Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, bestätigende Veränderungen zu charakterisieren, die mit der Bindung von Liganden an Kalziumwandler auf einer Zeitskala von unter einer Millisekunde verbunden sind. Der bestätigende Übergang zwischen dem APO-Protein und dem calciumgebundenen Protein wird durch die Photospaltung einer eingesperrten Calciumverbindung Calcium DM nitro ausgelöst, die zur photonen Freisetzung von freiem Calcium führt. Die damit verbundene Änderung des Reflexionsindex wird als Verschiebung des Sondenstrahls mit Hilfe eines vierfach positionsempfindlichen Detektors gemessen.

Als nächstes werden die Ablenkungsspuren des photothermischen Strahls in Abhängigkeit von der Temperatur sowohl für die Probe als auch für die Referenz gemessen. Die Verbindungsanalyse der Ablenkungsspuren des Photostrahls gibt Aufschluss über den Mechanismus des Calcium-induzierten Bestätigungsschalters in Bezug auf Reaktionsvolumen- und Enthalpieänderungen. Der Hauptvorteil der photothermischen Strahlablenkung gegenüber dem bestehenden Mast, wie z.B. der Top-Flow, besteht darin, dass diese Technik eine gleichzeitige Erfassung von Volumen- und Entropieänderungen auf einer Zeitskala von weniger als einer Millisekunde ermöglicht.

Die visuelle Demonstration dieser Technik ist notwendig, da die genaue Ausrichtung des Instruments für die Wiederherstellung thermodynamischer Parameter entscheidend ist. Walter Gonzalez, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Die Probenvorbereitung und alle Probenmanipulationen werden in einem dunklen Raum durchgeführt, um ein unerwünschtes Lösen des Käfigs zu verhindern. In diesem Video werden Schritte im Licht für Filmzwecke demonstriert.

Um mit der Solubilisierung von DM Nitro in 50 Millimolar Haufen zu beginnen, puffern Sie 100 Millimolar Kaliumchlorid, pH 7,0 auf eine Endkonzentration von 400 Mikromolaren. Fügen Sie Calciumchlorid aus der 0,1-molaren Stammlösung hinzu, um das gewünschte Calcium-DN-Nitro-Konzentrationsverhältnis zu erreichen. Als nächstes wird die Referenzverbindung Kaliumcyanid oder Natriumchromat in demselben Puffer aufbereitet.

Was das Beispiel betrifft, so ist im Textprotokoll ein Schema der grundlegenden experimentellen Konfiguration für die photothermische Strahlablenkung zu finden. Beim Einrichten des Experiments propagieren Sie den Prob-Strahl durch die Mitte einer Zelle, die in einem temperaturgesteuerten Zellhalter platziert ist. Stellen Sie dann mit einer Lochblende den Durchmesser des Sondenstrahls auf einen Millimeter ein und zentrieren Sie den Sondenstrahl mit einem zweiten Spiegel hinter der Probe auf die Mitte des positionsempfindlichen Detektors.

Fokussieren Sie den Pro-Strahl auf die Mitte des Detektors, so dass die Differenz in der Spannung zwischen den beiden oberen Dioden und den unteren beiden Dioden sowie die Differenz in der Spannung zwischen den beiden Dioden auf der linken und rechten Seite des Detektors Null ist. Anschließend formen Sie den Durchmesser des Pumpstrahls, eine Leistung von 355 Nanometern eines ND YAG-Lasers. Mit Hilfe einer drei Millimeter großen Lochblende, die zwischen 2 355-Nanometer-Laserspiegeln platziert ist, wird der Pumpstrahl durch das Zentrum des Vetes ausgebreitet.

Wichtig ist, dass beide Laserstrahlen nahezu koline durch das Zentrum der optischen Zelle ausgebreitet werden. Um einen messbaren Ablenkwinkel und damit eine hohe Amplitude der photothermischen Strahlablenkung oder des PBD-Signals zu erhalten, verwenden Sie eine Referenzverbindung zum Ausrichten der Sonde und des Pumpstrahls, um ein zufriedenstellendes PBD-Signal zu erhalten, das sich durch ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis und eine stabile PBD-Amplitude auf längeren Zeitskalen auszeichnet. Positionieren Sie dann den Pumpstrahl durch inkrementelle Verstellung der 355-Nanometer-Laserspiegel in Bezug auf den Sondenstrahl.

Messen Sie die Amplitude des PBD-Referenzsignals als Differenz zwischen zwei oberen und unteren Fotodioden auf dem positionsempfindlichen Detektor. Das PBD-Signal sollte einen schnellen Anstieg der Amplitude auf einer schnellen Zeitskala aufweisen und auf der Zeitskala von 100 Millisekunden stabil bleiben. Überprüfen Sie die Linearität der PBD-Signalamplitude in Bezug auf die freigesetzte Wärmeenergie, indem Sie die lineare Abhängigkeit des PBD-Signals von der Anregungslaserleistung und von der Anzahl der absorbierten Einstein-Signale messen.

Halten Sie die Laserleistung unter ca. 1000 Mikrojoule, um eine Multiphotonenabsorption zu verhindern. Halten Sie außerdem die Absorption der Probe oder Referenzverbindung auf einer Anregungswellenlänge von weniger als 0,5, um eine Abnahme der Pumpstrahlleistung zu verhindern. Diese Schritte stellen die Linearität des PBD-Signals sicher.

Beginnen Sie mit der Messung der PBD-Leiterbahnen. Geben Sie als Referenz die Lösung der Referenzverbindung in eine Quarzzelle und positionieren Sie die Zelle in der temperaturgesteuerten Halterung. Erfassen Sie das PBD-Referenzsignal als Funktion der Temperatur im Temperaturbereich von 16 bis 35 Grad Celsius mit einem Temperaturinkrement von drei Grad Celsius.

Bei jeder Temperaturänderung. Überprüfen Sie die Position des Prob-Strahls auf dem positionsempfindlichen Detektor und stellen Sie die Position wieder auf die Mitte des Detektors ein. Überprüfen Sie ggf. die Linearität des PBD-Signals, wie im Textprotokoll beschrieben.

Geben Sie dann die Probenlösung in dieselbe optische Zelle wie die Referenzverbindung, wobei die Ausrichtung der optischen Zelle für die Referenzmessung beibehalten wird. Fahren Sie fort, um die PBD-Kurven der Probe im gleichen Temperaturbereich wie für die Referenz zu erkennen, und überprüfen Sie die Linearität der PBD-Amplitude der Probe. Nehmen Sie die Amplitude des PBD-Referenzsignals als Differenz zwischen dem Pret-Trigger- und dem Post-Trigger-PBD-Signal.

Bestimmen Sie auf ähnliche Weise die Amplitude der schnellen und langsamen Phase des PBD-Beispielsignals. Um den Parameter für das Ansprechverhalten des Geräts zu eliminieren, skalieren Sie die Amplitude des PBD-Abtastsignals um die Amplitude des PBD-Signals. Als Referenz ergibt sich aus dem Verhältnis des Probensignals zum Referenzsignal eine Gleichung, aus der die Wärmeabgabe an die Lösung und die nicht-thermische Volumenänderung, die mit einer photoinitiierten Reaktion verbunden ist, aus der Steigung und dem Schnittpunkt des Diagramms des Amplitudenverhältnisses multipliziert mit der Energie gegenüber dem temperaturabhängigen Term bestimmt werden kann, um das Reaktionsvolumen und die Enthalpieänderung für die schnelle und die langsame Prozessskala zu bestimmen. Das beobachtete Volumen und die Enthalpie ändern sich zur entsprechenden Quantenausbeute.

Gemäß den Gleichungen im Textprotokoll werden die Amplituden und Lebensdauern für die einzelnen Schritte analysiert, indem die Daten an die zeitabhängige Funktion angepasst werden, die die Volumen- und Enthalpieänderungen beschreibt. Die Amplitude des schnellen Schritts entspricht der Amplitude der prompten Phase des Beispiel-PBD-Signals und die Amplitude des nachfolgenden Schritts entspricht der Amplitude der langsamen Phase des Beispiel-PBD-Signals. Für jeden einzelnen Prozess können aus der Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante für einzelne Prozesse die Aktivierungsenthalpie- und Entropieparameter mit Hilfe von IR-Diagrammen leicht bestimmt werden.

Ein repräsentatives Beispiel für PBD-Spuren für die Photofreisetzung von Calcium DM nitro ist hier dargestellt. Die schnelle Phase entspricht der Photospaltung von Calcium, DM, Nitro und Calciumfreisetzung, während die langsame Phase die Calciumbindung an den nicht photoisierten Käfig widerspiegelt. Die PBD-Spur für die Calcium-Assoziation zur C-terminalen Domäne des neuronalen Calciumsensors, dem nachgeschalteten regulatorischen Element, Antagonisten, Regulator oder Traum, ist hier nach der Calcium-Photodissoziation dargestellt.

Der auf dem Foto freigegebene Ligand assoziiert mit der Zeitkonstante von 1,3 plus oder minus 0,3 Millisekunden bei 20 Grad Celsius aus der Temperaturabhängigkeit der beobachteten Geschwindigkeitskonstante mit dem C-terminalen Bereich des Traums. Die Aktivierungsbarriere für die Kalziumbindung an die C-terminale Domäne des Traums wurde auf 9,2 plus oder minus 0,4 Kilokalorien pro Mol bestimmt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass die PBD-Spuren der Probe unter Bedingungen gemessen werden, die mit denen für die Referenz identisch sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Proben vorbereiten, Instrumente ausrichten und Daten analysieren, um einen reproduzierbaren thermodynamischen Parameter zu erhalten.