Name: Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Lernen Sie die Isolierung myeloider dendritischer Zellen und thymischer Epithelzellen aus menschlichem Thymusgewebe. Diese effiziente Methode nutzt mechanische Disruption, enzymatische Verdauung und Dichtegradientenzentrifugation.

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Wir sind dankbar, dass die Chirurgen der Klinik für Thorax-und Kardiovaskuläre Chirurgie, Universitätsklinik Tübingen für die Bereitstellung der Proben Thymus und Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Deutschland) für die Bereitstellung der CDR2-Antikörper. Wir möchten auch an Hans-Jörg Bühring und Sabrina Grimm von der Sortieranlage (Universität Tübingen) danken. Diese Arbeit wurde durch den SFB 685 und der Hertie-Stiftung unterstützt.

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<li>Schmitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+of+human+thymic+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets.</a> Immunobiology. 212, 167-177 (2007).</li>
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<li>Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+MHC-peptide+matrix+of+central+tolerance+in+the+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus.</a> Nature Communications. , (2013).</li>
</ol>

Kein Interessenkonflikt erklärt.

Das hier beschriebene Protokoll ist eine Modifikation des Protokolls durch Gotters et al 4 veröffentlicht. Kritischen Schritte in dem Protokoll sind der Zustand und die ursprüngliche Herstellung des Gewebes sowie der Percoll-Dichte-Trennung. Wir empfehlen dringend, das Gewebe so bald wie möglich nach der Entnahme zu verarbeiten. Es ist wichtig, schnell, aber gründlich zu arbeiten, wenn die Reinigung und das Schneiden des Gewebes. Während der in Schritt 2.3 beschrieben thymocyte waschen, ist es entsch...

Der Thymus ist das Organ, in dem T-Zell-Entwicklung auftritt. Seine relative und absolute Größe mit dem Alter abnimmt, wenn sie teil sukzessive durch Fett ersetzt, obwohl Thymusaktivität noch im Alter festgestellt werden. Seine Bedeutung für die Immunantwort wurde in den frühen 1960er Jahren ein demonstriert. Die T-Zell-Repertoire ist durch die Wechselwirkung der T-Zell-Rezeptoren, die mit Peptid-MHC-Komplexe auf unterschiedliche Arten von Thymus-APC, die das Überleben oder Tod Signale zu entwickelnden T-Zellen, was zu einer funktionellen und weitgehend selbst tolerant T-Zell-Repertoire 2 vorzusehen geformt. Etwa 98% der Zellen im menschlichen Thymus-T-Zellen entwickeln sich als Thymozyten bezeichnet. Die restlichen 2% bestehen aus einer Reihe von verschiedenen Zelltypen, einschließlich einer Vielzahl von TEC (kortikalen Mark, subkapsuläre), myeloide und plasmazytoiden DC (MDC, PDC), Makrophagen, B-Zellen reifen Umlauf-T-Zellen, Granulozyten, fibroblasts, Endothelzellen und Epithelzellen seltenen Zellen mit einem Expressions Phänotyp ähnlich derjenigen Zellen aus anderen Geweben, wie Muskel, Nervenzellen und respiratorischen Epithels (Abbildung 1). Davon TEC und DC sind die wichtigsten Arten von APC in einem normalen Thymus gefunden. In den letzten Jahren ist die Reinigung dieser APC-Typen für Kultur und molekularen Charakterisierung mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz, Isolierung jeder dieser Zelltypen für eine detaillierte Analyse erfordert eine effiziente, reproduzierbare und kostengünstiges Verfahren. Die hier vorgestellte Methode ist eine Modifikation von bisher veröffentlichten Studien 3,4. Wie bei jedem anderen Gewebe können Zellgewinnung aus dem Thymus von enzymatisch Disaggregation der Zell-Zell-und Zell-Matrix-Interaktionsnetzwerke, um eine Suspension von Einzelzellen zu erhalten, erreicht werden. Es gibt bestimmte Parameter, wie gut Dissoziation Effizienz, Zellausbeute, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Aufrechterhaltung des Zell surface Marker, die von entscheidender Bedeutung sind, und müssen für die erfolgreiche Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen optimiert werden. In diesem Protokoll wird Trennung von DC und TEC Teilmengen, indem eine Einzelzell-Suspension aus dem Gewebe durch mechanische Zerstörung und enzymatischen Verdau durchgeführt. Wir verwenden Collagenase aus Clostridium histolyticum A, die ein ausgewogenes Verhältnis von verschiedenen Enzymaktivitäten hat, um die native Kollagen, die das Gewebe zusammenhält brechen. DNase I in der Enzymlösung enthalten, um die Zellaggregation durch freie DNA von toten Zellen zu reduzieren (Thymozyten sind sehr empfindlich). Wir bieten auch einen alternativen Ansatz zu den typischen enzymatische Verdauung Gewebe mit mechanischen und enzymatischen Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator unterstützt. Die Einzelzellsuspension wird dann in einer einzigen Percoll-Dichte-Zentrifugation zur Anreicherung der Fraktion mit niedriger Dichte (LDF) von Zellen unterzogen. Von diesem Teil der Zellen kann durch Färbung DC f isoliert werdenoder DC-Oberflächenmarker (dh CD11c +) und unter Verwendung magnetische Trennung oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Im Gegensatz zu den lymphoiden Zellen, die große Mehrheit der Zellen in der Thymusdrüse, nicht TEC nicht exprimieren CD45 auf hohem Niveau, jedoch sind positiv für das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM. cTEC aus Mark TEC durch den Ausdruck eines noch nicht definierten Antigen durch die CDR-2 (kortikale dendritischen Retikulozyten-2)-Antikörper 4,5 und etwas niedriger EpCAM-Expression erkannt unterschieden werden. Der Differenz Co-Expression von EpCAM und CDR2 ermöglicht die effiziente Isolierung dieser TEC Teilmengen über Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung 6. Die hier vorgestellte Protokoll ist für den menschlichen Thymus-Gewebe optimiert. Die Dauer des Verfahrens hängt von der Menge des Gewebes und der Fähigkeit der Versuchs sowie der Geschwindigkeit des Zellsortierer, wenn FACS-Sortierung verwendet. Normalerweise kann das Protokoll für die Isolierung von DC in 5 abgeschlossen-6 H und für die Isolierung von TEC in 8-10 Std. Die Trennung von DC-und TEC Teilmengen aus Thymus-Gewebe ist an der Zeit empfindlich. Je schneller die Isolierungsverfahren, die besser der Zustand der Zellen. Schließlich können die isolierten Zellen für weitere Untersuchungen, wie Vergleichsstudien von mRNA und Proteinexpression, PCR-Experimente, Proteinisolierung, molekularen Charakterisierung (dh Transkriptom, Mikro-RNA-Analyse) als auch Zellkultur 6 verwendet werden. Ethikerklärung Um in der Lage, mit der menschlichen Thymusgewebe arbeiten muss der Forscher der Zustimmung der lokalen Ethikkommission oder zuständigen Behörden sowie eine fundierte schriftliche Zustimmung der Spender (oder in der Regel seine Eltern, zu erhalten, da Gewebe wird in der Regel von minderjährigen erhalten Kinder). Darüber hinaus sollten alle menschlichen Gewebe als potenziell infektiös und sollten geeignete Maßnahmen ergriffen werden, wie die Arbeit mit Handschuhen, etc. behandelt werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien und Materialien</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum-Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase I, Grad II der Bauchspeicheldrüse bei Rindern</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x in PBS</td><td>PAA</td><td>L11-001</td><td>Lager conc. 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Protein Labelling Kit</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-10235</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Human-CDR2 (gereinigt)</td><td>Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Deutschland</td><td></td><td>markiert mit Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45 (Pacific Blue)</td><td>Biolegend</td><td>304022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Human-EpCAM (APC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-254</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD11c (PE)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-411</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-PE-Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD45-Mikrokügelchen, menschlich</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>für Gewebedissoziator</td></tr><tr><td>Percoll (Dichte 1.130 g/ml)</td><td>GE Healthcare, Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriles destilliertes Wasser (DNAse/RNAse frei)</td><td>GIBCO</td><td>10977-035&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Gamunex 10%</td><td>Tajecris-Biotherapeutics</td><td>G120052</td><td>1:10 Vorverdünnung, verwenden Sie 20 & mu; l/1 x 106Zellen</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Filter</td><td>Millex GS</td><td>SLGS033SS</td><td>Spritzenantrieb</td></tr><tr><td>Stericup Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>Pumpenantrieb</td></tr><tr><td>50 ml PC Eichenkamm Zentrifugenröhrchen</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>50 ml PP konische Röhrchen</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 5 ml Reagenzgläser</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>FACS Färbungen</td></tr><tr><td>Zellsieb 70 &mu; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS</td></tr><tr><td>Durchfluss-Zytometer-Sortierer (BD FACSAriaTMIIu)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution R6 (Rotor)</td><td>Kendro</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotator REAX 2</td><td>Heidolph</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissoziator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093 235</td><td>Gewebedissoziator</td></tr></tbody></table>

isolierung von myeloider dendritischer zellen und epithelzellen menschliche thymus

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In diesem Protokoll wird ein Verfahren, um dendritische Zellen (DC) und Epithelzellen (TEC) von dem menschlichen Thymus isolieren. DC und TEC sind die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen (APC)-Typen in einem normalen Thymus gefunden, und es ist bekannt, dass sie unterschiedliche Rollen während Thymus-Auswahl zu spielen. Diese Zellen werden in unterschiedlichen Mikroumgebungen im Thymus lokalisiert und jeweils APC Typ macht nur einen geringen Population von Zellen. Die Biologie dieser Zelltypen weiter zu verstehen, ist die Charakterisierung dieser Zellpopulationen sehr wünschenswert, aber wegen ihrer niedrigen Frequenz, die Isolierung von jeder dieser Zelltypen erfordert ein effizientes und reproduzierbares Verfahren. Dieses Protokoll Details eine Methode für die Charakterisierung von verschiedenen zellulären Eigenschaften Zellen zu erhalten. Thymusgewebes mechanisch aufgeschlossen und nach verschiedenen Schritten des enzymatischen Verdau wird das erhaltene Zellsuspension mit einem Zentrifugationsschritt Percoll-Dichte angereichert. Für die Isolierung von myeloischen DC (CD11c &lt;sup&gt; +)-Zellen von geringer Dichte Fraktion (LDF) durch magnetische Zellsortierung immunoselected. Anreicherung von TEC Populationen (mTEC, cTEC) durch Verarmung der hämatopoetischen (CD45 hallo)-Zellen von geringer Dichte Percoll Zellfraktion wodurch ihre anschließende Trennung mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) unter Verwendung spezifischer Zellmarker erreicht. Für verschiedene Downstream-Anwendungen können die isolierten Zellen verwendet werden.

Als Ausgangsmaterial in diesem Protokoll verwenden wir Thymusgewebe von Kindern unterziehen Korrektur kardiovaskulären Chirurgie (Abteilung für Thorax-und Kardiovaskuläre Chirurgie, Universitätsklinikum Tübingen) nach der Einwilligung und unter institutionellen Richtlinien erhalten entfernt. Dieses Material kann verworfen stark in der Größe von 2 bis 30 g oder mehr variieren. Die Anzahl von MDC und TEC Teilmengen (cTEC und mTEC), die erhalten werden, hängt von der Größe als auch vom Alter des Thymus Gewebeprobe zur Isol...

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Zellen und epitheliale Zellen aus dem menschlichen Thymus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem das präparierte Gewebe zunächst durch mechanische Dissoziation fragmentiert wird. Anschließend werden die Gewebefragmente enzymatisch weiterverdaut, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.Schließlich wird die Zellsuspension durch Percoll-Gradientenzentrifugation für den niedrigdichten Zellanteil angereichert. Letztendlich können die dendritischen und epithelialen Zellen aus diesem Anteil durch magnetische oder FACS-gestützte Sortierung oder eine Kombination beider Methoden isoliert werden. Die hier vorgestellte Methode bietet ein effizientes, reproduzierbares und kostengünstiges Verfahren zur erfolgreichen Isolierung und anschließenden Untersuchung seltener Zellpopulationen wie dendritischer Zellen und thymischer epithelialer Zellen, die im menschlichen Thymus vorkommen.Ich, I rotta, ein Doktorand aus unserem Labor, werde Ihnen den Vorgang demonstrieren. Beginnen Sie damit, das Thymusgewebe in eine Petrischale mit steriler PBS bei Raumtemperatur zu geben und spülen Sie restliches Blut ab. Geben Sie anschließend fri

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Diese Studie vergleicht zwei verschiedene Methoden der Isolierung humaner Monozyten zur Gewinnung von in vitro dendritischen Zellen (DCs). Monozyten werden durch Adhärenz selektiert oder durch magnetische Trennung negativ angereichert. Die Monozytenausbeute und -viabilität sowie die Viabilität, Proliferation und Expression von CD11c/CD14-Oberflächenmarkern werden zwischen beiden Methoden verglichen.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

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Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.

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Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Lernen Sie die Isolierung myeloider dendritischer Zellen und thymischer Epithelzellen aus menschlichem Thymusgewebe. Diese effiziente Methode nutzt mechanische Disruption, enzymatische Verdauung und Dichtegradientenzentrifugation.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

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