Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Zellen und epitheliale Zellen aus dem menschlichen Thymus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem das präparierte Gewebe zunächst durch mechanische Dissoziation fragmentiert wird. Anschließend werden die Gewebefragmente enzymatisch weiterverdaut, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.

Schließlich wird die Zellsuspension durch Percoll-Gradientenzentrifugation für den niedrigdichten Zellanteil angereichert. Letztendlich können die dendritischen und epithelialen Zellen aus diesem Anteil durch magnetische oder FACS-gestützte Sortierung oder eine Kombination beider Methoden isoliert werden. Die hier vorgestellte Methode bietet ein effizientes, reproduzierbares und kostengünstiges Verfahren zur erfolgreichen Isolierung und anschließenden Untersuchung seltener Zellpopulationen wie dendritischer Zellen und thymischer epithelialer Zellen, die im menschlichen Thymus vorkommen.

Ich, I rotta, ein Doktorand aus unserem Labor, werde Ihnen den Vorgang demonstrieren. Beginnen Sie damit, das Thymusgewebe in eine Petrischale mit steriler PBS bei Raumtemperatur zu geben und spülen Sie restliches Blut ab. Geben Sie anschließend frische PBS in die Petrischale und entfernen Sie mit Pinzette und Schere Blutgerinnsel, Bindegewebe und Fettgewebe sowie alle Teile des Gewebes, die nicht gesund erscheinen.

Nachdem das Thymusgewebe gereinigt ist, wiegen Sie es zur Referenz und schneiden es dann in gleichmäßige Stücke von einem Kubikzentimeter Größe. Bedecken Sie die Stücke nun mit PBS und stellen Sie sie auf Eis. Anschließend verwenden Sie den Kolbenstößel einer sterilen 10- bis 20-Milliliter-Spritze, um sanften Druck auf das Gewebe auszuüben, um den Großteil der Thymozyten zu entfernen und das Gesamtvolumen des zu verdauenden Gewebes zu verringern.

Die Lösung wird sichtbar trüb. Während die Thymozyten freigesetzt werden, das Gefäß vorsichtig umrühren und dann einen Glas-Aspirator verwenden, um den überstehenden Überstand, der Thymus enthält, abzusaugen, wobei darauf geachtet werden muss, die Gewebestücke nicht versehentlich abzusaugen. Es kann hilfreich sein, einen sterilen Zellkultur-Abstreifer zu verwenden, um alle Gewebestücke auf eine Seite des Gefäßes zu sammeln, das Gefäß dann um 45 Grad zu kippen und den verbleibenden Überstand abzusaugen.

Spülen Sie die Schale mit frischem PBS und sammeln Sie weiterhin das Überstand bis das PBS relativ durchsichtig ist. Führen Sie eine abschließende Spülung mit RPMI durch und zerkleinern Sie dann das Gewebematerial mit einer scharfen Schere so fein wie möglich, mindestens so klein, dass es in eine Fünf-Milliliter-Pipette passt, um dendritische Zellen oder dc zu isolieren. Geben Sie zunächst bis zu 10 Gramm Gewebestücke in 50-Milliliter-Röhrchen mit jeweils 10 Milliliter Kollagenase-DNA-Lösung und 10 Milliliter RPMI pro fünf Gramm Gewebe.

Anschließend die Gewebesuspension 40 Minuten lang unter langsamer Rotation in einem thermostatischen Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Enzymlösung wird trüb, da Zellen in diese freigesetzt werden. Am Ende der Verdauung die Zellsuspension zwei Minuten bei 110 ×g und Raumtemperatur zentrifugieren, um die Gewebefragmente zu sedimentieren, das Überstand aufsammeln und dann die Zellsuspension pelletieren.

Verwerfen Sie diesmal den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 bis 50 Milliliter vollständigem RPMI. Bestimmen Sie je nach Größe des Pellets die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Ausschluss mit Trypanblau und stellen Sie die Zellsuspension anschließend bei 37 Grad Celsius mit lockerem Deckel zur Isolierung der thymischen epithelialen Zellen oder t. Als Nächstes resuspendieren Sie die Gewebereste in 10 Milliliter frischer Kollagenase-DNA-Lösung sowie 10 Milliliter RPMI und Trypsin-EDTA.

Digestieren Sie die Gewebefragmente weitere 40 Minuten bei 37 Grad Celsius mit sanfter Rotation. In den letzten 10 bis 15 Minuten der Inkubation fötale Kälberserum im Verhältnis 1:5 hinzufügen, um die Trypsinwirkung zu neutralisieren. Nach dem Pellettieren der Gewebefragmente das Überstand sammeln und die Zellsuspension erneut zentrifugieren.

Aspirieren und verwerfen Sie dieses Mal vorsichtig den Überstand, wobei Sie das lockere Pellet schonen müssen. Nach der Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen stellen Sie diese Zellsuspension ebenfalls bei 37 Grad Celsius bereit. Um den Fraktion mit geringer Dichte oder LDF-Zellen anzureichern, pelletieren Sie zunächst die zuvor für die DC- und Tech-Anreicherung beiseitegestellten Zellsuspensionen, während die Zellen abschleudern.

Stellen Sie einen Dichtegradienten mit 1,07 Gramm pro Milliliter Percol-Dichte her. Wie in dieser Tabelle angegeben, resuspendieren Sie beide Pellets mit jeweils 1 × 10⁹ Zellen in sechs Milliliter der vorbereiteten Percol-Lösung. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich, um eine homogene Verteilung zu erzielen, und überführen Sie anschließend die Lösungen in 50-Milliliter-Oakridge-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit Schraubverschluss.

Als Nächstes geben Sie mit einer Pipette langsam 30 Milliliter komplettes RPMI pro Röhrchen vorsichtig auf die Percoll-Zellsuspension. Achten Sie darauf, dass die Schichten sich nicht vermischen, und überführen Sie die Röhrchen vorsichtig in eine vorgekühlte Zentrifuge mit festem Winkelrotor, um die Zellen 35 Minuten lang zu separieren. Danach überführen Sie mit sterilen Pasteurpipetten vorsichtig die angereicherten Fraktionen der Zellen mit geringer Dichte von der Grenzfläche zwischen Percoll und Medium in 50-Milliliter-Röhrchen, die kaltes komplettes RPMI enthalten.

Danach fülle ich die Röhrchen mit zusätzlichen vollständigen RPMI auf, um die verbleibende Konzentration pro Zelle zu verdünnen. Schließlich wasche ich die angereicherten Zellen zweimal mit unvollständigem RPMI, resuspendiere das Pellet in frischem Medium und bestimme die Anzahl der vitalen Zellen. In dieser ersten Abbildung ist ein ziemlich großes, neun Zentimeter langes Gewebestück, das von einem sechsjährigen Kind stammt, wie gerade gezeigt wurde, dargestellt.

Ein wichtiger erster Schritt besteht darin, das Gewebe von unerwünschten Bestandteilen zu reinigen. Wie durch die weißen Pfeile angezeigt, wurde anschließend eine Einzelzell-Suspension aus Thymusgewebe gewonnen und für Zellen der Fraktion mit geringer Dichte angereichert. Während eine typische Einzelzell-Suspension nach Dichtegradiententrennung etwa 3 % H-L-A-D-R-positiver Zellen enthält, steigt dieser Prozentsatz bei den größeren Zellen auf 15 bis 40 % an.

Fraktion mit geringer Dichte in der Fraktion mit hoher Dichte, die hauptsächlich aus uniformen, klein dimensionierten Thymozyten besteht. Derartige Zellen sind praktisch nicht vorhanden. Thymisch.

Myeloische dendritische Zellen können anhand der Expression einer Reihe von Oberflächenmarkern identifiziert werden, darunter CD11c. Diese Abbildung zeigt die effiziente Isolierung von CD11c-positiven Zellen mittels eines modifizierten magnetischen Zellseparationsprotokolls nach der Isolierung. Die Reinheit der CD11c-positiven DC betrug 93 %, wie durch Immunfärbung der isolierten Zellen bestimmt wurde. Im Durchschnitt liegt die Ausbeute an isolierten CD11c-positiven Zellen bei fünf mal 10 hoch fünf bis fünf mal 10 hoch sechs myeloischen dendritischen Zellen pro 10 hoch neun gesamten thymischen Zellen.

In dieser Tabelle sind repräsentative Daten aus mehreren einzelnen Thymusproben unterschiedlichen Alters und Gewichts dargestellt, mit einer Bandbreite an eingesetzten Einzelzell-Suspensionen sowie Gesamtzahlen an Zellen der niedrigen Dichte-Fraktion und der anschließenden Ausbeute und Reinheit an CD11c-positiven Zellen, und zwar ausschließlich in der auf antigenpräsentierende Zellen angereicherten Fraktion. Etwa 0,5 % der Zellen sind CD45low EPCA-positive oder CD45-negative EPAM-positive kortikale epitheliale Zellen, und medulläre epitheliale Zellen können aus den durch Trypsin behandelten, CD45low/negativen, angereicherten Stromazellen als EPAMlow CD2-positive beziehungsweise EPAMhigh CD2-negative Populationen sortiert werden. Die Isolierung von dendritischen Zellen und Subpopulationen thymischer epithelialer Zellen aus menschlichem Thymus.

Es ist zeitkritisch. Je schneller das Ultraschallbehandlungsverfahren durchgeführt wird, desto besser ist der Zustand der Zellen. Sobald dieses Protokoll beherrscht ist, können dendritische Zellen innerhalb von fünf bis sechs Stunden und thymische epitheliale Zellen innerhalb von acht bis zehn Stunden isoliert werden.

Nachdem Sie sich heute dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie humanes Thymusgewebe behandelt werden muss, um dendritische Zellen und thymische epitheliale Zellen erfolgreich zu isolieren. Die isolierten Zellen können anschließend in vielen verschiedenen nachgeschalteten Anwendungen für weitere Untersuchungen verwendet werden, um die Zellen besser zu charakterisieren und ihre Biologie besser zu verstehen.