Hochdurchsatz-Fluorometric Messung der Boden Mögliche Extrazelluläre Enzymaktivitäten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die maximalen potenziellen Raten zu quantifizieren, mit denen extrazelluläre Enzyme in Böden ihre Zielsubstrate abbauen. Dies wird erreicht, indem zunächst feuchte Felderde und Puffer in einem Mischer kombiniert und dann die gemischten Proben in eine Deep-Well-Probenplatte und Deep-Well-Standardplatten pipettiert werden. Die Vertiefungsplatten werden inkubiert und zentrifugiert, bevor 250 Mikroliter aus jeder Vertiefung der Vertiefungsplatten in die entsprechenden Vertiefungen mit schwarzem Flachboden überführt werden.

96-Well-Platten. Die drei Platten werden dann auf dem Fluorimeter rot dargestellt und die resultierenden Daten werden analysiert. Letztendlich werden potenzielle extrazelluläre Enzymaktivitäten im Boden durch die Geschwindigkeit bestimmt, mit der Fluoreszenzfarbstoff durch eine enzymkatalysierte Reaktion aus dem Substrat freigesetzt wird, wobei eine höhere Fluoreszenz auf einen stärkeren Substratabbau hinweist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist die Möglichkeit, die Enzymaktivitäten in einer großen Anzahl von Proben zu messen, indem das tiefe 96-Well-Mikroplattenformat genutzt wird. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir die Möglichkeit sahen, das Probenvolumen im Vergleich zu Standard-Mikroplatten zu erhöhen, indem wir andere Protokolle an das Deep-Well-Plattenformat anpassen. Die Implikationen dieser Technik ermöglichen es uns, die mikrobielle Physiologie besser mit Prozessen im Ökosystemmaßstab zu verknüpfen.

visuelle Demonstration ist für diese Technik von entscheidender Bedeutung, da es viele Nuancen und die Handhabung von Proben gibt, die in einem schriftlichen Verfahren nicht einfach zu befolgen sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen mikrobielle Ökologie und Bodenbiogeochemie zu beantworten, z. B. wie Bodenmikroben auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren und wie sich ihre physiologischen Reaktionen auf kritische Ökosystemprozesse wie Zersetzung und Nährstoffkreislauf auswirken. Obwohl diese Methode Einblicke in die Zersetzung der organischen Substanz im Boden und des Nährstoffkreislaufs sowie der terrestrischen Ökosysteme geben kann, kann sie auch auf Meeres- und Süßwassersysteme angewendet werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Probleme mit Pipettierfähigkeiten und Zeitempfindlichkeitsproblemen im Zusammenhang mit diesem Protokoll. Darüber hinaus ist die große Datenmenge, die bei diesem Verfahren generiert wird, für Erstanwender manchmal überwältigend. Um mit der Einrichtung des Assays zu beginnen, beschriften Sie drei Deep-Well-Platten als Proben-MUB-Standard für vier Methyl- und Beone-Platten und MUC-Standard für sieben Amino-Vier-Methyl-Cumarin.

Gießen Sie jeden Standard und jedes Substrat in separate, saubere, vorbeschriftete Behälter, die in Reihen ausgerichtet sind. Pipettieren Sie dann den entsprechenden MUB-Standard in die entsprechenden Vertiefungen der MUB-Standardplatte, wie im Textprotokoll aufgeführt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die MUC-Standards in den entsprechenden Vertiefungen der MUC-Standardplatte, um Bodenschlämme vorzubereiten.

Wiegen Sie für jede Bodenprobe 2,75 Gramm feuchte Felderde, bevor Sie sie in einen Mixer geben. 91 Milliliter und einen 50-Millimolar-Puffer hinzufügen und eine Minute lang auf hoher Stufe mixen. Gießen Sie den Inhalt des Mixers in eine saubere Glasschüssel, die mindestens so groß ist wie eine Achtkanalpipette mit einem Rührstab.

Die Erdgülle kann durch ein etwa einen Millimeter großes Sieb gesägt werden, bevor sie in die Schüssel gegossen wird. Stellen Sie die Schüssel auf eine Treppenplatte und mischen Sie die Erdaufschlämmung. Pipettieren Sie dann 800 Mikroliter Bodengülle in die erste Säule der Probenplatte.

Machen Sie dasselbe für die erste Spalte der MUB-Standard- und MUC-Standardplatten. Spülen Sie den Mixer, die Rührplatte und den Rührstab mit entionisiertem Wasser aus oder puffern Sie ihn zwischen den Bodenproben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Bodenprobe.

Wechseln zur nächsten Spalte mit jeder nachfolgenden Stichprobe. Pipettieren Sie anschließend das entsprechende Substrat in die entsprechenden Vertiefungen der Probenplatte. Wie im Textprotokoll aufgeführt, bereiten Sie für jede zu testende Inkubationstemperatur eine Probenplatte vor.

Versiegeln Sie die Deep-Well-Platten mit Plattenmatten. Drehen Sie jede versiegelte Platte von Hand um, bis die Lösung gründlich gemischt ist. Legen Sie die Platten in den entsprechenden Inkubator für die erforderliche Inkubationszeit, wie im Textprotokoll aufgeführt, zeichnen Sie die Anfangszeit als Zeitpunkt Null sowie die entsprechenden Inkubationszeiten am Ende jeder Inkubationszeit auf.

Die versiegelten Platten werden drei Minuten lang bei etwa 2.900 G zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden 250 Mikroliter aus jeder Vertiefung der inkubierten Vertiefungsplatten in die entsprechenden Vertiefungen der schwarzen Ebene übertragen. Untere 96-Well-Platten. Für jede inkubierte Deep-Well-Platte wird eine schwarze Platte verwendet.

Es ist wichtig, Proben aus den inkubierten Deep-Well-Platten in die entsprechenden Wells in der schwarzen Wohnung zu überführen. Untere 96-Well-Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers für den verwendeten Flora-Metrik-Plattenleser. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 365 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 450 Nanometer ein.

Legen Sie eine der Standardplatten ein, stellen Sie das Fluorimeter auf automatische Verstärkung ein und lesen Sie die Platte ab. Stellen Sie dann die Verstärkung auf manuell ein und verringern Sie den Wert von optimal auf die nächstniedrigere Zahl, gerundet auf die nächste fünf. Wiederholen Sie die Messung für jede Normplatte zweimal.

Laden Sie anschließend die Probenplatte. Stellen Sie die Verstärkung auf automatisch und lassen Sie die Probenplatte laufen. Führen Sie die Probenplatte manuell erneut aus, um die höchste Verstärkung für jede der Standardplatten zu erreichen.

Beginnen Sie mit der Datenanalyse, indem Sie die Fluoreszenzdaten der Standardkurve in eine Tabelle für den MUB- und MUC-Standard eingeben. Rechnen Sie die mikromolaren Konzentrationen für jede Probe in Mikromol um. Fluoreszenzdaten der Standardkurve, berechnen Sie den Y-Schnittpunkt der Steigung und die R-Quadrat-Werte für MUB- und MUC-Standardkonzentrationen.

Akzeptable r-Quadrat-Werte sollten 0,98 für jede Stichprobe überschreiten. Standardkurven können in einem Streudiagramm visualisiert werden, wobei die Fluoreszenzmesswerte als abhängige Variable und die Standardkonzentration als unabhängige Variable dargestellt werden. Geben Sie die Fluoreszenz-Rohdaten der Probe und des Substrats in eine neue Tabelle ein.

Fügen Sie auch die Inkubationszeit und das Trockengewicht des Bodens für jede Probe hinzu, subtrahieren Sie die Schnittpunktwerte der Standardkurve von den entsprechenden Fluoreszenzwerten der Probe und dividieren Sie dann durch die Steigung der entsprechenden Standardkurve. Multiplizieren Sie mit der Standardliniengleichung die Mikromol der Probe mit 91 Millilitern, was dem Puffervolumen entspricht, das in der Bodengülle verwendet wird. Der erhaltene Wert wird durch die spezifische Inkubationszeit der Probe und die trockene Bodenmasse dividiert.

Multiplizieren Sie schließlich den erhaltenen Wert mit 1000, um die gewünschten Einheiten zu erhalten. Es werden Ergebnisse einer experimentellen Klimastudie gezeigt, in der Böden, die Umgebungsklimabedingungen aufwiesen, mit Böden verglichen wurden, die erhöhtem Kohlendioxid ausgesetzt waren, und Erhitzungsbehandlungen, die hier gezeigt werden, sind potenzielle extrazelluläre Enzymaktivitäten oder EEAs an der Prärieheizungs- und erhöhten Kohlendioxidanreicherungsstelle in Kontrollparzellen und Behandlungsflächen. In diesem Beispiel unterschied sich der Assay potenzieller Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorenzym-Akquisitionsaktivitäten in Bodentiefen von null bis fünf Zentimetern nicht durch die experimentelle Behandlung.

In Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern unterschieden sich jedoch mehrere potenzielle EUAs erheblich. Zum Beispiel waren die kohlenstoffabbauenden Enzyme Beta 1 vier Glucozid und Beta D Cello Biolace in den Aufbereitungsflächen mit erhöhtem Kohlendioxid und Heizung im Vergleich zu den Umgebungsklimabedingungen niedriger. Die Stickstoff- und Phosphormineralisierungsenzyme waren auch in der Aufbereitungsfläche niedriger als die Umgebungsklimabedingungen. Bei fünf bis 15 Zentimetern Bodentiefe.

Die Berechnung und Darstellung der Summe aller potenziellen Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Phosphorkreislauf-EEAs kann ein nützlicher Ansatz sein, um umfassendere Muster in Bezug auf potenzielle Kohlenstoff-, Stickstoff- und/oder Phosphorkreisläufe im Boden zu beobachten. In diesem Beispiel wurde die Summe aus Beta eins vier Glucco, Beta D Cello, Biohydrolase, Beta xlo und Alpha 1 vier Glucco potentielle EEAs berechnet, um potenzielle Kohlenstoffkreislaufaktivitäten darzustellen. Die Summe aus Beta, Eins, vier N, Acetylglukose inmitten von Dase und L-Leucin-Aminopeptidase wurde so berechnet, dass sie potenzielle Aktivitäten des Stickstoffkreislaufs darstellt.

Die Phosphatase wurde verwendet, um mögliche Aktivitäten des Phosphorkreislaufs darzustellen. Die potenziellen EWR-Werte für den Gesamtkohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorkreislauf waren auf den Flächen mit erhöhtem Kohlendioxid- und Wärmebehandlungsvolumen tendenziell niedriger als auf den Flächen mit Umgebungsklimabedingungen in Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern. Dieser Trend war jedoch nur für den gesamten Stickstoff- und Phosphorkreislauf signifikant, und die Boden-EEAs unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Behandlungsflächen.

Bei null bis fünf Zentimetern Bodentiefe. Die Ergebnisse deuten auf gegensätzliche Trends in der Enzymaktivität und der funktionellen Gruppe zwischen den Behandlungsflächen in Abhängigkeit von der Bodentiefe hin, wobei das Verhältnis potenzieller EEAs eine Möglichkeit ist, den mikrobiellen Nährstoffbedarf zu bewerten. Hier unterscheiden sich die Bodenenzyme, die Tochi-Geometrie, die Aktivitäten von Kohlenstoff zu Stickstoff, Kohlenstoff zu Phosphor oder Stickstoff zu Phosphor deutlich zwischen den Behandlungsflächen in Bodentiefen von null bis fünf Zentimetern.

Das potentielle Verhältnis von Enzymkohlenstoff zu Phosphor und Stickstoff zu Phosphor war jedoch in den Parzellen mit erhöhtem Kohlendioxid und Heizungsbehandlung höher. Im Vergleich zu den klimatischen Umgebungsbedingungen in Bodentiefen von fünf bis 15 Zentimetern kann die Temperatur die Boden-EEAs stark beeinflussen. In typischen Laborassays werden Bodenenzyme jedoch bei einer einzigen Temperatur gemessen, die möglicherweise nicht den Temperaturbedingungen von C zwei entspricht.

Aran-Diagramme werden verwendet, um die Aktivierungsenergie zu visualisieren, und werden unter Verwendung des Logarithmus der Enzymaktivität als Funktion der inversen Temperatur, umgerechnet in Grad Kelvin auf der x-Achse, aufgetragen. Die Aktivierungsenergie wird allgemein als die minimale Energie definiert, die erforderlich ist, um eine chemische Reaktion zu katalysieren, und wird hier als Proxy für die Temperaturempfindlichkeit enzymkatalysierter Reaktionen verwendet. Eine höhere Aktivierungsenergie deutet auf eine Empfindlichkeit der Enzymtemperatur hin.

Ebenso entsprechen die Aktivierungsenergien direkt Q 10. Temperaturkoeffizientenwerte Die potentielle Enzymkinetik für Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphor-EEAs wurde zwischen beiden Behandlungsflächen in den beiden Bodentiefen bewertet, und die Ergebnisse zeigten, dass sich die Temperaturempfindlichkeit der EEA zwischen den Behandlungsflächen in beiden Bodentiefen nicht signifikant unterschied. Nach der Beherrschung können 12 Proben in den 96-Rad-Mikrotiterplatten in 30 Minuten oder weniger inokuliert werden.

Darüber hinaus können Sie nach den vorgeschriebenen Inkubationszeiten die Platten in der Regel innerhalb einer halben Stunde erneut auf dem Urometer drehen, übertragen und ablesen, während Sie dieses Verfahren versuchen. Es ist wichtig, konsequent zu pipettieren. Jegliche Luft beim Pipettieren wirkt sich negativ auf Ihre Ergebnisse aus Nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie DNA-Extraktion und -Sequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Rolle der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Boden für die Bodenfunktion nach ihrer Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der mikrobiellen Ökologie den Weg, um den Nährstoffkreislauf und biogeochemische Prozesse in terrestrischen Ökosystemen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine wirklich gute Vorstellung davon haben, wie Sie potenzielle Enzymaktivitäten quantifizieren können.

Darüber hinaus sollten Sie in der Lage sein, die Daten so zu interpretieren, dass sie potenzielle mikrobielle Reaktionen auf Faktoren wie Klima und verschiedene Bodentypen innerhalb verschiedener Ökosysteme widerspiegeln. Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit fluoreszierenden Materialien immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um die Lichteinwirkung aufgrund der Lichtempfindlichkeit des Fluoranteils zu minimieren.