Name: Gen-Umgebung Interaktionsmodelle zur Entlarvung von Störmechanismen bei Parkinson-Krankheit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Rolle von Lipoxygenase-Isoenzymen bei der nigrostriatalen Degeneration im MPTP-Modell der Parkinson-Krankheit. Diese Methode deckt gen-spezifische Mechanismen der Neurodegeneration auf.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health NIGMS 056062 finanziert.

Es gibt nichts zu verraten.

Das Design dieser Gen-Umgebungs-Interaktionsstudie ermöglichte es uns, neue Informationen über die Dualität des 5-LOX-Isozymen im nigrostriatalen Weg zu gewinnen. Durch die Durchführung von HPLC zur Messung von striatalen Monoamonien nach salinen oder MPTP-Behandlung in Transgenen ohne das 5-LOX-Isozym und ihre Wildtyp-Littermate konnten wir feststellen, dass sein Mangel unter toxischen Bedingungen zu schützen scheint (Abbildung 1), aber unter normalen Bedingungen reduziert der Mangel an dem Enzym die st...

Die Verwendung von Gen-Umgebungs-Interaktionsmodellen bietet einen Ansatz zur Nachahmung von Risikofaktoren, die wahrscheinlich die idiopathische Parkinson-Krankheit (PD) beeinflussen, und bietet die Möglichkeit, mechanistische Erkenntnisse zu erkennen, die wahrscheinlich nicht durch den Einsatz eines genetischen oder toxischen Systems allein aufgeklärt werden können1,2. Hier veranschaulichen wir diesen Punkt und beschreiben die Anwendung des 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP) Mausmodells der nigrostriatalen Degeneration3, um die Selektivität der Lipoxygenase (LOX)-Isozymaktivität auf Neuroinflammation und Toxizität besser zu verstehen4. Während eine Rolle für LOX-Isozyme bei peripheren Erkrankungen5,6 sowie ZNS-Krankheit einschließlich Schlaganfall7 undAlzheimer-Krankheit 8,9weithin bewertet wurde, ist die Rolle der Familie der Isozyme in der nigrostriatalen Funktion und Degeneration im Zusammenhang mit PD nicht gut verstanden und rechtfertigt eine Studie. Das MPTP-Neurotoxin zeigt eine bevorzugte Degeneration des nigrostriatalen Weges und rekapituliert die striatale Dopamin-Erschöpfung und nigralen dopaminergen Zellverlust, der motorischen Beeinträchtigungen bei PD-Patienten zugrunde liegt10. Während dieses Modell nicht den vollständigen Kader der nicht-motorischen und motorischen PD-Verhalten und offen α-Synuclein-positive Lewy Körperpathologie reproduziert, war es nützlich, neue mechanistische Ziele, die zu nigrostriatalen Schäden beitragen und für frühphase translationale Tests, da es das am besten charakterisierte nichtinvasive Modell zur Verfügung, um zuverlässig nigralen Zelltod begleitet von striatalen Dopaminverlust11-15zu produzieren. Die breite Verwendung der MPTP-Maus, mit Paradigmen von akuten, subakuten bis chronischen16-18, hat eine Standardisierung der Dosing ermöglicht, um zu leichten bis schweren nigrostriatalen Schädenführen 19,20 mit Aktivierung verschiedener Mechanismen der Toxizität in Abhängigkeit von der Behandlungsschema18,21,22. Dies ermöglicht es, ein "Fenster der Läsion" gezielt zu zielen, das zu einer verstärkten oder reduzierten Nigrostriatal-Verletzung in Abhängigkeit vom therapeutischen Mittel oder dem transgenen Modell führen kann, das23-25verwendet wird.
Für translationale und Entdeckungsbiologie-Studien sind auch die Techniken zur Schadensbewertung und die Beweise, die solche Methoden liefern, unerlässlich. Für das MPTP-Mausmodell sind etablierte Metriken zur Beurteilung der Läsionsart die Messung von Markern des striatalen dopaminergen Tons, einschließlich Dopamin und seiner Metaboliten durch HPLC, und die Western-Blot-Analyse von Tyrosinhydroxylase (TH), dem ratenbegrenzenden Enzym in der Dopaminsynthese, und Indikatoren für degenerative Ereignisse wie die Gliaaktivierung mittels Western Blot Analysis und Immunohistochemistry4. Obwohl es sich um klassische neurochemische, biochemische und histologische Verfahren handelt, bieten die Techniken kritische und reproduzierbare Auslesungen über das Ausmaß der Schäden innerhalb des nigrostriatalen dopaminergen Weges, weisen auf Toxizitätsmechanismen hin und haben sich als wertvolle Werkzeuge zum Verständnis degenerativer Ereignisse bei PD erwiesen.

<table><tbody><tr><td>1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridinhydrochlorid (MPTP-HCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0896</td><td>für die PD-Modellierung</td></tr><tr><td>4%ige Formaldehyd (Paraformaldehyd)-Lösung, phosphatgepuffert (PFA)</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>BUP0157</td><td>für die Immersionsfixierung</td></tr><tr><td>Perchlorsäure ACS-Reagenz, 70% (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>für die HPLC-Säureextraktion</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>für die Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>Ethylendiaminotetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>für die Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>für die Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>Phosphatase-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5726</td><td>für die Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>für Lowry-Protein-Assay</td></tr><tr><td>Saccharose, Molekularbiologie &ge; 99,5% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>für die Kryoprotektion</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Pulver, pH 7,4 (für 0,01 M PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce/Thermo</td><td>23225</td><td>für die Proteinbestimmung</td></tr><tr><td>Novex 12% Tris-Glycin Mini Gels 1,0 mm, 12-Well-Invitrogen</td><td>/Life Technologies</td><td>EC60052BOX</td><td>für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probe Puffer (4x)</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Novex Sharp Prestained Protein Standard&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>LC5800</td><td>Proteinleiter</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat, Elektrophorese, 98,5% (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Methylalkohol, wasserfrei, Reagenz</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>SPM1057C</td><td>Methanol für den Transfer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl), ACS-Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Kochsalzlösung und Puffer</td></tr><tr><td>Fettfreies Trockenmilchpulver</td><td>Nelke</td><td>n/a</td><td>für Immunblotting</td></tr><tr><td>Ponceau S Lösung in 5% Essigsäure&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>für Immunblotting</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH), polyklonales</td><td>Chemicon/Millipore</td><td>AB1542</td> für Schafe <td>für Immunfluoreszenz&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH), polyklonales Kaninchen</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P40101-0</td><td>für Immunblotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; Aktin, Kaninchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2066</td><td>für Immunblotting</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), Kaninchen polyklonales</td><td>Chemicon/Millipore</td><td>AB5804</td><td>für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), Maus monoklonales</td><td>Covance Inc.</td><td>SMI-22R</td><td>für das Immunblotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>für Immunblotting</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), Peroxidase konjugiert&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>31462</td><td>für Immunfluoreszenz-Ziegen-Anti-Schafe</td></tr><tr><td>, Peroxidase-konjugiertes</td><td>Pierce/Thermo</td><td>31480</td><td>für Immunfluoreszenz-Ziegen-Anti-Maus</td></tr><tr><td>, Peroxidase-konjugiertes</td><td>Pierce/Thermo</td><td>31430</td><td>für Immunfluoreszenz</td></tr>, <tr><td>SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34078</td><td>für Immunblotting</td></tr><tr><td>CL-XPosure-Folie 7 Zoll x 9,5 Zoll</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34089</td><td>für Immunblotting</td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo</td><td>21059</td><td>für Immunblotting</td></tr><tr><td>Zitronensäuremonohydrat, ACS-Reagenz &ge; 99.0%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Millipore</td><td>S30-100ML</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon (PVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA), lyophilisiertes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-01</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Kaninchen-IgG, Alexa Fluor 568-markiert&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A10042</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-095-147</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard-Set Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Millipore</td><td>S26-100ML</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC Kit (Kaninchen-IgG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4001</td><td>für IHC; 10 & Mikro; l Lösungen A und B pro 1 ml PBS (gemäß Anweisungen)</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3'-Diaminobenzidin</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>für IHC; pro 5 ml kaltes ddH2O 2 Tropfen Pufferlösung, 2 Tropfen DAB und 1 Tropfen H2O2 (H2 O2 wird unmittelbar vor Gebrauch zugegeben)</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid, 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td>für den Quench-Schritt in IHC</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Biocare Medicals</td><td>CP290A</td><td>für IHC</td></tr><tr><td>Cresyl Violet Solution, Regular Strength&nbsp;</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PS102-01</td><td>Gegenfärbung für Iba1 IHC</td></tr><tr><td>95% Ethanol, Reagenz Alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td>Dehydratisierung für IHC</td></tr><tr><td>100% Absolutes Ethanol</td><td>Mallinckrodt</td><td>7019-10</td><td>Dehydratisierung für IHC</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Entfärbung für IHC</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Clearingmittel für IHC</td></tr><tr><td>DPX Eindeckmittel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522</td><td>Eindeckmedium für DAB IHC</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound - Frozen Section Einbettmedium&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>EMOCTCS</td><td>Embeddium-Medium zum Schneiden von Kryostaten</td></tr><tr><td>Kaliumpermanganat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>zur Dekontamination von DAB-Lösung</td></tr><tr><td>Dopaminhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8502</td><td>für die HPLC</td></tr><tr><td>3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>850217</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>Homovanillinsäure (HVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1252</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>Perchlorsäure (PCA) - 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71504</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>Zitronensäure-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>1-Oktansulfonsäure-Natriumsalz (OSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O8380</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>Destilliertes deionisiertes Wasser in HPLC-Qualität (ddH2O)</td><td>Millipore</td><td></td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m GSTF Membran</td><td>Millipore</td><td></td><td>für die</td></tr><tr><td>Filtration Corning Netwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3477</td><td>Polystyrol-Einsatz mit Polyester-Netzboden, für IHC</td></tr><tr><td>Ultraschall-Zelldisruptor (Soniprep 150)</td><td></td><td>.41371.274</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5414R</td><td></td></tr><tr><td>ESA MD-150 Umkehr-Phasen-Säule</td><td>ESA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Pumpe (Ultimate 3000)</td><td>Dionex</td><td>ISO-3100BM</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Autosampler (Ultimate 3000)</td><td>Dionex</td><td>WPS-3000TSL</td><td></td></tr><tr><td>Elektrochemischer Detektor</td><td>ESA</td><td>Coulochem III</td><td></td></tr><tr><td>Schließzelle</td><td>ESA</td><td>5020</td><td></td></tr><tr><td>Analysenzelle</td><td>ESA</td><td>5011A</td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon Software</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E400</td><td>Nikon</td><td>E400</td><td>Licht-/Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Einweg-Mauskäfig</td><td>Ancare</td><td>N10HT</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofilter top</td><td>Ancare</td><td>N10MBT</td><td></td></tr><tr><td>5-LOX-defiziente Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>004155</td><td></td></tr><tr><td>12/15-LOX-defiziente Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002778</td><td></td></tr></tbody></table>

gen-umgebung interaktionsmodelle zur entlarvung von störmechanismen bei parkinson-krankheit

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) Aktivität wurde in neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit verwickelt, aber seine Auswirkungen bei der Parkinson-Krankheit (PD) Pathogenese sind weniger verstanden. Gen-Umgebung-Interaktionsmodelle haben Nutzen bei der Entlarvung der Auswirkungen bestimmter zellulärer Pfade in Toxizität, die nicht allein mit einem rein genetischen oder toxischen Krankheitsmodell beobachtet werden können. Um zu bewerten, ob verschiedene LOX-Isozyme selektiv zur PD-bezogenen Neurodegeneration beitragen, können transgene(d. h. 5-LOX- und 12/15-LOX-Mangel) Mäuse mit einem Toxin herausgefordert werden, das Zellverletzungen und Tod in der Erkrankung imitiert. Hier beschreiben wir die Verwendung eines Neurotoxins, 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP), das eine nigrostriatale Läsion erzeugt, um die unterschiedlichen Beiträge von LOX-Isozymen zur Neurodegeneration im Zusammenhang mit PD zu klären. Die Verwendung von MPTP in der Maus und nichtmenschlichen Primaten ist gut etabliert, um die nigrostriatalen Schäden in PD zu rekapitulieren. Das Ausmaß der MPTP-induzierten Läsion wird durch HPLC-Analyse von Dopamin und seinen Metaboliten und semi-quantitative Western-Blot-Analyse von Striatum für Tyrosinhydroxylase (TH), das ratenbegrenzende Enzym für die Synthese von Dopamin gemessen. Zur Beurteilung von Entzündungsmarkern, die LOX-Isozym-selektive Empfindlichkeit nachweisen können, werden glialfibrilläres saures Protein (GFAP) und Iba-1-Immunhistochemie an Hirnabschnitten durchgeführt, die Substantia nigra enthalten, und GFAP Western Blot-Analyse wird an stitaalen Homogenaten durchgeführt. Dieser experimentelle Ansatz kann neue Einblicke in Gen-Umgebung-Wechselwirkungen liefern, die der nigrostriatalen Degeneration und PD zugrunde liegen.

Dieses Toxin-Expositionsparadigma kann eine signifikante und nachweisbare 20% striatale Dopamin-Erschöpfung bei MPTP- vs. kochinjizierten Tieren produzieren. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Lose von MPTP etwas mehr oder weniger Läsion ergeben können; Daher wird für eine bessere Präzision ein vorläufiges Experiment an Wildtypmäusen vor der Verwendung in Transgenen empfohlen, wenn eine neue Menge Neurotoxin verwendet wird. Die Verwendung von leicht bis mäßiger Läsion ermöglicht die Beobachtung der Auswirkunge...

Lipoxygenase (LOX) Isozyme können Produkte erzeugen, die Neuroinflammation und Neurodegeneration erhöhen oder verringern können. Eine Gen-Umgebungs-Interaktionsstudie konnte LOX-isozymespezifische Effekte identifizieren. Die Verwendung des 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP)-Modells der Nigrostriatalschäden in zwei LOX-Isozymen-defizienten transgenen Linien ermöglicht einen Vergleich des Beitrags von LOX-Isozymen zur dopaminergen Integrität und Entzündung.

Gen-Umgebung Interaktionsmodelle zur Entlarvung von Störmechanismen bei Parkinson-Krankheit

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Rolle der Lipoxygenase-ISO-Enzyme bei der nigrostriatalen Degeneration im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit zu verstehen. Zu diesem Zweck wird ein Neurotoxin, das eine Nigro-SAL-Läsion hervorruft, sorgfältig hergestellt. Anschließend werden Mäuse mit genetischem Knockout täglich über vier aufeinanderfolgende Tage mit der MPTP-Lösung injiziert; sieben Tage nach der letzten Injektion erfolgt die Analyse.Proben werden gesammelt und für biochemische oder immunhistologische Analysen verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass 1215 Sperren die nigrostriatale MPTP-Toxizität nicht beeinflusst. Allerdings trägt eine Fünfersperre unter toxischen Bedingungen zu Schäden bei.Die TS-Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Parkinson-Krankheit zu beantworten. Sie legt nahe, welchen Einfluss Gen-Umwelt-Interaktionen auf die Nigrostriatale Anfälligkeit haben. Mithilfe von Gen-Umwelt-Modellen konnten wir ISO-selektive Funktionen erkennen und Einblicke in die Differenzierung von fünf Lipiden gewinnen.Sachkundiges Personal sollte während des gesamten folgenden Verfahrens geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen. Begi

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