Name: Hochdurchsatz-Fluorometric Messung der Boden Mögliche Extrazelluläre Enzymaktivitäten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Erfahren Sie die hochdurchsatz-fluorometrische Messung extrazellulärer Enzymaktivitäten in Böden. Diese Methode ermöglicht die effiziente Analyse zahlreicher Proben zur Untersuchung mikrobieller Prozesse.

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Diese Veröffentlichung wurde von der Enzyme in der Umweltforschungskoordination Netzwerk Forschung von der US National Science Foundation (DEB # 1021559) unterstützt finanziert. Diese Arbeit wurde von der US National Science Foundation (DEB # 1021559) und das US Department of Office of Science Energy (Biologische und Umweltforschung) unterstützt. Alle Meinungen, Ergebnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen und die in dieser Dokumentation sind die der Autoren und nicht unbedingt die Ansichten der US-NSF reflektieren.

1. Assay-Set-up <ol><li> Label 3 Deep Well Platten: &quot;Sample&quot;, &quot;MUB Standard&quot; und &quot;MUC-Standard&quot;. </li><li> Gießen Sie jede Norm (MUB von 0, 2,5, 5, 10, 25, 50, und 100 uM) und Substrat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) in separate sauber, vormarkiert Speichern (in Reihen orientiert) . </li><li> Pipettieren Sie die entsprechende MUB Standard in entsprechende Vertiefungen der MUB Standardplatte (Tabelle 1). <ol><li> Je 200 ul von 0 uM MUB in Zeile A der MUB Standardplatte. </li><li> Je 200 ul von 2,5 uM MUB in Reihe B der MUB Standardplatte. </li><li> Je 200 ul von 5 uM MUB in Zeile C der MUB Standardplatte. </li><li> Je 200 ul 10 uM MUB in Reihe D der MUB Standardplatte. </li><li> Je 200 ul 25 uM MUB in Zeile E der MUB Standardplatte. </li><li> Je 200 ul 50 uM MUB in Zeile F der MUB Standardplatte. </li><li> Je 200 ul von 100 μM MUB in Reihe G der MUB Standardplatte. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 - 1.3.8 für MUC-Standards in entsprechende Vertiefungen der MUC Standardplatte. </li></ol></li><li> Prep Boden Schlämme für jede Bodenprobe. <ol><li> Wiegen 2,75 g Feld feuchten Boden in den Mixer. </li><li> Hinzufügen 91 ml 50 mM Puffer. Mischung auf hoch für 1 min. </li><li> Gießen Mixer Inhalt in einen sauberen Glasschale mindestens so breit wie 8-Kanal-Pipette mit einem Rührstab. </li><li> Legen Sie auf Rührplatte mischen Bodenschlamm auf niedrig. </li><li> Pipette 800 ul von Bodenschlamm in eine erste Spalte der Musterplatte (Tabelle 2). </li><li> Wiederholen Sie in 1. Spalte der MUB-Standard und MUC-Standard-Platten (Tabelle 1). </li><li> Spülen Mixer, rühren Platte und Rührstab mit DI H 2 O oder Puffer zwischen Bodenproben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 - 1.4.7) für jede Probe in die nächste Spalte mit jeder nachfolgenden Bodenprobe (Tabellen 1 und2). </li></ol></li><li> Pipettieren, die das geeignete Substrat (in diesem Beispiel 200 &amp;mgr; M Konzentrationen) in die entsprechenden Wells der Probenplatte (Tabelle 2). <ol><li> Je 200 ul der BG Substrat in Reihe A der Probenteller. </li><li> Je 200 ul CB Substrat in Reihe B der Probenteller. </li><li> Je 200 ul NAG Substrat in Zeile C der Probenteller. </li><li> Je 200 ul von PHOS Substrat in Reihe D der Probe Platte. </li><li> Je 200 ul XYL Substrat in Zeile E der Probe Platte. </li><li> Je 200 ul AG Substrat in Reihe F des Probenteller. </li><li> Je 200 ul der LAP Substrat in Reihe G der Probenteller. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1 - 1.5.7 für jedes Bruttemperatur Probenplatte. </li></ol></li></ol> 2. Inkubation der Testplatten <ol><li> Verschließen Sie die Deep-Well-Platten (&quot;Sample&quot;, &quot;MUB Standard&quot; und &quot;MUC-Standard4 ;) mit Platte Matten. </li><li> Kehren Sie jedes (versiegelt) Platte von Hand, bis die Lösung gründlich gemischt (~ 10x). </li><li> Platzieren Platten in geeigneten Inkubator für die Inkubation erforderliche Zeit (Tabelle 3). </li><li> Nehmen Anfangszeit als Zeit 0. Auch notieren die entsprechenden Inkubationszeiten, so dass Sie wissen, wann man die Platte aus dem Inkubator (Tabelle 3) zu entfernen. </li><li> Am Ende jeder Inkubationsperiode Zentrifuge die versiegelten Platten für 3 min bei 2.900 x g ~. </li><li> Nach der Zertifizierung, Transfer 250 ul von jedem der gut inkubiert Deep Well Platten in entsprechende Vertiefungen in schwarz mit flachem Boden 96-Well-Platten (eine schwarze Platte wird für jeden inkubiert tiefen Brunnen Platte verwendet werden). Es ist wichtig, Proben aus den inkubiert Deep Well Platten in den gleichen Brunnen (dh A1 ... A12, etc.) in den schwarzen Flachboden-96-Well-Platten übertragen (Tabelle 1, 2). </li></ol> 3. Leuchtstoff-Messungen anein Mikro Fluorometer <ol><li> Nach Angaben des Herstellers für die fluorimetrische Plattenlesegerät verwendet wird, stellen die Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge 450 nm (oder entsprechende Filter). </li><li> Lesen Sie die drei Platten auf dem Fluorometer. Wichtig: Proben-und Standard-Platten (dh MUB oder MUC) müssen mit dem gleichen Gewinn zu lesen. <ol><li> Stellen Sie die automatische Verstärkungs Spektralphotometer und lesen Sie die MUC und MUB Standard-Platten. </li><li> Set Verstärkung auf manuell, und verringern Sie den Wert nicht optimal auf die nächste niedrigste Zahl, gerundet auf die nächsten fünf, für jede Standardplatte. Repeat 2x für jede Platte. </li><li> Stellen Sie die Verstärkung, um die automatische und führen Sie den Probenteller. Führen Sie den Probenteller manuell auf den höchsten Gewinn für jede der Standard-Platten (dh MUB und MUC) entsprechen. </li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Geben Standardkurve Fluoreszenzdaten in Tabellenkalkulations für MUB (Tabelle 4a) Und MUC-Standard (Tabelle 4b) <ol><li> Konvertieren (uM) Konzentrationen (&amp;mgr; mol) (Tabelle 4a und 4b). </li></ol></li><li> Für Standardkurve Fluoreszenzdaten jeder Probe, die Berechnung der Steigung, y-Achsenabschnitt, und R 2-Werte für MUB und MUC (umol) Standardkonzentrationen. R 2 akzeptablen Werte 0,98 für jede Probe betragen (Tabelle 4a und 4b). Es kann nützlich sein Standardkurven in einem Streudiagramm zu visualisieren, mit Fluoreszenz liest als abhängige Variable (y-Achse) und Standardkonzentration (mmol), aufgetragen als unabhängige Variable (x-Achse) (Abbildung 1) aufgetragen. </li><li> Sie werden die MUB und MUC Standardkurve Steigung und y-Achsenwerte verwenden, um die Probe + Substrat Rohstoffe Fluoreszenzdaten in potentielle EEA berechnen. Sie müssen zuerst die Probe + Substrat Roh-Fluoreszenz-Daten in eine neue Tabelle geben (Tabelle 5a </strong&gt;). Sie müssen auch die Inkubationszeit (hr) und Bodentrockengewicht für jede Probe (Tabelle 5b) eingeben. Beachten, die in diesem Beispiel eingegebene Zeit-Werte von 3 Stunden, da die Proben wurden bei 25 ° C (Tabelle 3) inkubiert. <ol><li> Subtrahieren Sie die Standardkurve Schnittwerte aus den entsprechenden Probenfluoreszenzwerte und dann teilen durch die Steigung der entsprechenden Standardkurve (Tabelle 5c). Um dies zu erreichen, ordnen Standardgleichung für Probe Enzymkonzentration (x) zu lösen, x = (yb) / m, wo: [y = raw Leseprobe Fluoreszenz, b = Achsenabschnitt von MUB oder MUC Standardkurve, m = Steigung von MUB oder MUC Standardkurve]. </li><li> Multiplizieren Probe mmol, von Schritt 4.3.1, um 91 ml (Puffervolumen im Boden Gülle) (Tabelle 5d). </li><li> [Enzym amt: Teilen Wert in Schritt 4.3.2 von der Probe spezifischen Inkubationszeit und trockenen Bodenmasse (Tabelle 5e) erhalten. (&amp; #956; mol) x 91 ml x Inkubation (h) x trockenen Boden (g) x 0,8 ml x 1.000] Anmerkung: 0,8 ml das Volumen der Aufschlämmung in jede Vertiefung eingesetzt, und 1000 korrigiert die tatsächliche Bodenmenge in jeder Vertiefung. </li><li> Multiplizieren Sie die in Schritt 4.3.3 von 1000 erhalten, um die gewünschten Einheiten (nmol Aktivität / g trockenen Boden / h) (Tabelle 5f) Wert bekommen. </li></ol></li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Labor-basierte Messung von potenziellen Boden EAD wichtige Einblicke in mikrobielle Reaktionen auf ihre abiotischen Umwelt, und ihre Konsequenzen für das Funktionieren von Ökosystemen zu liefern. Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, dass Datensatz minimale Unterschiede in der Bodenenzymaktivität oder Kinetik unter Klima Behandlung Parzellen. , Inverse Tendenzen unter Parzellen fördern jedoch weitere Untersuchung der Kovariaten, die die Produktion von mikrobiellen EEA wie Bodenfeuchte, Boden-pH oder das Pflanzenwachstum beeinflussen können. Insgesamt beurteilen EEA im Hinblick auf (1) Gesamt EWR in Böden, (2) EWR-Stöchiometrie (3) Arrheniuskurven / Aktivierungsenergie, und (4) Q 10 bietet ein breites Spektrum von Ansätzen, die indikativ für Ökosystem-Level-Prozesse sein können, von denen robust charakterisieren Ökosystem Boden funktionelle Dynamik. Hochdurchsatz-Fluoreszenz-basierten Assays EWR sind ein nützliches Werkzeug, das häufig verwendet wird, um potenzielle EEA in Böden zu untersuchen undanderen Umgebungen. Wichtig ist, Potential-Aktivitäten spiegeln die Enzym-Pool-Größe, aber nicht von selbst quantifizieren Enzymproduktion oder Fluktuationsraten 46. Obwohl die Technik ist relativ einfach, kann scheinbar geringfügige Unterschiede zwischen Labor-Protokolle die Vergleichbarkeit der Ergebnisse 13 behindern. Leider derzeit nicht wir geeignete standardisierte Positivkontrollen für EEA. Die Verwendung von stöchiometrischen Verhältnissen ist ein Ansatz zur Bewältigung dieser Herausforderungen. Ansonsten hat das Aufkommen von Hochdurchsatz-Techniken die Untersuchung von Enzymen in der Umgebung 4 vorgeschoben. Sorgfältige Interpretation der von diesen Assays erzeugten Daten können wichtige Trends in der mikrobiellen Aktivität aufzuklären. Die Robustheit des Protokolls beruht auf der Fähigkeit, spezifisch für einzelne Proben Bedingungen auswählen, kann aber auch in Grenzen ergeben. Eine Reihe von Modifikationen erforderlich, um sicherzustellen Proben genau zu messen<html> einzelnen Feld Seiten: Puffer Die Puffer Sie auswählen, wird auf dem pH-Wert des Bodens ab. Puffern stabilisiert auch die Fluoreszenzintensität der Fluoreszenzstandards, die stark pH-abhängig ist 27,47. Der pH-Puffer, die wir verwenden in der Regel um den Boden zu Brei machen, ist ein 50 mM Natriumacetat oder Tris-Puffer, die für bestimmte Säurekonstante des Puffers (pKa), um am besten entsprechen Boden gewählt wird - Probe pH-Werte. Natriumacetat einen pKa-Wert von 4,76 und Tris einen pKa-Wert von 8,06, so dass die Mengen dieser beiden Puffer werden, um die gewünschten pKa-Wert für die einzelnen Proben erreichen variieren. Phosphat-Puffer (pKa = 7,2) wurde für neutral / leicht basischen Böden vorgeschlagen. Raten wir jedoch für analytische Variabilität in Vorstudien zu testen, bevor Sie diese Puffer, wie hohe Phosphatkonzentrationen können mit der Enzymaktivität beeinträchtigen. Handhabung und Lagerung von fluoreszierenden Substrate jove_content &quot;&gt; Fluoreszenz-Assays können vor Störungen durch Verunreinigungen und / oder Instabilität vieler fluoreszierenden Verbindungen, wenn sie Licht ausgesetzt erleiden, so ist Vorsicht geboten beim Umgang mit fluoreszierenden Substraten. Wir empfehlen dringend, die Minimierung der Exposition gegenüber kein Licht fluoreszenzmarkierten Substraten und MUB und MUC-Standards . Verwendung Braunglasflaschen oder Abdecken der Glaswaren und Behältnisse für die Herstellung und Speicherung fluoreszierende Substrate und Standards verwendet wird dringend empfohlen, Aluminiumfolie, um Gläser und Behälter wickeln funktioniert gut Ebenso effizient Impfen Platten und Übertragung bis dunkel Inkubatoren ist Best Practice Wir empfehlen.. Speichern von Substraten und Standards (-20 ° C) nicht länger als zwei Monate (bei gleichzeitigem Schutz vor Licht) und Auftauen Substrate (5 ° C) ~ 24-48 Stunden vor dem Beginn der Enzym-Assay (s). Design-und Replikations Um beste Konto für Brunnen zu Brunnen Probe Variationen, Umsetzung negative Testkontrollen und (wenn möglich) Assay repliziert wird empfohlen. Variation tritt typischerweise aufgrund der Unterschiede in der Höhe der Bodenpartikel in jede Vertiefung und Pipettieren Fehler. Daher werden starke Durchmischung und gute Pipettiertechnik Wesentlichen gut zu minimieren, um auch Abwechslung. Darüber hinaus empfehlen wir dringend, die Implementierung eines negativen Testkontrolle (Puffer +-Substrat-Lösung), um das Substrat Unstimmigkeiten über die Zeit zu überwachen. Dies kann leicht überwacht werden, wenn das Lesen der Enzym-Platten durch den Vergleich Negativkontrollen (wir verwenden in der Regel die letzte Spalte der 96-Well-Platten). Negative Kontrollen Substrat sind typischerweise stabil, daher steigt die Signal deutlich über der Nachweisgrenze, ist es indikativ für Kontamination oder Substrat Instabilität der Ersatz des Substrats und / oder Standardlösungen erfordern. Um den Durchsatz zu maximieren, umfasst unser Protokoll mehrere potenzielle EEA in einem tiefen Well-Mikroplatte, obwohl auch andere Protokolle führen Sie eine Art vonAssays pro Platte (dh ein Substrat pro Platte), da unterschiedliche EEA treten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Unabhängig davon, müssen Enzymoptimierung auf Böden, bevor diese über hoch-Ansatz oder der Ansatz einzigen Platte durchgeführt werden. Mehrere Substrate auf einer einzigen Platte verwendet werden, wenn die Reaktionsgeschwindigkeiten für jedes Enzym innerhalb der Zeitdauer der Inkubation relativ konsistent. Unser Protokoll empfiehlt ~ 2,75 g Boden, um den Schlamm-Lösung zu machen, während ~ 1 Gramm ist in anderen Protokollen 24 empfohlen. Wir schlagen vor, dass die Verwendung von mehr Boden (wenn möglich) ist ein effektiver Ansatz für eine bessere Erfassung in-Boden-Proben Variation der Enzymaktivität Ebenen. In diesem Protokoll inkubieren wir 800 ul Aufschlämmung Boden mit 200 ul Substrat, während andere nur inkubiert 200 ul Bodenschlamm mit 50 ul von Substraten. Das ist einfach eine Funktion durch die Aufstockung der, dass letztlich nicht die gemessene Aktivität ändern. Es gibt auch praktische Vorteilefür die Verwendung von größeren Mengen. Eins, ist es einfacher, Bodenpartikel zu vermeiden, während Pipettieren in entsprechende schwarze Flachboden-96-Well-Platten vor der Aufnahme auf dem Fluorometer Intensitäten. Zweitens ist das zusätzliche Volumen nützlich im Falle von versehentlich verschütteten Flüssigkeiten, während die schwarzen Flachboden-96-Well-Platten der Übertragung auf dem Fluorometer vor der Aufnahme Enzym bezogenen Fluoreszenzintensitäten. Schon geringe Abweichungen in Volumen Fluoreszenz deutlich sinken unter Brunnen. Schließlich ist aufgrund des hohen Durchsatzes der Natur dieses Protokolls wählt man üblicherweise auf experimentellen Replikation angewiesen, um Variation der Enzymaktivitätsniveaus anstatt die Durchführung des Tests repliziert darstellen. Es ist immer am besten, Praxis, analytische Wiederholungen enthalten, aber in der Praxis, fühlen wir uns unserem Protokoll bietet eine ausgewogene Abwägung zwischen analytischen und experimentellen Replikate angesichts der begrenzten Ressourcen. Ebenso nutzt unser Ansatz relativ gut homogenisiert Boden (2,75 g) pro Test 25, die istntly in-Boden-Varianten ab. Die Entscheidung, analytische Wiederholungen verwenden sollte sorgfältig durch Testen auf analytische Fehler in Vorstudien 48 berücksichtigt werden. Wir empfehlen jedoch, dass experimentelle Designs mit weniger als 4 Behandlungsgruppen-Wiederholungen sollten in Erwägung ziehen Assay repliziert. Boden, Puffervolumina und Substratkonzentration Optimierung Die Bodenpuffer: Substratkonzentration Verhältnis ist eine wichtige Variable, die einen starken Einfluss auf die gemessene Fluoreszenz bei der Durchführung von Enzymtests. Die Höhe des Bodens in der Aufschlämmung gegeben, um zu untersuchen oder die Konzentration des Substrats muss je nach der Aktivität der Enzyme, die in der Bodenprobe eingestellt werden. Die für dieses Beispiel gewählt Beträge wurden bei früheren Tests dieser Böden basiert, um sicherzustellen, dass die Substratverfügbarkeit wurde nicht einschränkende, und dass wir maximal möglichen Messraten unter den Testbedingungen (V max) 44,45. Für Bodenproben, die hohe Konzentrationen von Enzymen haben, muss die Menge an Boden oder Substratkonzentration erhöht werden. Wir haben gefunden, dass eine Erhöhung Substratkonzentrationen (und Einstellen der Standardkurve entsprechend) kann die Linearität der Kurve beeinflussen. Wir empfehlen daher, Verringerung der Bodenwerte und / oder proportional Anpassungen Puffervolumen wie nötig. Unabhängig davon ist es wichtig, dass die Substratkonzentration für jeden Bodentyp untersucht, weil optimieren gemessen EAD durch eine Größenordnung größer zwischen gesättigten und Unter gesättigte Substratkonzentrationen 26 unterscheiden. Daher Unterschiede zwischen experimentellen Behandlungen (usw.) sind anfällig für Typ II statistische Fehler und weniger wahrscheinlich an Untersättigungsbedingungen nachgewiesen werden, und statistische Fehler 27,35. Um Substratkonzentrationen zu optimieren, sollten vorläufige Enzym-Assays auf repräsentativen Bodenproben unter Verwendung einer Vielzahl von Substratkonzentrationen. NachAufzeichnen der Fluoreszenz, einfach die Daten zeichnen (ähnlich wie bei der Standardkurve Beispiel, Fig. 1), um die Substrat-Konzentration (x-Achse), die zur Enzymaktivität (y-Achse) entspricht, zu identifizieren, wo die Steigung einpendelt (~ 0). Ebenso kann die Substratkonzentration entsprechend dem Punkt, wo die Neigung einpendelt (~ 0) ist ein guter Indikator für die optimale Substratkonzentration für diesen bestimmten Böden. Dieser Assay misst Fluoreszenz letztendlich in einer bestimmten durch die Einheit, die vom fluorogenen Substrat als Folge der Enzym-vermittelter Depolymerisation Substrat gespalten wird erzeugt. Daher ist Schritt 5 (Substratzugabe) kritisch und muß, um die Zeit zwischen dem, wenn das Substrat den Boden gegeben und wenn die Assays inkubiert werden minimiert so effizient wie möglich durchgeführt werden. Ebenso, wenn das Substrat in Kontakt mit der Probe, werden enzymatische Reaktionen aufzutreten beginnen. Wir empfehlen die Verwendung eines Multi-Channel-Pipette aus diesem Grund. Es wird dringend empfohlen, sich effizient mit Hilfe der Multi-Kanal-Pipette vor dem Tag Sie die Durchführung Ihrer Enzym-Assays. Um dies zu erreichen, können Sie Pipettieren mit Wasser üben, bis Sie leicht Mengen übertragen in die 96-Well-Platten mit der Pipette. Boden Abschrecken Quenchen bezeichnet Abnahme der Fluoreszenzintensität von Partikeln und / oder organisches Material in den Boden Schlämme-Inkubationen 26 verursacht. Pufferverhältnisse 25: Abschrecken kann durch Einstellen der Boden beeinflusst werden. Aufgrund der Hintergrundfluoreszenz von einzelnen Proben, ist es entscheidend, um Standards mit Proben für den Hintergrund (Abschrecken) Fluoreszenz-Konto laufen. Obwohl einige Protokolle verwenden einen einzigen Zusammenschluss, nach der Prüfung, dass das Signal linear ist, empfehlen wir die Durchführung einer Standard-Löschsteuerung für jede Probe, um beste Kontrolle für die Auswirkungen der Abschreckung. Andernfalls wird in einem Stand führenStandardkurve nicht auf die Probe und eine falsche Einschätzung der enzymatischen Aktivität. Die Zugabe von Standards zu Boden Aufschlämmungen ist nicht zeitempfindlich, da die Standardadditions beeinflusst nicht die Hintergrundfluoreszenz von der Probe. NaOH-Zugabe Die Zugabe von NaOH wird in einigen Protokollen zur fluorimetrischen Messungen der Enzymaktivität zu optimieren, da der Fluoreszenzfarbstoff aus den synthetischen Substraten freigesetzt zeigt Peak-Fluoreszenz bei pH&gt; 9,0 26,49. Wenn man diesen Vorschlag wird die NaOH-Konzentration erforderlich, um den Boden Aufschlämmungs-pH (dh pH&gt; 9) in Abhängigkeit von der bestimmten Boden variieren, und der pH-Puffer 26 verwendet. Jedoch argumentieren andere, dass NaOH nicht notwendig sein, da die Signalintensität ist im Allgemeinen sehr hoch, auch bei niedrigeren pH-Wert, und weil es eine zusätzliche Quelle für Messfehler führt. Zum Beispiel wurde die Wirkung von NaOH auf pH der Aufschlämmung Zusätze und damit MUB oder MUC fluorescence 25 Veränderungen über die Zeit. MUB verknüpft Substraten haben gezeigt, dass konsequente erhöhte Fluoreszenz für 20 min NaOH folgende Ergänzungen vor Ebenen verjüngen demonstrieren, während MUC hat stetige zeigten verringerte Fluoreszenz für bis zu 60 min 26. Daher ist es wichtig, die Zeit zwischen Zugabe von NaOH und Fluoreszenzmessung zu standardisieren. Alternativ, wenn Fluoreszenzwerte sind ausreichend nachweisbar ohne Zugabe, die Durchführung der Tests ohne Zugabe von NaOH wurde als gleichermaßen akzeptable Alternative 26 vorgeschlagen worden. Temperatur Temperaturempfindlichkeit sollte bei der Entscheidung Inkubationstemperatur genommen werden. Wenn das primäre Interesse ist das Verständnis Enzymkinetik, mit drei oder mehr Temperaturen, wie dargestellt, mit Arrhenius-Plots (im Ergebnisteil) ist ein robustes Konzept. Wenn die Probe Seite hat charakteristisch niedrigen Temperatur, wie Permafrostboden, dann die duration der Inkubation kann müssen erweitert werden, um für die Enzyme, um in den kälteren Temperaturen Inkubation reagieren können. Während traditionelle Enzymkinetik legt nahe, dass eine Erhöhung der Temperatur sollte zu einer erhöhten Enzymaktivität zur Folge haben wir festgestellt, daß Enzyme können ortsspezifische in Bezug auf die Temperaturempfindlichkeit 50 sein. Daher ortsspezifischen Enzymaktivität Potential verstehen, ist es wichtig, dass der Inkubationstemperatur und-dauer eingestellt werden, um Feldwerte Ort zu reflektieren. Abschluss AgE sind wichtige Treiber der biogeochemischen Prozesse in Böden und damit müssen wir in der Lage, ihre Aktivitäten zu messen. Es gibt viele Herausforderungen zu Mess EEA in Böden, einschließlich Störungen und Hemmung. Trotz dieser Herausforderungen können standardisierte Protokolle (wie das hier beschrieben) universell einsetzbar EAD für eine breite Palette von Enzymen zu messen. Zwar ist es ziemlich einfach, Qualitätsdaten zu generieren folgende dieser Protokolle, die inInterpretation dieser Daten in einem ökologischen Kontext erfordert eine sorgfältige Prüfung, was diese Tests sind wirklich messen, und wie EEA unter Testbedingungen können sich von denen unter in-situ Bedingungen abweichen.

Extrazelluläre Enzyme (EBS) durch Bodenbakterien, Pilze, Archaeen und produziert in unzähligen biogeochemischen Prozessen beteiligt und sind von zentraler Bedeutung für die Verarbeitung, Stabilisierung und Destabilisierung von Humus-und Nährstoffkreislauf in terrestrischen Ökosystemen ein. Durch die Herstellung von AgE-, Boden-Mikroben zersetzt und verwandeln polymere organische Materie in kleinere lösliche Moleküle, wodurch die zuvor gebundenen Mikro-und Makronährstoffe, die Pflanzen und Mikroben zu Verfügung Nährstoffe aus dem Boden aufnehmen können befreien. EEs seit Jahrzehnten vorwiegend durch Messung ihrer Aktivitäten in Laborassays 2-4 untersucht worden, da es sehr schwierig ist, direkt zu erfassen und zu quantifizieren, Enzyme. Extrazelluläre Enzymaktivität (EEA) wird am stärksten von der Konzentration der Enzyme und der entsprechenden Substrate gesteuert. Die Fülle an verschiedenen C-, N-und P-abbauenden Enzyme im Boden wird von zahlreichen Faktoren beeinflusst iEinschluss von mikrobieller Biomasse, Community-Zusammensetzung, Substratverfügbarkeit, des Mikroklimas und stöchiometrischen Anforderungen 5,6. Jedoch in situ EEA im Bodenumgebung auch durch Temperatur 7,8, die Bindung von Enzymen an Boden Tonen und Huminsäure Eigenschaften 2 und Diffusionsbeschränkungen 9, die letztlich zu regulieren den aktiven Enzympool beeinflusst in Bezug auf Größe, Verfügbarkeit Substrat und Fluktuationsraten 10-12. Daher Anerkennung in-situ-Bodenbedingungen ist kritisch, wenn mit Hilfe von Laborenzymtests der mikrobiellen Funktion über verschiedene Umwelt Websites zu interpretieren. Viele verschiedene Klassen von EWR in Labor-Tests mit einer Vielzahl von synthetischen Substraten quantifiziert werden (siehe &quot;Liste der Reagenzien Tabelle&quot; für weitere Details). Einige Protokolle verwenden Substrate in Assays, die eine kolorimetrische Reaktion, die mit einem Spektrophotometer detektiert werden kann gekoppelt sind, während andere, darunter das Protokoll beschreiben wir hier nutzen Substraten, die zu einer fluoreszierenden Gruppe gebunden sind. Fluoreszenz-EE-Assays sind in der Regel empfindlicher (von einer Größenordnung) als farbmetrischen Tests (die eine chromogene Einheit mit einem synthetischen Substrat verbunden verwenden) 12-14. Empfindlichkeit in EWR-Erkennung beinhaltet zwei Aspekte: eine mit der Menge der Verbindung von zinsbezogenen erkannt und die andere im Zusammenhang mit der niedrigsten nachweisbaren Potential Enzymaktivität. Methoden zur kolorimetrischen P-Nitrophenol (PNP)-basierte Assays können in Vergangenheit gefunden werden, arbeitet 15,16. Kurz gesagt, wird bei optimaler Boden oder Feldrelevanten Temperatur-und pH inkubiert (typischerweise &lt;2 mm und an der Luft getrocknet, gesiebt). Die Rate, mit der das Reaktionsprodukt freigesetzt wird kolorimetrisch mit einem Spektrophotometer 14 bestimmt. Die höhere Empfindlichkeit der Fluoreszenzenzymtests ist zum Teil aufgrund der empfindlicheren Nachweis des fluorogenen Einheit Trennung mit substr verbundenaß Abbau statt Aufzeichnungs Extinktion nach der Trennung von einem spezifischen chromogenen Einheit bei einer bestimmten Wellenlänge. Die beiden am häufigsten verwendeten synthetischen Fluoreszenzindikatoren sind 4-Methylumbelliferon (MUB) 17 und 7-Amino-4-Methyl (MUC) 18,19. MUC-gebundenen Substrate werden häufig mit N reichen synthetischen Substraten, wie Proteinen und / oder Aminosäuren zugeordnet. Leuchtstoff-Techniken wurden zuerst für Wasserproben 20,21 entwickelt, und ihre Anwendung auf Böden erfordert Kontrollen für die Signal Abschrecken und Störungen 22,23. Tests können entweder mit traditionellen &quot;Werkbank&quot; Chemie mit großen Mengen durchgeführt werden, oder in Mikroplatten-basierte Protokolle verwendet werden, mit einem erhöhten Durchsatz aber möglicherweise höhere Messfehler. Während es einige häufig zitierten Protokolle für die Fluoreszenzdetektion von EAD Böden 24, viele Labors verwenden subtile Variationen dieser Protokolle oft versehentlich oder aufgrund eines Unterschiedss in Laboreinrichtungen oder Reagenzien. Scheinbar kleine Unterschiede in den Details der Protokolle können stark gemessen EEA 25,26 beeinflussen und das Fehlen von standardisierten Enzyme macht es schwierig, Tests zwischen verschiedenen Labors kalibrieren. Somit besteht ein hoher Bedarf für die Verbreitung der detaillierten Protokolle, um die Standardisierung der EEA-Assays zu fördern. In unserem Protokoll werden Bodenproben durch die Kombination von Bodenproben mit einem pH-Puffer und Homogenisieren mit einem Mischer hergestellt. Die Aufschlämmungen werden dann mit einem nicht-beschränkenden Menge des fluoreszenzmarkierten C-impft, N-oder P-Substrat reichen, abhängig von der speziellen Fragestellung von Interesse gewählt. Verwendung von Schlämmen in den Boden Enzymassays dient als Kontrolle zur Substratdiffusionsbeschränkungen minimiert. Die fluoreszierende Einheiten werden abgeschreckt, bis sie von ihren jeweiligen Substrate gespalten, und damit die Enzymaktivität nachgewiesen werden kann als der fluoreszierende Farbstoff aus dem Substrat freigesetzt bY eine Enzym-katalysierte Reaktion. Die Erhöhung der Fluoreszenzintensität über der Zeit reflektiert die Geschwindigkeit der Enzym-katalysierten Reaktion. Das allgemeine Konzept der Fluoreszenz-Enzym-Assay ist, dass synthetische Substrate, die mit einem fluorogenen Gruppierung (Fluoreszenzfarbstoff) gebunden sind, werden Bodenproben 27 aufgenommen. Während der enzymkatalysierten Substratabbau, bricht die Bindung zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Substrat. Der Fluoreszenzfarbstoff von dem Substrat freigesetzt wird folglich als eine indirekte Bewertung der Enzymaktivität verwendet wird, und kann unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät, um die Fluoreszenzintensität des Farbstoffs zu erfassen quantifiziert werden. Kurz gesagt, wird die Fluoreszenz Quantifizierung erreicht, wie der freigesetzte Farbstoff emittiert Licht einer Wellenlänge nach Absorption von Licht mit einer anderen Wellenlänge. Die Intensität der Fluoreszenz wird von einem Plattenlesegerät für sowohl Anregung und Detektion aufgezeichnet. Enzymaktivität kann anschließend auf der Grundlage der bekannten Fluoreszenzfarbstoff conce quantifiziertntrations des Substrats (dh bekannte Mengen an synthetischen Substrat Bodenproben hinzugefügt) mit Bezugnahme auf eine Standardverdünnungskurve der Fluoreszenzintensitäten für die spezifischen fluorogenen Gruppierung der im Assay (dh 4-Methylumbelliferon (MUB) oder 7-Amino verwendete Substrat -4-Methyl (MUC)). (Bitte beachten Sie die Protokollabschnitt für spezifische Details auf die Enzymaktivität Quantifizierung). Laborbodenenzymtests sind nützlich für die Beurteilung der mikrobiellen Gemeinschaft Funktion, aber es gibt einige technische Einschränkungen, die Nutzer sollten 10 zu erkennen. Fluoreszenz-Assays können vor Störungen durch Verunreinigungen und / oder Instabilität vieler fluoreszierenden Verbindungen, wenn sie Licht ausgesetzt erleiden, so ist Vorsicht bei der Handhabung fluoreszierende Substrate 25. Bodenpartikel und / oder organische Material in den Boden Aufschlämmungen können auch mit Fluoreszenzintensitäten als Löscheffekt 26 bekannt stören.Außerdem Labor Enzymtests beurteilt nur potenzielle EEA unter Laborbedingungen. In-vitro-Tests messen EEA unter Bedingungen, wo Substrat Diffusion und Fülle ist nicht einschränkende. Daher können die Daten, die von diesen Tests vorgesehen nicht ein guter Proxy für EAD unter in-situ Bodenbedingungen 10. Insgesamt ist die Enzymaktivität sehr nützlich für relative Vergleiche, in denen Bodenarten ähnlich sind. Wenn jedoch diese Methode, um Aktivitäten zwischen Böden, die in physikalischen oder chemischen Eigenschaften unterscheiden zu vergleichen, ist Vorsicht geboten. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass Unterschiede in der Bodentyp und der Temperatur kann der Zustand der in situ Enzymkinetik drastisch verändern. Eine weitere Einschränkung ist, dass relativ wenige Substrate sind im Handel erhältlich (im Vergleich zu der natürlichen Umgebung). Darüber hinaus sind die synthetischen Substraten für Enzymtests verwendet relativ einfachen (leicht löslich) nicht genau stellen die gegenwärtigen oder availabl Bodensubstratene in situ. Ein weiterer Faktor ist, dass die Verwendung von Boden Schlämmen wird die Aktivität einiger Enzyme stabilisiert (dh von organischer Substanz oder Tone immobilisiert), die nicht aktiv sein können unter in-situ Bedingungen 2 zu integrieren. Laborenzymtests auch nicht bieten Informationen über das Fortbestehen der Enzyme im Boden (Enzymumsatzraten) oder Informationen zu den spezifischen mikrobiellen Spezies, die Herstellung von schmutz Enzyme.

<table><tbody><tr><td><stark>Reagenzien: </stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &alpha;-D-Glucopyranosid (AG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9766</td><td>Zuckerabbau</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &beta;-D-Glucopyranosid (BG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3633</td><td>Zuckerabbau</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &beta;-D-Cellobiosid (CB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6018</td><td>Celluloseabbau</td></tr><tr><td>L-Leucin-7-amido-4-methylcumarinhydrochlorid (LAP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2145</td><td>Proteinabbau</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&beta;-D-glucosaminid (NAG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2133</td><td>Chitinabbau</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferylphosphat (PHOS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8883</td><td>Phosphormineralisierung</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl-&beta;-D-Xylopyranosid (XYL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7008</td><td>Hemicelluloseabbau</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferon (MUB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>7-Amino-4-methylcumarin (MUC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9891</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Natriumacetat wasserfreier Puffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>saure und neutrale Böden</td></tr><tr><td>50 mM Tris Basispuffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>basic soils</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware Einweg-Pipettierreservoirs</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-65</td><td>Pipettierreservoir</td></tr><tr><td>Elektronisch; Eppendorf Xplorer; </td><td>8-Kanal-Pipette Fisher</td><td>Scientific 13-684-265</td><td>8-Kanal, Messbereich: 50-1.200 &mu; l</td></tr><tr><td>TipOne 101-1.250 μm; l verlängerte Länge natürliche Spitzen</td><td>USA Scientific</td><td>1112 - 1720</td><td>10 Racks mit 96 Spitzen (960 Spitzen)</td></tr><tr><td>Kochplatte; Heizfläche: 10 Zoll x 10 Zoll.</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-100SH</td><td>Laborscheibe magnetische Rührplatte</td></tr><tr><td>Waring Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-509-7P</td><td>Zweistufig; 1 L (34 oz) Edelstahlbehälter</td></tr><tr><td>MARKE Dispensette III Flaschenaufsatzspender</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-688-231</td><td>Spender; Reichweite: 5-50 ml</td></tr><tr><td>Wheaton Unispense & mu; P peristaltische Pumpen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683-7</td><td>Optionaler Spender</td></tr><tr><td>Fisherbrand magnetischer Rührstab</td><td>Fisher Scientific</td><td>1451363SIX</td><td>Wird zum Rühren von Bodenaufschlämmung nach dem Mischen</td></tr> verwendet <tr><td>Pyrex Glasschalen</td><td>World Kitchen</td><td>5304218</td><td>Pyrex 10 oz Puddingbecher mit Rand</td></tr><tr><td>Costar 96-Well schwarze feste Platten</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td>Wird für den Schritt des Tellerlesers verwendet</td></tr><tr><td>Costar 96-Well-Assay-Blöcke</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-700</td><td>V-Boden; 2 ml; steril</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 96-Well-Deckelmatten</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-93</td><td>Sterile 96-Well-Deckelmatte für quadratische Wells</td></tr><tr><td>Zentrifuge mit Halterungen für Deep-Well-Platten</td><td>Thermo Scientific</td><td>3121</td><td>Centra-GP8 (dieses Modell ist nicht mehr erhältlich)</td></tr><tr><td>Multifunktionaler Mikroplatten-Reader der Tecan Infinite 200 Serie</td><td>Tecan</td><td>30016058</td><td>Plate Reader (dieses Modell ist nicht mehr verfügbar)</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-fluorometric messung der boden mögliche extrazelluläre enzymaktivitäten

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Mikroben in Böden und anderen Umgebungen produzieren extrazelluläre Enzyme zu Depolymerisation und Hydrolyse von organischen Makromolekülen, so dass sie für Energie und Nährstoffe aufgenommen werden können. Mess mikrobiellen Enzymaktivität ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis Ökosystem Boden funktionelle Dynamik. Das allgemeine Konzept der Fluoreszenz-Enzym-Assay ist, dass synthetische C-, N-oder P-reiche Substrate mit einem Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind an Bodenproben zugegeben. Wenn intakte, werden die markierten Substraten nicht fluoreszieren. Die Enzymaktivität wird als der Anstieg in der Fluoreszenz, da die Fluoreszenz-Farbstoffe sind von ihren Substraten, die sie fluoreszieren können gespalten gemessen. Enzymmessungen können in Einheiten von Molarität oder Aktivität ausgedrückt werden. Um diesen Test durchzuführen, werden Boden Aufschlämmungen durch Kombinieren Boden mit einem pH-Puffer hergestellt. Der pH-Puffer (typischerweise ein 50 mM Natriumacetat oder 50 mM Tris-Puffer), wird für bestimmte Säurekonstante (pKa) des Puffers, um am besten entsprechen den Boden sa gewähltmple pH-Wert. Die Boden Aufschlämmungen werden mit einer nicht beschränkenden Menge des fluoreszenz (dh C-, N-oder P-reich) markierten Substrat inokuliert. Mit Boden Slurries im Assay dient der Beschränkungen, die Enzym und Substrat Diffusions minimieren. Daher ist diese Testkontrollen für Unterschiede in Substrat Einschränkung Diffusionsraten und pH-Bedingungen Boden; somit Potentialerfassungs-Enzymaktivität Raten als eine Funktion der Differenz in der Enzym-Konzentrationen (pro Probe). Fluoreszenz-Enzym-Assays sind in der Regel empfindlicher als spektrophotometrische (dh farbmetrischen)-Assays, kann aber von Störungen durch Verunreinigungen und der Instabilität der vielen fluoreszierenden Verbindungen, wenn sie Licht ausgesetzt erleiden, so ist Vorsicht geboten beim Umgang mit fluoreszierenden Substraten. Ebenso diese Methode beurteilt nur potentielle Enzymaktivitäten unter Laborbedingungen, wenn Substrate sind nicht einschränkend. Bei der Interpretation der Daten, die Quer ist Vorsicht gebotenOrt Vergleiche mit unterschiedlichen Temperaturen oder Bodenarten, wie in-situ-Bodentyp und Temperatur können Enzymkinetik beeinflussen.

Um mögliche Raten des Bodens extrazelluläre Enzymaktivitäten zu messen, werden synthetische Substrate, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff gebunden werden Bodenproben zugegeben. Die Enzymaktivität wird gemessen, wie der Fluoreszenzfarbstoff von dem Substrat durch eine Enzym-katalysierte Reaktion, in denen höhere Fluoreszenz zeigt mehr Substratabbau freigegeben.

Hochdurchsatz-Fluorometric Messung der Boden Mögliche Extrazelluläre Enzymaktivitäten

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die maximalen potenziellen Raten zu quantifizieren, mit denen extrazelluläre Enzyme im Boden ihre Zielsubstrate abbauen. Dies wird erreicht, indem zunächst feuchter Feldboden und Puffer in einem Mixer miteinander vermischt werden. Anschließend werden die gemischten Proben per Pipette in eine Tiefformat-Probenplatte und Tiefformat-Standardplatten überführt. Die Tiefformatplatten werden inkubiert und zentrifugiert, bevor 250 µL von jedem Wells der Tiefformatplatten in die entsprechenden Wells einer schwarzen Platte mit flachem Boden übertragen werden.96-Well-Platten. Die drei Platten werden anschließend im Fluorimeter erneut gemessen und die erhaltenen Daten analysiert. Letztendlich werden potenzielle extrazelluläre Bodenenzymaktivitäten anhand der Rate bestimmt, mit der fluoreszierender Farbstoff durch eine enzymkatalysierte Reaktion vom Substrat freigesetzt wird, wobei eine höhere Fluoreszenz auf stärkere Substratabbau hinweist.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt in der Möglichkeit, Enzymaktivitäten in einer großen Anzahl von Proben zu messen, indem das tiefe 96-Well-Mikroplattenformat genutzt wird. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir die Gelegenheit erkannten, das Probenvolumen im Vergleich zur Standardmikroplatte zu erhöhen, indem wir andere Protokolle an das Tieftropfplattenformat anpassten. Die Konsequenzen dieser Technik ermöglichen es uns, mikrobielle Physiologie besser mit ökosystemaren Prozessen zu verknüpfen.Die visuelle Demonstration ist für diese Technik entscheidend, da es zahlreiche Feinheiten und Handhabungsschritte bei der Probennahme gibt, die in einer schriftlichen Anleitung nur schwer nachzuvollziehen sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen mikrobielle Ökologie und bodenbezogene Biogeochemie zu beantworten, beispielsweise wie Bodenmikroben auf Veränderungen in ihrem Umfeld reagieren und wie ihre physiologischen Reaktionen wichtige ökologische Prozesse wie Zersetzung und Nährstoffkreisläufe beeinflussen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Zersetzung von organischer Bodensubstanz, in Nährstoffkreisläufe und terrestrische Ökosysteme ermöglicht, kann sie ebenso auf marine und limnische Systeme angewendet werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit den Pipettierfähigkeiten und Problemen im Zusammenhang mit der Zeitempfindlichkeit dieses Protokolls. Darüber hinaus kann die große Menge an Daten, die bei diesem Verfahren generiert wird, für Erstanwender manchmal überwältigend sein. Um die Assay-Präparation zu beginnen, beschriften Sie drei Tieflochplatten als Probe, MUB-Standards für vier Methyl und Beone sowie MUC-Standards für sieben Amino vier Methylcoumarin.Geben Sie jeden Standard und jedes Substrat in separate, saubere, vorab beschriftete Reservoirs, die in Reihen angeordnet sind. Pipettieren Sie dann den entsprechenden MUB-Standard in die zugehörigen Vertiefungen der MUB-Standardplatte, wie im textlichen Protokoll aufgeführt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die MUC-Standards in die entsprechenden Vertiefungen der MUC-Standardplatte, um die Bodenschlämme vorzubereiten.Für jede Bodenprobe 2,75 Gramm feuchten Feldboden abwiegen, bevor er einem Mixer zugegeben wird. 91 Milliliter eines 50 Millimolar-Puffers hinzufügen und eine Minute lang auf höchster Stufe mischen. Den Inhalt des Mixers in eine saubere Glaswanne gießen, die mindestens so breit ist wie eine Acht-Kanal-Pipette mit einem Rührstab.Der Bodenschlamm kann vor dem Einfüllen in die Schale durch ein etwa ein Millimeter großes Sieb abgegossen werden. Stellen Sie die Schale auf eine Rührplatte und mischen Sie den Bodenschlamm. Danach pipettieren Sie 800 Mikroliter Bodenschlamm in die erste Spalte der Probenschale.Wiederholen Sie dasselbe für die erste Spalte der MUB-Standard- und MUC-Standardplatten. Spülen Sie den Mixer, den Rührplatte und den Rührstab zwischen den Bodenproben mit entionisiertem Wasser oder Puffer ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Bodenprobe.Wechseln Sie bei jeder nachfolgenden Probe zur nächsten Spalte. Danach pipettieren Sie das entsprechende Substrat in die zugehörigen Vertiefungen der Probenplatte. Wie im textbasierten Protokoll aufgeführt, bereiten Sie eine Probenplatte für jede zu testende Inkubationstemperatur vor.Versiegeln Sie die Deep-Well-Platten mit Plattenmatten. Drehen Sie jede versiegelte Platte von Hand um, bis die Lösung gründlich gemischt ist. Stellen Sie die Platten in den entsprechenden Inkubator für die im Textprotokoll angegebene Inkubationszeit. Notieren Sie die Anfangszeit als Zeitpunkt null sowie die entsprechenden Inkubationszeiten am Ende jedes Inkubationszeitraums.Zentrifugieren Sie die verschlossenen Platten drei Minuten lang bei etwa 2.900 ×g. Nach der Zentrifugation übertragen Sie 250 Mikroliter aus jedem Well der inkubierten Tiefwellplatten in die entsprechenden Wells schwarzer flacher 96-Well-Platten. Eine schwarze Platte wird für jede inkubierte Tiefwellplatte verwendet.Es ist wichtig, die Proben gemäß den Herstelleranweisungen für den verwendeten Flora-Metric-Plattenreader aus den inkubierten Deep-Well-Platten in die entsprechenden Vertiefungen der schwarzen 96-Well-Platten mit flachem Boden zu überführen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 365 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 450 Nanometer ein.Laden Sie eine der Standardplatten, stellen Sie das Fluorimeter auf automatische Verstärkung ein und lesen Sie die Platte ab. Danach stellen Sie die Verstärkung auf manuell und verringern den Wert von optimal auf die nächstniedrigere auf fünf gerundete Zahl. Wiederholen Sie für jede Standardplatte die Messung zweimal pro Platte.Laden Sie als Nächstes die Probenplatte. Stellen Sie den Verstärkungsfaktor auf automatisch und führen Sie die Probenplatte aus. Führen Sie die Probenplatte manuell erneut aus, um den höchsten Verstärkungsfaktor für jede der Standardplatten anzupassen.Beginnen Sie die Datenanalyse, indem Sie die Fluoreszenzdaten der Standardkurve für den MUB- und MUC-Standard in eine Tabellenkalkulation eingeben. Konvertieren Sie die mikromolaren Konzentrationen in Mikromol für jede Probe. Verwenden Sie die Fluoreszenzdaten der Standardkurve, um die Steigung, den y-Achsenabschnitt und die R-Quadrat-Werte für die MUB- und MUC-Standardkonzentrationen zu berechnen.Akzeptable r-Quadrat-Werte sollten für jede Probe 0,98 überschreiten. Standardkurven können in einem Streudiagramm veranschaulicht werden, bei dem die Fluoreszenzablesungen als abhängige Variable und die Standardkonzentration als unabhängige Variable aufgetragen werden. Geben Sie die Rohfluoreszenzdaten der Probe inklusive Substrat in eine neue Tabellenkalkulation ein.Geben Sie außerdem die Inkubationszeit und die Trockenmasse des Bodens für jede Probe an, subtrahieren Sie die Achsenabschnittswerte der Standardkurve von den entsprechenden Fluoreszenzwerten der Probe und dividieren Sie anschließend durch die Steigung der entsprechenden Standardkurve. Multiplizieren Sie unter Verwendung der Gleichung der Standardgeraden die Mikromol der Probe mit 91 Milliliter, dem im Bodensuspensionsexperiment verwendeten Puffervolumen. Dividieren Sie den erhaltenen Wert durch die für die Probe spezifische Inkubationszeit und die Masse des trockenen Bodens.Zum Schluss den erhaltenen Wert mit 1000 multiplizieren, um die gewünschten Einheiten zu erhalten. Die Ergebnisse stammen aus einer experimentellen Klimastudie, in der Böden, die unter natürlichen Klimabedingungen standen, mit Böden verglichen wurden, die erhöhten Kohlendioxidkonzentrationen und Erwärmungsbehandlungen ausgesetzt waren. Dargestellt sind hier potenzielle extrazelluläre Enzymaktivitäten (EEAs) am Prärie-Erwärmungs- und Kohlendioxid-Anreicherungsstandort in Kontroll- und Behandlungsparzellen. In diesem Beispiel unterschieden sich die potenziellen Enzymaktivitäten zur Aufnahme von Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor in Bodentiefen von null bis fünf Zentimetern nicht zwischen den experimentellen Behandlungen.Jedoch wiesen mehrere potenzielle EEAs bei Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern signifikante Unterschiede auf. Beispielsweise waren die kohlenstoffabbauenden Enzyme Beta-1,4-Glucosidase und Beta-D-Cellobiasa in den mit erhöhtem Kohlendioxid und Erwärmung behandelten Parzellen im Vergleich zu den Parzellen unter natürlichen Klimabedingungen niedriger; ebenso waren die stickstoff- und phosphormineralisierenden Enzyme in den Behandlungsparzellen niedriger als unter natürlichen Klimabedingungen. Bei Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern.Die Berechnung und Darstellung der Summe aller potenziellen Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Phosphorkreislauf-EEAs kann eine nützliche Methode sein, um umfassendere Muster bezüglich des potenziellen Boden-Kohlenstoff-, -Stickstoff- und -Phosphorkreislaufs zu beobachten. In diesem Beispiel wurde die Summe der potenziellen EEAs von Beta-1,4-Glucosidase, Beta-D-Cellobiohydrolase, Beta-Xlosidase und Alpha-1,4-Glucosidase berechnet, um die potenziellen Aktivitäten des Kohlenstoffkreislaufs darzustellen. Die Summe der potenziellen EEAs von Beta-1,4-N-Acetylglucosaminidase und L-Leucin-Aminopeptidase wurde berechnet, um die potenziellen Aktivitäten des Stickstoffkreislaufs darzustellen.Phosphatase wurde verwendet, um potenzielle Phosphor-Kreislaufaktivitäten darzustellen. Potenzielle EEAs für den Gesamtkohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorkreislauf waren in den mit erhöhtem Kohlendioxid und Erwärmung behandelten Parzellen im Vergleich zu den Parzellen unter natürlichen Klimabedingungen in Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern tendenziell niedriger. Dieser Trend war jedoch nur für die Gesamtaktivitäten des Stickstoff- und Phosphorkreislaufs signifikant, und die mikrobiellen Aktivitäten im Boden (EEAs) unterschieden sich zwischen den Behandlungsparzellen nicht signifikant.Bei einer Bodentiefe von null bis fünf Zentimetern. Die Ergebnisse deuten auf entgegengesetzte Trends bei der Enzymaktivität und der funktionellen Gruppe zwischen den Behandlungsparzellen in Abhängigkeit von der Bodentiefe hin; das Verhältnis potenzieller extrazellulärer Enzymaktivitäten (EEAs) ist eine Möglichkeit, den mikrobiellen Nährstoffbedarf zu bewerten. Hier unterscheiden sich die Aktivitäten von Bodenenzymen, Tochi-Geometrie, Kohlenstoff-zu-Stickstoff-, Kohlenstoff-zu-Phosphor- oder Stickstoff-zu-Phosphor-Verhältnissen signifikant zwischen den Behandlungsparzellen bei einer Bodentiefe von null bis fünf Zentimetern.Jedoch waren die potenziellen Enzym-Carbon-zu-Phosphor- und Stickstoff-zu-Phosphor-Verhältnisse in den mit erhöhtem Kohlendioxid und Erwärmung behandelten Parzellen höher. Im Vergleich zu den ambienten Klimabedingungen können Temperaturen in Bodentiefen von fünf bis fünfzehn Zentimetern stark die bodeneigenen EEAs beeinflussen. In typischen Laboranalysen werden Bodenenzyme jedoch bei einer einzigen Temperatur gemessen, die möglicherweise nicht den Bedingungen bei C zwei Temperaturen entspricht.Aran-Diagramme dienen der Visualisierung der Aktivierungsenergie und werden durch Auftragen des Logarithmus der Enzymaktivität in Abhängigkeit von der inversen Temperatur, umgerechnet in Kelvin, auf der x-Achse erstellt. Die Aktivierungsenergie wird üblicherweise als die minimale Energie definiert, die erforderlich ist, um eine chemische Reaktion zu katalysieren, und wird hier als Proxy für die Temperaturabhängigkeit enzymkatalysierter Reaktionen verwendet. Eine höhere Aktivierungsenergie weist auf eine größere Temperaturempfindlichkeit des Enzyms hin.Ebenso entsprechen Aktivierungsenergien direkt den Q10-Temperaturkoeffizienten. Die potenziellen Enzymkinetiken für kohlenstoff-, stickstoff- und phosphorabbauende EEAs wurden in beiden Behandlungsparzellen in zwei Bodentiefen untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass die Temperatursensitivität der EEAs in keiner der beiden Bodentiefen zwischen den Behandlungsparzellen signifikant unterschiedlich war. Sobald der Vorgang beherrscht ist, können 12 Proben in 30 Minuten oder weniger in die 96er-Rad-Mikrotiterplatten eingepflanzt werden.Außerdem können Sie nach den vorgeschriebenen Inkubationszeiten die Platten typischerweise innerhalb einer halben Stunde nach dem Zentrifugieren, Übertragen und erneuten Messen am Urometer ablesen. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, konsistent zu pipettieren. Jede Luftblase beim Pipettieren beeinträchtigt Ihre Ergebnisse nachteilig. Dieses Verfahren befolgen.Andere Methoden wie die DNA-Extraktion und Sequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Rolle der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Boden für die Bodenfunktion nach ihrer Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der mikrobiellen Ökologie, um Nährstoffkreisläufe und biogeochemische Prozesse in terrestrischen Ökosystemen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine sehr gute Vorstellung davon haben, wie potenzielle Enzymaktivitäten quantifiziert werden können.Außerdem sollten Sie in der Lage sein, die Daten dahingehend zu interpretieren, wie sich mikrobielle Reaktionen auf Faktoren wie Klima und unterschiedliche Bodentypen in verschiedenen Ökosystemen auswirken können. Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit fluoreszierenden Materialien stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um die Lichteinwirkung aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Fluorophore zu minimieren.

high-throughput-fluorometric-measurement-potential-soil-extracellular

Research

Forschung

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