Hochdurchsatz-Fluorometric Messung der Boden Mögliche Extrazelluläre Enzymaktivitäten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die maximalen potenziellen Raten zu quantifizieren, mit denen extrazelluläre Enzyme im Boden ihre Zielsubstrate abbauen. Dies wird erreicht, indem zunächst feuchter Feldboden und Puffer in einem Mixer miteinander vermischt werden. Anschließend werden die gemischten Proben per Pipette in eine Tiefformat-Probenplatte und Tiefformat-Standardplatten überführt. Die Tiefformatplatten werden inkubiert und zentrifugiert, bevor 250 µL von jedem Wells der Tiefformatplatten in die entsprechenden Wells einer schwarzen Platte mit flachem Boden übertragen werden.

96-Well-Platten. Die drei Platten werden anschließend im Fluorimeter erneut gemessen und die erhaltenen Daten analysiert. Letztendlich werden potenzielle extrazelluläre Bodenenzymaktivitäten anhand der Rate bestimmt, mit der fluoreszierender Farbstoff durch eine enzymkatalysierte Reaktion vom Substrat freigesetzt wird, wobei eine höhere Fluoreszenz auf stärkere Substratabbau hinweist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt in der Möglichkeit, Enzymaktivitäten in einer großen Anzahl von Proben zu messen, indem das tiefe 96-Well-Mikroplattenformat genutzt wird. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir die Gelegenheit erkannten, das Probenvolumen im Vergleich zur Standardmikroplatte zu erhöhen, indem wir andere Protokolle an das Tieftropfplattenformat anpassten. Die Konsequenzen dieser Technik ermöglichen es uns, mikrobielle Physiologie besser mit ökosystemaren Prozessen zu verknüpfen.

Die visuelle Demonstration ist für diese Technik entscheidend, da es zahlreiche Feinheiten und Handhabungsschritte bei der Probennahme gibt, die in einer schriftlichen Anleitung nur schwer nachzuvollziehen sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen mikrobielle Ökologie und bodenbezogene Biogeochemie zu beantworten, beispielsweise wie Bodenmikroben auf Veränderungen in ihrem Umfeld reagieren und wie ihre physiologischen Reaktionen wichtige ökologische Prozesse wie Zersetzung und Nährstoffkreisläufe beeinflussen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Zersetzung von organischer Bodensubstanz, in Nährstoffkreisläufe und terrestrische Ökosysteme ermöglicht, kann sie ebenso auf marine und limnische Systeme angewendet werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit den Pipettierfähigkeiten und Problemen im Zusammenhang mit der Zeitempfindlichkeit dieses Protokolls. Darüber hinaus kann die große Menge an Daten, die bei diesem Verfahren generiert wird, für Erstanwender manchmal überwältigend sein. Um die Assay-Präparation zu beginnen, beschriften Sie drei Tieflochplatten als Probe, MUB-Standards für vier Methyl und Beone sowie MUC-Standards für sieben Amino vier Methylcoumarin.

Geben Sie jeden Standard und jedes Substrat in separate, saubere, vorab beschriftete Reservoirs, die in Reihen angeordnet sind. Pipettieren Sie dann den entsprechenden MUB-Standard in die zugehörigen Vertiefungen der MUB-Standardplatte, wie im textlichen Protokoll aufgeführt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die MUC-Standards in die entsprechenden Vertiefungen der MUC-Standardplatte, um die Bodenschlämme vorzubereiten.

Für jede Bodenprobe 2,75 Gramm feuchten Feldboden abwiegen, bevor er einem Mixer zugegeben wird. 91 Milliliter eines 50 Millimolar-Puffers hinzufügen und eine Minute lang auf höchster Stufe mischen. Den Inhalt des Mixers in eine saubere Glaswanne gießen, die mindestens so breit ist wie eine Acht-Kanal-Pipette mit einem Rührstab.

Der Bodenschlamm kann vor dem Einfüllen in die Schale durch ein etwa ein Millimeter großes Sieb abgegossen werden. Stellen Sie die Schale auf eine Rührplatte und mischen Sie den Bodenschlamm. Danach pipettieren Sie 800 Mikroliter Bodenschlamm in die erste Spalte der Probenschale.

Wiederholen Sie dasselbe für die erste Spalte der MUB-Standard- und MUC-Standardplatten. Spülen Sie den Mixer, den Rührplatte und den Rührstab zwischen den Bodenproben mit entionisiertem Wasser oder Puffer ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Bodenprobe.

Wechseln Sie bei jeder nachfolgenden Probe zur nächsten Spalte. Danach pipettieren Sie das entsprechende Substrat in die zugehörigen Vertiefungen der Probenplatte. Wie im textbasierten Protokoll aufgeführt, bereiten Sie eine Probenplatte für jede zu testende Inkubationstemperatur vor.

Versiegeln Sie die Deep-Well-Platten mit Plattenmatten. Drehen Sie jede versiegelte Platte von Hand um, bis die Lösung gründlich gemischt ist. Stellen Sie die Platten in den entsprechenden Inkubator für die im Textprotokoll angegebene Inkubationszeit. Notieren Sie die Anfangszeit als Zeitpunkt null sowie die entsprechenden Inkubationszeiten am Ende jedes Inkubationszeitraums.

Zentrifugieren Sie die verschlossenen Platten drei Minuten lang bei etwa 2.900 ×g. Nach der Zentrifugation übertragen Sie 250 Mikroliter aus jedem Well der inkubierten Tiefwellplatten in die entsprechenden Wells schwarzer flacher 96-Well-Platten. Eine schwarze Platte wird für jede inkubierte Tiefwellplatte verwendet.

Es ist wichtig, die Proben gemäß den Herstelleranweisungen für den verwendeten Flora-Metric-Plattenreader aus den inkubierten Deep-Well-Platten in die entsprechenden Vertiefungen der schwarzen 96-Well-Platten mit flachem Boden zu überführen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 365 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 450 Nanometer ein.

Laden Sie eine der Standardplatten, stellen Sie das Fluorimeter auf automatische Verstärkung ein und lesen Sie die Platte ab. Danach stellen Sie die Verstärkung auf manuell und verringern den Wert von optimal auf die nächstniedrigere auf fünf gerundete Zahl. Wiederholen Sie für jede Standardplatte die Messung zweimal pro Platte.

Laden Sie als Nächstes die Probenplatte. Stellen Sie den Verstärkungsfaktor auf automatisch und führen Sie die Probenplatte aus. Führen Sie die Probenplatte manuell erneut aus, um den höchsten Verstärkungsfaktor für jede der Standardplatten anzupassen.

Beginnen Sie die Datenanalyse, indem Sie die Fluoreszenzdaten der Standardkurve für den MUB- und MUC-Standard in eine Tabellenkalkulation eingeben. Konvertieren Sie die mikromolaren Konzentrationen in Mikromol für jede Probe. Verwenden Sie die Fluoreszenzdaten der Standardkurve, um die Steigung, den y-Achsenabschnitt und die R-Quadrat-Werte für die MUB- und MUC-Standardkonzentrationen zu berechnen.

Akzeptable r-Quadrat-Werte sollten für jede Probe 0,98 überschreiten. Standardkurven können in einem Streudiagramm veranschaulicht werden, bei dem die Fluoreszenzablesungen als abhängige Variable und die Standardkonzentration als unabhängige Variable aufgetragen werden. Geben Sie die Rohfluoreszenzdaten der Probe inklusive Substrat in eine neue Tabellenkalkulation ein.

Geben Sie außerdem die Inkubationszeit und die Trockenmasse des Bodens für jede Probe an, subtrahieren Sie die Achsenabschnittswerte der Standardkurve von den entsprechenden Fluoreszenzwerten der Probe und dividieren Sie anschließend durch die Steigung der entsprechenden Standardkurve. Multiplizieren Sie unter Verwendung der Gleichung der Standardgeraden die Mikromol der Probe mit 91 Milliliter, dem im Bodensuspensionsexperiment verwendeten Puffervolumen. Dividieren Sie den erhaltenen Wert durch die für die Probe spezifische Inkubationszeit und die Masse des trockenen Bodens.

Zum Schluss den erhaltenen Wert mit 1000 multiplizieren, um die gewünschten Einheiten zu erhalten. Die Ergebnisse stammen aus einer experimentellen Klimastudie, in der Böden, die unter natürlichen Klimabedingungen standen, mit Böden verglichen wurden, die erhöhten Kohlendioxidkonzentrationen und Erwärmungsbehandlungen ausgesetzt waren. Dargestellt sind hier potenzielle extrazelluläre Enzymaktivitäten (EEAs) am Prärie-Erwärmungs- und Kohlendioxid-Anreicherungsstandort in Kontroll- und Behandlungsparzellen. In diesem Beispiel unterschieden sich die potenziellen Enzymaktivitäten zur Aufnahme von Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor in Bodentiefen von null bis fünf Zentimetern nicht zwischen den experimentellen Behandlungen.

Jedoch wiesen mehrere potenzielle EEAs bei Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern signifikante Unterschiede auf. Beispielsweise waren die kohlenstoffabbauenden Enzyme Beta-1,4-Glucosidase und Beta-D-Cellobiasa in den mit erhöhtem Kohlendioxid und Erwärmung behandelten Parzellen im Vergleich zu den Parzellen unter natürlichen Klimabedingungen niedriger; ebenso waren die stickstoff- und phosphormineralisierenden Enzyme in den Behandlungsparzellen niedriger als unter natürlichen Klimabedingungen. Bei Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern.

Die Berechnung und Darstellung der Summe aller potenziellen Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Phosphorkreislauf-EEAs kann eine nützliche Methode sein, um umfassendere Muster bezüglich des potenziellen Boden-Kohlenstoff-, -Stickstoff- und -Phosphorkreislaufs zu beobachten. In diesem Beispiel wurde die Summe der potenziellen EEAs von Beta-1,4-Glucosidase, Beta-D-Cellobiohydrolase, Beta-Xlosidase und Alpha-1,4-Glucosidase berechnet, um die potenziellen Aktivitäten des Kohlenstoffkreislaufs darzustellen. Die Summe der potenziellen EEAs von Beta-1,4-N-Acetylglucosaminidase und L-Leucin-Aminopeptidase wurde berechnet, um die potenziellen Aktivitäten des Stickstoffkreislaufs darzustellen.

Phosphatase wurde verwendet, um potenzielle Phosphor-Kreislaufaktivitäten darzustellen. Potenzielle EEAs für den Gesamtkohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorkreislauf waren in den mit erhöhtem Kohlendioxid und Erwärmung behandelten Parzellen im Vergleich zu den Parzellen unter natürlichen Klimabedingungen in Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern tendenziell niedriger. Dieser Trend war jedoch nur für die Gesamtaktivitäten des Stickstoff- und Phosphorkreislaufs signifikant, und die mikrobiellen Aktivitäten im Boden (EEAs) unterschieden sich zwischen den Behandlungsparzellen nicht signifikant.

Bei einer Bodentiefe von null bis fünf Zentimetern. Die Ergebnisse deuten auf entgegengesetzte Trends bei der Enzymaktivität und der funktionellen Gruppe zwischen den Behandlungsparzellen in Abhängigkeit von der Bodentiefe hin; das Verhältnis potenzieller extrazellulärer Enzymaktivitäten (EEAs) ist eine Möglichkeit, den mikrobiellen Nährstoffbedarf zu bewerten. Hier unterscheiden sich die Aktivitäten von Bodenenzymen, Tochi-Geometrie, Kohlenstoff-zu-Stickstoff-, Kohlenstoff-zu-Phosphor- oder Stickstoff-zu-Phosphor-Verhältnissen signifikant zwischen den Behandlungsparzellen bei einer Bodentiefe von null bis fünf Zentimetern.

Jedoch waren die potenziellen Enzym-Carbon-zu-Phosphor- und Stickstoff-zu-Phosphor-Verhältnisse in den mit erhöhtem Kohlendioxid und Erwärmung behandelten Parzellen höher. Im Vergleich zu den ambienten Klimabedingungen können Temperaturen in Bodentiefen von fünf bis fünfzehn Zentimetern stark die bodeneigenen EEAs beeinflussen. In typischen Laboranalysen werden Bodenenzyme jedoch bei einer einzigen Temperatur gemessen, die möglicherweise nicht den Bedingungen bei C zwei Temperaturen entspricht.

Aran-Diagramme dienen der Visualisierung der Aktivierungsenergie und werden durch Auftragen des Logarithmus der Enzymaktivität in Abhängigkeit von der inversen Temperatur, umgerechnet in Kelvin, auf der x-Achse erstellt. Die Aktivierungsenergie wird üblicherweise als die minimale Energie definiert, die erforderlich ist, um eine chemische Reaktion zu katalysieren, und wird hier als Proxy für die Temperaturabhängigkeit enzymkatalysierter Reaktionen verwendet. Eine höhere Aktivierungsenergie weist auf eine größere Temperaturempfindlichkeit des Enzyms hin.

Ebenso entsprechen Aktivierungsenergien direkt den Q10-Temperaturkoeffizienten. Die potenziellen Enzymkinetiken für kohlenstoff-, stickstoff- und phosphorabbauende EEAs wurden in beiden Behandlungsparzellen in zwei Bodentiefen untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass die Temperatursensitivität der EEAs in keiner der beiden Bodentiefen zwischen den Behandlungsparzellen signifikant unterschiedlich war. Sobald der Vorgang beherrscht ist, können 12 Proben in 30 Minuten oder weniger in die 96er-Rad-Mikrotiterplatten eingepflanzt werden.

Außerdem können Sie nach den vorgeschriebenen Inkubationszeiten die Platten typischerweise innerhalb einer halben Stunde nach dem Zentrifugieren, Übertragen und erneuten Messen am Urometer ablesen. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, konsistent zu pipettieren. Jede Luftblase beim Pipettieren beeinträchtigt Ihre Ergebnisse nachteilig. Dieses Verfahren befolgen.

Andere Methoden wie die DNA-Extraktion und Sequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Rolle der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Boden für die Bodenfunktion nach ihrer Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der mikrobiellen Ökologie, um Nährstoffkreisläufe und biogeochemische Prozesse in terrestrischen Ökosystemen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine sehr gute Vorstellung davon haben, wie potenzielle Enzymaktivitäten quantifiziert werden können.

Außerdem sollten Sie in der Lage sein, die Daten dahingehend zu interpretieren, wie sich mikrobielle Reaktionen auf Faktoren wie Klima und unterschiedliche Bodentypen in verschiedenen Ökosystemen auswirken können. Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit fluoreszierenden Materialien stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um die Lichteinwirkung aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Fluorophore zu minimieren.