei parallele Vertiefungen einer 96-Vertiefungen Platte in dem Assay-Kit enthalten. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Die Absorption bei 492 nm auf. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Auswirkungen von mechanischen Verletzungen in vitro untersucht worden und Methoden festgelegt wurden für Astrozyten, Neuronen, Gliazellen und Endothelzellen 8, 9, 22. Es ist jedoch bisher noch keine in vitro-Modell der Strecke Verletzungen in kultivierten Endothelzellen des Gehirns bekannt. Cellular Modelle Trauma wertvolle Vorteile gegenüber Tiermodellen da die mechanische Umgebung der Zellen genau gesteuert werden 6. Daher ein in vitro-Modell für Trauma durch Stretch-Verletzungen mit kultivierten Endothelzellen Gehirnzellen, die als Modell der Blut-Hirn-Schranke (BHS), wie das, was unser Protokoll presents kann sich als nützlich erweisen. Dieses Protokoll nutzt CEND Zellen, eine etablierte BBB-Modell in unserem Labor. Seit BBB Aufschlüsselung wird oft in SHT-Patienten dokumentiert und TBI wird oft mit der Störung des BBB, die Ödembildung 23, 24 führen kann verknüpft, verschenkt den Verfahrentierte hier können speziell bei der Durchführung von Studien BBB in Bezug auf TBI verwendet werden. In diesem Modell ist es wichtig, dass, wie viel Grad der Strecke Schädigung der Zellen angelegt zu nehmen. Soweit die Zellen in jedem Fall und mit dem, was viel Druck angewendet werden verletzt unterscheiden der Grad der Schädigung, die Endothelzellen beeinflussen können sehr stark von anderen Zelltypen. Endothelzellen sind widerstandsfähiger gegen Verletzungen als Astrozyten oder gemischten Gliazellen 9 dehnen. Darüber hinaus sind sie schneller reparieren nach der Verletzung zu den anderen Zelltypen verglichen. Daher wird für die Endothelzellen des Gehirns, insbesondere Cend Zellen größere Menge an Dehnung Verletzungen erforderlich, um einen hohen Grad der Verletzung zu erzeugen. Man könnte den gewünschten Grad der Schädigung durch Anwenden der entsprechenden Druck in der Tabelle 1 angegeben zu erreichen. Für Cend Zellen, jedoch schwere Verletzungen bevorzugt aufgrund ihrer Resistenz gegen belasten. Die LDH-Assays durchgeführt wurden, zeigtendass der Grad der Dehnung erhöht, wird mehr LDH in den Überstand sezerniert werden. Im Gegensatz dazu erzeugt die Zellen, die eine geringe Menge der Ausdehnung Verletzung gegeben wurden LDH in einer Menge ähnlich zu Kontrollzellen. Wie im Protokoll erwähnt, muss man darauf achten, dass die geeignete Menge des Mediums, da eine Zunahme oder Abnahme in der Menge des Mediums zu Unterschieden in der Spitze ausgeübten Druck in die Vertiefungen führen wird. Zum Beispiel registriert eine Vertiefung mit 5 ml Flüssigkeit pro Spitzendruck im Durchschnitt von 4,0 psi, während eine leere Vertiefung registriert durchschnittlich 3,8 psi bei 45 psi Druck ausgeübt wird. Daher ist es am besten, die Auslöser mehrmals über ein Steuerelement auch drücken, um sicherzustellen, dass die Druckspitzen, die erzeugt werden, um die gewünschte Menge entspricht. In unseren Experimenten verwendeten wir eine Lebensfähigkeit Fleck, um die Wirkung der Ausdehnung der Permeabilität der Zellmembran zu bestimmen. Die Optik der flexible Boden Petrischalen wir verwendet ermöglicht es uns, view die gefärbten Zellen direkt unter dem Mikroskop. Allerdings, wenn man direkt nach dem Studium Immunomarkierung Stretch-Verletzungen führen will, kann Schwierigkeiten auftreten. Erstens kann die Größe und Dicke der Platte ein Problem mit einigen Mikroskop Aussichtsplattformen. Zweitens kann die Optik der flexiblen Membran der auch ein Hindernis für die Anzeige zu löschen. Trotz der genannten Beschränkungen, jedoch kann das beschriebene Verfahren als ein Modell der in vitro mechanische Schädigung der Blut-Hirn verwendet werden. Schädel-Hirn-Trauma (SHT) besteht aus zwei Komponenten, nämlich, Ischämie und Trauma. Ischämie kann als sekundäre Verletzungen nach TBI in Fällen, wenn es ernst Blutverlust was zu niedrigen Blutdruck oder als Folge der Schwellung des Gehirns beschränkt Sauerstoffversorgung des Gehirns auftreten. Es wird als ein verzögertes, nicht mechanische Schäden, die in Folge pathologischer Prozesse zum Zeitpunkt der Verletzung 25 eingeleitet betrachtet. Das Auftreten von Hypoxie einfter schweren Schädel-Hirn-Verletzungen üblich ist 26. Oxygen Glukose Deprivation (OGD) ist die Methode derzeit an Modell Ischämie in vitro verwendet. Somit kann Unterwerfen Zellen als ein sekundärer Insult zu den Zellen nach dem Strecken OGD imitieren die Inzidenz von TBI durch Ischämie gefolgt. Daher, um unsere aktuellen In-vitro-Modell zu verbessern TBI und Muster sie so nah wie möglich an einem tatsächlichen TBI, wie es in vivo auftritt, in der Zukunft werden wir beschäftigen auch OGD in Kombination mit Stretch-Verletzung.

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Über 10 Millionen Menschen werden jährlich von TBI so dass es ein großes gesundheitliches und medizinisches Problem 1 betroffen. Aus diesem Grund wurden verschiedene in-vivo-und in vitro-Modelle von TBI wurde gegründet und entwickelt, um ihre Mechanismen zu studieren 2,3,4. Ein besseres Verständnis der TBI kann dazu beitragen, stationäre Behandlung und eine Verringerung der Mortalität, Morbidität und Kosten. Viele Modelle für Hirn-Verletzungen, die sowohl in vivo und in-vitro-Methoden nutzen, existieren. In-vivo-Modellen konnte das eigentliche Ereignis von Kopfverletzungen zu imitieren. Aufgrund der Komplexität der in vivo Situation, Zugänglichkeit zum Gewebe von Interesse begrenzt wird 2. Für das Verständnis der physiologischen Reaktion von einzelnen Zellen als Folge der Verletzung zugefügt, ist es wichtig, dass die Zellen isoliert werden aus dem systemischen Auswirkungen, welchehemmen oder verändern ihre individuelle Reaktion 5. Aus diesem Grund bieten Zellmodellen Trauma wertvolle Vorteile gegenüber Tiermodellen da die mechanische Umgebung der Zellen genau gesteuert werden 6. In-vitro-Systemen, die die Verwendung der mechanischen Belastung, um Zellen oder Gewebe auf Änderungen durch ein solches Verfahren von Verletzungen induziert bestimmen beschäftigen entwickelt worden. Zum Beispiel ist ein Verfahren zur Untersuchung der Wirkung von mechanischen Schädigung Zellen Astrozyten, Neuronen, Glia-Zellen und Endothelzellen 7,8,9 worden. Die in-vitro-Trauma Modell für die Untersuchung von Nagetieren und menschlichen Astrozyten Reaktivität 10 beschäftigte Drucksteuerungsvorrichtung identisch zu dem, was wir für unser Modell etabliert. Die gleiche Methode wurde angewandt, um Verletzungen durch Stretch induzieren in Maus Hirnkapillarendothelzellen (bEnd3) 11 und kortikalen Neuronen 12,13 sowie, zerebrale endothElial Zellen von neugeborenen Ferkeln 14. Vorrichtung verformt den Boden der Kulturschale wodurch mechanische Dehnung Verletzung 10. Es fügt Verletzungsgefahr kultivierten Zellen durch die Anwendung der Luftdruck über den Zellen. Dieser Druck ausweichen kann die Membran auf dem die Zellen wachsen, wodurch Dehnung der Zellen. Verschiedene Grade der Dehnung (dh &quot;low&quot; mäßig &quot;oder&quot; schweren &quot;) kann durch Einstellen des Luftdrucks Pulsdauer und Intensität entsprechend erreicht werden. Diese Methode der Streck-induzierten Verletzung mit traumatischen Verletzung wurde in vivo 7 korreliert. Außerdem Dieses Verfahren Verletzungsgefahr ermöglicht die präzise Steuerung der extrazellulären Umgebung und können leicht reproduziert werden. Obwohl ein ähnlicher Ansatz wurde bei vielen anderen Zelltypen des Gehirns, einschließlich bEnd3 verwendet wurde, ist unser Modell von Vorteil, dass es nutzt die Mausgehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (Cend) erzeugtin unserem Labor. Diese Zelllinie ist ein gut geeignetes Modell der Blut-Hirn-Schranke (BHS). In-vitro-Zellkulturen als Modelle verwendet werden, sollten BBB Eigenschaften, die es ihnen ermöglichen, als Bildschirm dienen Durchlässigkeit besitzen würde. Ein wichtiges Kriterium für eine in vitro Zell-Modell um ein Prädiktor für BBB Permeabilität ist, dass es besitzen sollte physiologisch realistischen Zellarchitektur 15. Obwohl bEnd3 Zellen zeigen charakteristische spindelförmige Morphologie Plattenepithelkarzinom in Kultur 16, zeigen sie unregelmäßig morphogenetic Verhalten in vitro, wobei sie Zysten-Hohlräume anstatt der regulären röhrenförmige Strukturen in Fibringele 17 zu bilden. Darüber hinaus, wenn die Zellen in embryonale und neugeborenen Mäusen injiziert wurden, induziert sie schnell wachsenden Tumoren tödlich embryonalen Mäusen, aber nicht in Neugeborenen und jungen Mäusen. Es wird daher vorgeschlagen, dass ein oder mehrere Prozesse, die die normalen endothelialen Wachstumsfaktor, Migration und Differenzierung verändert wurden oder eliminierted in dieser Zelllinie 18. Auf der anderen Seite zeigen morphologische, immunozytochemische Auswertung von Endothelzellen und BBB Markerexpression, bioelektrischen und parazellulären Flussmessungen dass unser Modell BBB Cend tatsächlich ein geeignetes Modell der BBB 19. Gehirn-Endothel in vivo wird durch einen extrem engen Permeabilität mit trans-endothelialen elektrischen Widerstand (TEER) im Bereich von 2.000-5.000 Qcm 2 gekennzeichnet. Für Untersuchungen des Gehirns Mikrovaskulatur Barriereeigenschaften gegenüber Arzneimitteln, sollte parazellulären Restriktivität und Dichtheit der Zellen berücksichtigt werden. In den meisten Hirn-Endothelzellen (BCEC), wird dies nicht als die Zellen zeigen TEER Bereich 50-100 Qcm 2 20 erhalten. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinie Hirnendothelzellen bEnd3 erzeugt TEER-Werte von nicht mehr als 60 Qcm 2 15. Im Gegensatz Differenzierung CEND Zellen mit Medium, das Serum reduziert AnzeigeTEER-Werte im Bereich von 300 bis 500 Qcm 2 19,21. Bis heute, in-vitro-Modellen der Strecke Verletzungen in kultivierten Endothelzellen des Gehirns sind rar. Daher kann ein in vitro-Modell für Trauma durch Stretch-Verletzungen mit kultivierten Endothelzellen des Gehirns, die als Modell der BBB wirken sich als nützlich erweisen. In diesem Protokoll, präsentieren wir ein in vitro-Modell, dass die tatsächlichen Auswirkungen, die Gehirnzellen, insbesondere Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen der BBB, während TBI erhalten nachahmen könnte. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass die Höhe der Schädigung der Zellen sowie die extrazelluläre Umgebung leicht in präziser Weise ermöglicht eine einfache Reproduzierbarkeit der Versuchsanordnung gesteuert werden angewendet.

<table><tbody><tr><td>Cell Injury Controller II</td><td>kundenspezifisches Design und Fertigung, Virginia, USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioflex Kulturplatte - Kollagen Typ I</td><td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td><td>BF - 3001C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15110-1333</td><td>Endkonzentration 10%, hitzeinaktiviert (30 min bei 56 &deg; C)</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Biochrom AG</td><td>K0282</td><td>Lagerung: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>MEM Vitamin</td><td>Biochrom AG</td><td>K0373</td><td>Lagerung: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>Na-Pyruvat</td><td>Biochrom AG</td><td>L0473</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td>Lagerung bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A2212</td><td>Lagerung: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum, Holzkohle abgestreift (ssFCS)</td><td>Life Technologies</td><td>12676-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>PAA Laboratories</td><td>L11-004</td><td>Lagerung: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>Image-iT DEAD Green</td><td>Life Technologies</td><td>I10291</td><td>Lagerung: &le; -15 &deg; C, geschützt vor Licht</td></tr><tr><td>Zytotoxizitätsnachweis Kit PLUS (LDH)</td><td>Roche</td><td>4744926001</td><td>Lagerung: &le; -15 &deg; C</td></tr></tbody></table>

stretchlimousine in gehirn mikrovaskulären endothelzellen (cend) als<em&gt; in vitro</em&gt; traumatische hirnverletzung modell der blut-hirn-schranke

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Aufgrund der hohen Sterblichkeit Vorfall etwa von Schädel-Hirn-Trauma (SHT), Methoden, mit denen ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen daran beteiligt wäre gebracht sind nützlich für die Behandlung. Es gibt sowohl in vivo und in-vitro-Methoden für diesen Zweck. In-vivo-Modellen können tatsächliche Kopfverletzung zu imitieren, wie es während TBI auftritt. Allerdings kann in vivo Techniken nicht für ein Studium an der Zellphysiologie Ebene genutzt werden. Daher wird in vitro Methoden sind vorteilhaft für diesen Zweck, da sie leichter Zugang zu den Zellen und die extrazelluläre Umgebung zur Manipulation bieten. Unser Protokoll stellt ein in vitro-Modell der TBI mit Stretch-Verletzung im Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen. Es nutzt Druck auf die Zellen in flexible Boden Vertiefungen kultiviert. Der ausgeübte Druck kann leicht kontrolliert werden kann und Verletzungen, die von niedrig bis schweren Bereich zu produzieren. Das murineGehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (Cend) im Labor erzeugt wird, ein gut geeignetes Modell für die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​wodurch ein Vorteil gegenüber anderen Systemen, die eine ähnliche Technik einzusetzen. Darüber hinaus ist aufgrund der Einfachheit des Verfahrens sind Versuchsanordnungen leicht dupliziert. Somit kann das Modell bei der Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen in TBI am BBB beteiligt sind, verwendet werden.

Zellen auf Kollagen kultiviert Ich angeschwemmt 6-well flexible Boden Kultur Platten (57,75 cm 2) wurden in verschiedenen Graden der Strecke Verletzungen mit der Zelle Bahre Gerät unterzogen. Nach Aussetzen der Zellen Verletzungen, wurden sie unter dem Mikroskop für die Auswirkungen der Stretch-induzierte Verletzung Zellmorphologie untersucht. Es wurde beobachtet, dass stärkere Dehnung der Zellen eine stärkere Zelle Verzerrung ebenfalls beobachtet (Abbildung 1) wurde angelegt. Wie in 1A gezeigt, erscheinen Kontrollzellen, die nicht zu Verletzungen ausgesetzt waren als regelmäßig geformte zerebrovaskuläre Endothelzellen (CEND) ohne Angabe von Zellschwellung oder Verzerrung. Wenn stretch Verletzungen angewendet wurde (1B-D), könnte Verformung unter dem Lichtmikroskop beobachtet werden. Nach dem Dehnen die Zellen stark mit einem Spitzenwert Druck zwischen 3,5-4,5 psi erschienen die CEND Zellen deutlich zurückgezogen, geschwollen und deformiert mit nicht<html> Lage Interzellularräume. Zusätzlich Aufnahme der Lebensfähigkeit Fleck (100 nM Endkonzentration) als der Grad der Dehnung Verletzung erhöht (Abbildung 2) erhöht. Die Lebensfähigkeit Fleck einen Farbstoff impermeant, gesunde Zellen, die permeierenden wenn die Plasmamembran Integrität der Zellen beeinträchtigt wird wird. Der Farbstoff wurde von den meisten der Kontrollzellen ausgeschlossen, daher nur einige der Zellen gefärbt wurden (2A), um gestreckte Zellen (2B-D) verglichen. Mehr Zellen fluoreszieren grün mit einem erhöhten Grad der Strecke Verletzungen. Als biochemische Marker der Schädigung, die Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase (LDH) Enzym wurde auch nach den Anweisungen des Herstellers untersucht. Abbildung 3 zeigt, dass eine wachsende Zelle Stretch Verletzungen erhöht LDH-Freisetzung verursacht. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Abbildung 1. Lichtmikroskopie Prüfung der normalen vs verletzten Zellen. (A) Normale ungedehnt konfluenten Zellrasen istightly verpackt und verlängert. Wenn Zellen durch Anlegen einer Spitze Druckimpuls 1,8-2,0 psi (dh geringe Dehnung) scheinen sie weniger kompakt gedehnt wurden, angezeigt durch Pfeile Bereiche (B). Wenn die Zellen wurden mit einer mäßig 2,5-3,0 Peak Druckimpuls verletzt erschienen einige von ihnen geschwollen und deformiert (C). Die Zellen werden mit schweren zurückgezogenen Strecke von 3,5-4,5 psi, wie durch den Pfeil (D) gezeigt. 100-facher Vergrößerung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Abbildung 2. Fluorescence mikroskopische Untersuchung von normalen Zellen vs verletzten Zellen mit Lebensfähigkeit Fleck 2h nach der Verletzung behandelt A: Kontrolle ungedehnten Zellen BD: gestreckten Zellen (B - niedrig, C - moderate, D - schwer).... 100-facher Vergrößerung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Abbildung 3. Lactat-Dehydrogenase (LDH) Enzymfreisetzung in den Überstand nach Strecke Verletzungen. Freigesetzte LDH in das Kulturmedium wurde in verschiedenen Zeitabständen nach Strecke induzierte Verletzung gemessen. LDH wurde als Prozent der gesamten lösbaren LDH (LDH in Medien sowie Zellen) ausgedrückt. Die Werte sind ± SEM. Die n für jeden Zeitpunkt 5 ist, mit Ausnahme des 0 v hrert schwere Strecke, wo n = 3 unterzogen. LDH-Freisetzung aus den Zellen, die zu niedrigen und mittleren Strecke ausgesetzt waren nicht signifikant von der ungedehnten Kontrollen und voneinander. Zellen, die stark gedehnt wurden veröffentlicht eine deutlich größere Menge an LDH zu allen anderen Proben, mit Ausnahme der mäßig gestreckt Probe 1 h verglichen. (P &lt;0.05, Eine ANOVA, Holm-Sidak Methode). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . Tabelle 1. Leitfaden zur Erzeugung von verschiedenen Graden der Strecke Verletzungen. <table border="1"><tbody><tr><th> Regulator Druck </th><th> Spitzendruck </th><th> Grad der Verletzung </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1,2-1,5 psi </td><td> &lt;Niedrig </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1,8-2,0 psi </td><td> Niedrig </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2,5-3,0 psi </td><td> Moderat </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3,5-4,5 psi </td><td> Schwer </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8 bis 6,0 psi </td><td> &gt; Schwere </td></tr></tbody></table>

In-vitro-Schädel-Hirn-Verletzungen Modelle werden entwickelt, um in vivo Gehirn Verformung reproduzieren. Stretch-induzierte Schädigung für Astrozyten, Neuronen, Gliazellen, Aorten-und Endothelzellen des Gehirns eingesetzt. Allerdings nutzt unser System eine Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Modell, das Eigenschaften ein zulässiger BBB-Modell ein in vitro-Modell herzustellen TBI besitzt.

Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatische Hirnverletzung Modell der Blut-Hirn-Schranke

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anwendung einer Dehnverletzung als Modell für eine traumatische Hirnverletzung zu demonstrieren. Dies wird zunächst durch die Kultivierung von mikrovaskulären endothelialen Zellen in flexiblen Bodenmulden erreicht, die eine Spiegelung ermöglichen. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen durch Verringerung des Fötales-Rinderserum-Anteils im Kulturmedium zu differenzieren.Anschließend werden die Zellen mithilfe der Zelldehnvorrichtung verletzt. Der letzte Schritt besteht in der Beurteilung des Ausmaßes der Zellschädigung. Letztendlich wird die durch Dehnung verursachte Schädigung von Gehirnendothelzellen verwendet, um die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke in vitro darzustellen.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von traumatischen Hirnverletzungen, da sie den tatsächlichen Einfluss modelliert, der während einer traumatischen Hirnverletzung (TBI) an der Blut-Hirn-Schranke auftritt, mithilfe einer Dehnverletzung von marinen Hirnendothelzellen. Die Durchführung der Prozedur wird Dr. Elaine Salvador, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie diese Prozedur, indem Sie die marinen mikrovaskulären Hirnendothelzellen in einem T-75-Kulturfläschchen kultivieren.Ersetzen Sie das Medium zweimal wöchentlich, bis die Konfluenz erreicht ist. Waschen Sie die Zellen danach mit PBS. Entfernen Sie anschließend den PBS und tryps. Versetzen Sie die Zellen mit zwei Millilitern warmer Trypsin-EDTA-Lösung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten oder bis die Zellschicht aufgelöst ist. Danach fügen Sie acht Milliliter Kulturmedium zu den Zellen hinzu und klopfen Sie mehrmals leicht auf das Kolben, um die Zellen zu lösen.Unter dem Mikroskop die Zellen überprüfen, um sicherzustellen, dass sie vollständig vom Kolben abgelöst sind. Anschließend das Medium mit den abgelösten Zellen mehrmals auf- und abpipettieren. Danach den Kolben vorsichtig schwenken, um die Zellsuspension zu homogenisieren.Gebe 20 Mikroliter der Zellsuspension in ein Hämozytometer und zähle die Anzahl der Zellen. Bestimme die Zelldichte und sähe 20.000 Zellen pro Quadratzentimeter in die Vertiefung ein. Übertrage anschließend die Zellsuspension in Kollagen.Eine vorkodierte Sechsfachplatte mit flexiblen Böden und einer Gesamtvolumenkapazität von drei Millilitern pro Vertiefung. Erneuern Sie das Kulturmedium zweimal wöchentlich und kultivieren Sie die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius, bis sie konfluent sind.Für die Zell-Differenzierung wechseln Sie das Kulturmedium der Zellen durch Differenzierungsmedium und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie in diesem Verfahren das Zellschädigungs-Regelgerät ein und stellen Sie die Verzögerung auf 50 Millisekunden ein. Stellen Sie anschließend den Reglerdruck auf 15 PSI ein und betätigen Sie den Auslöser mehrmals, bis der gemessene Spitzendruck stabil ist.Danach die Reglerdruck auf den gewünschten Wert einstellen. Anschließend die Kulturplatte mit sechs flexiblen Bodenmulden in den Plattenträger stellen. Sicherstellen, dass der Muldenwähler auf die korrekte Muldengröße eingestellt ist.Danach den Adapterstecker fest aufsetzen, wobei der Stecker mit einer Hand festgehalten wird, während mit der anderen Hand der Auslöser betätigt wird, um den danach erzeugten Spitzenwert des Drucks aufzuzeichnen. Die Platte unverzüglich wieder in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator für die gewünschte Dauer zurückstellen oder sofort für nachfolgende Experimente oder die Auswertung verwenden, um die Dehnverletzung mittels DI-Aufnahmetest zu bewerten. Unmittelbar nach der Dehnung der Zellen 30 µL einer Ein-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung des Vitalitätsfarbstoffs, der als Zytotoxizitätsmarker im Zellkulturmedium wirkt, hinzufügen.Um die Dehnungsverletzung anhand der Freisetzung von Lactatdehydrogenase zu bewerten. Unmittelbar nach der Dehnung entnehmen Sie 200 Mikroliter Zellkulturmedium aus dem Ansatz und verfahren ebenso mit jedem gewünschten Zeitpunkt nach der Verletzung, den Sie in Ihre Untersuchung der LDH-Freisetzung einbeziehen möchten. Anschließend zentrifugieren Sie das Zellkulturmedium fünf Minuten lang bei der höchsten Einstellung eines Mikrozentrifugens.Um Zelltrümmer zu entfernen, entfernen Sie das Überstand und verwenden Sie ihn für die nachfolgenden Schritte. Sobald die erforderlichen Proben aus verschiedenen Zeitpunkten entnommen wurden, lysieren Sie die Zellen mithilfe der im LDH-Assay-Kit enthaltenen Lysepufferlösung. Danach geben Sie 100 Mikroliter des im Assay-Kit enthaltenen Assay-Mediums in jedes Brunnen einer im Kit bereitgestellten 96-Loch-Platte. Anschießend 100 Mikroliter des zellfreien Zellkulturmediums in zwei parallele Vertiefungen der 96-Loch-Platte geben, die Platte 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Extinktion bei 492 Nanometern messen. Gezeigt ist hier die lichtmikroskopische Untersuchung von normalen im Vergleich zu geschädigten Zellen.Die normale, ungedehnte Zellmonolayer ist dicht gepackt und die Zellen sind langgestreckt. Wenn eine Spitzen-Druckpuls von 1,8 bis 2,0 PSI angelegt wird, erscheinen die Zellen weniger kompakt. Bei moderater Verletzung durch einen Spitzen-Druckpuls von 2,5 bis 3,0 erscheinen einige Zellen geschwollen und deformiert. Bei starker Dehnung von 3,5 bis 4,5 PSI ziehen sich die Zellen zurück.Hier ist die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von normalen im Vergleich zu verletzten Zellen. Die Zellen wurden zwei Stunden nach der Verletzung mit einer Vitalitätsfärbung behandelt. Dies sind die Kontrollzellen ohne Dehnung, die mäßig gedehnten Zellen und die stark gedehnten Zellen.Diese Abbildung zeigt die Freisetzung des LDH-Enzyms in das snat nach einer Dehnverletzung. Die ins Kulturmedium freigesetzte LDH-Menge wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der durch Dehnung verursachten Verletzung gemessen und als Prozentsatz der gesamten freisetzbaren L-D-H-L-DH, die aus Zellen freigesetzt wurde, die geringer oder mäßiger Dehnung ausgesetzt waren, angegeben. Die Unterschiede zwischen den gedehnten Proben und den ungedehnten Kontrollen sowie zwischen den beiden Dehnungsgruppen waren nicht signifikant.Zellen, die stark gestreckt wurden, setzten eine signifikant größere Menge an LDH frei als alle anderen Proben, mit Ausnahme der mäßig gestreckten Probe nach einer Stunde nach ihrer Herstellung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg, um traumatische Hirnverletzungen in marinen zerebralen endothelialen Zellen in vitro zu untersuchen.

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Medicine

Medizin

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Einrichtung von Menschenmodelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​kann die Forschung in Gehirn Bedingungen mit BBB Versagen profitieren. Wir beschreiben hier ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Kontakt BBB Modell, das Co-Kultur von Astrozyten und menschlichen Endothelzellen des Gehirns auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran erlaubt.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns sind durch spezifische Verbindungsproteine miteinander verbunden, die eine hochregulierte Barriere zwischen Blut und dem Zentralnervensystem (ZNS) bilden, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen des murinen Gehirns, wie in diesem Protokoll beschrieben, ermöglicht detaillierte in vitro-Studien der BHS.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hoch reproduzierbare Technik für in Vivo Beurteilung der Blut - Hirn-Schranke Störung in Ratte-Modelle des ischämischen Schlaganfalls liefern.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Drug targeting zu Tumoren des zentralen Nervensystems ist eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um eine in-vitro-Mimik der Blut-Hirn-Tumor-Schranke mit murinen und/oder menschlichen Zellen zu produzieren und ihre Relevanz für die Vorhersagbarkeit des zentralen Nervensystems Tumor targeting in vivo zu diskutieren.

Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale

Die menschliche Blut-Hirn-Schranke verhindert selektiv das Eindringen hydrophiler Moleküle und Krankheitserreger in das Gehirn. Mehrere Pathologien, einschließlich Meningitis und postoperatives Delirium, sind mit einer erhöhten Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke verbunden. Hier beschreiben wir ein Endothelzellkulturmodell, um die Barrieredurchlässigkeit durch mikrobielle Traversal zu testen.

Analyse der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Barriere durch mikrobielle Traversale durch mikrovaskuläre Endothelzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Methode zur Ableitung, Erweiterung und Kryokonservierung mikrovaskulärer Endothelzellen des Gehirns, die durch Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, und zur Untersuchung der Eigenschaften der Bluthirnschranke in einem Ex-vivo-Modell.

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Es wurde eine Methode entwickelt, um die Farbstoffextravasation aufgrund des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke (BHS) sichtbar zu machen, indem Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten zwei Fluoreszenzfarbstoffe verabreicht wurden. Die Verwendung von Glycerin als Kryoprotektivum erleichterte die Immunhistochemie an derselben Probe.

Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Erfahren Sie die Stretchverletzung als In-vitro-Modell für traumatische Hirnverletzungen an mikrovaskulären Endothelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke und therapeutischer Ansätze.

Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als In Vitro Traumatische Hirnverletzung Modell der Blut-Hirn-Schranke (Video) | JoVE Journal

Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als

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