Name: Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit der photothermischen Strahlablenkung submillisekundene Konformationsänderungen in neuronalen Calcium-Sensoren untersuchen. Diese Methode ermöglicht die simultane Detektion von Volumen- und Entropieänderungen.

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (MCB 1021831, JM) und J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM) unterstützt.

1. Probenvorbereitungen <ol><li> Führen Sie die Probenvorbereitung und Proben alle Manipulationen in einem dunklen Raum eine unerwünschte Uncaging verhindern. </li><li> Solubilisierung DM-Nitrophen ((1 - (2-Nitro-4 ,5-dimethoxyphenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-Tetrakis [(oxy-carbonyl)-methyl] -1,2-ethandiamin) in 50 mM HEPES Puffer, 100 mM KCl, pH 7,0, auf eine Endkonzentration von 400 &amp;mgr; m (350 nm ε = 4330 M -1 cm -1, 9). </li><li> In CaCl 2 aus dem 0,1 M Stammlösung, um eine gewünschte Verhältnis von [Ca 2 +] zu erreichen: [DM-Nitrophen]. Für Proteine ​​mit Kd für Ca 2 + Verband mehr als 10 um, das Verhältnis von [Ca 2 +]: ist [DM-Nitrophen] von 1:1 bevorzugt, verhindern die Bindung von Photo freigegeben Ca 2 + zu uncaged DM-Nitrophen . Tatsächlich, unter Berücksichtigung der K d-Wert für DM-Nitrophen bis 10 nm und die Gesamtkonzentration der DM-Nitrophen und Ca 2 + zu 400 mm betragen, ~ 90% eines Calcium-bindenden ProteinsK d = 10 &amp;mgr; M wird in der apoform sein. Auf der anderen Seite, für das Studium der Ca 2 +-bindende Proteine ​​mit K d &lt;10 &amp;mgr; m, ist es bevorzugt, die [Ca 2 +] i zu verringern: [DM-Nitrophen]-Verhältnis 0,95 zu Ca 2 + Komplexierung mit dem verhindert Apo- Protein vor dem Käfig Foto-Dissoziation. </li><li> Solubilisierung des Referenzverbindung, K 3 [Fe (III) (CN) 6] oder Na 2 CrO 4, in dem gleichen Puffer wie für die Probe. </li></ol> 2. Einrichten des Experiment <ol><li> Die grundlegende experimentelle Aufbau ist in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Verwenden ein Nadelloch (P 2), um den Durchmesser des Sondenstrahls (632 nm Ausgang des He-Ne-Laser, ~ 5 mW Laserleistung) bis 1 mm einzustellen und Propagation der Sondenstrahl durch die Mitte einer Zelle in einem Temperatur platziert kontrollierten Zellhalter mit einem M ein Spiegel. </li><li> Verwenden einen Spiegel (M 2) hinter der Probe, um die Sondenstrahlmitteauf ein Zentrum der positionsempfindlichen Detektor. </li><li> Fokussieren des Sondenstrahls auf die Mitte des Detektors in einer solchen Weise, dass die Differenz in der Spannung zwischen den beiden oberen und unteren zwei Dioden Dioden sowie den Unterschied in der Spannung zwischen den zwei Dioden auf der linken und rechten Seite des Detektors Null. </li><li> Anschließend Form einen Durchmesser des Pumpstrahls, eine 355 nm Ausgang des Q-switched Nd: YAG-Laser, Halbwertsbreite 5 ns) mit einem 3 mm Lochblende (P 1) zwischen zwei 355 nm Laserspiegeln angeordnet. </li><li> Copropagate den Pumpstrahl durch das Zentrum der Küvette, wie in Fig. 2 gezeigt. Es ist wichtig, dass beide Laserstrahlen werden durch die Mitte der optischen Zelle in fast kolinearen Weise vermehrt, um eine messbare Ablenkwinkel und damit eine hohe Amplitude der PBD-Signal zu erhalten. Unter Versuchsbedingungen, der Winkel der Schnittpunkt der Sonde und der Pumpstrahlen weniger als 15 °. </li><li> Verwenden Sie eine Referenzverbindung, um die Sonde und Pumpe ausrichtenStrahls, um ein zufriedenstell PBD Signal zu erreichen, dh einen guten S / N-Verhältnis und stabile PBD Amplitude auf längeren Zeitskalen (~ 100 ms). </li><li> Einstellen der Position des Pumpstrahls in Bezug auf den Sondenstrahl durch eine schrittweise Einstellung von 355 nm Laserspiegel. </li><li> Messung der Amplitude des PBD Referenzsignal als eine Differenz zwischen zwei oberen und unteren Photodioden auf dem positionsempfindlichen Detektor. Das PBD Signal sollte eine rasche Zunahme in der Amplitude auf einem schnellen Zeitskala (&lt;10 &amp;mgr; s) aufweisen und bleiben auf 100 ms Zeitrahmen stabil wie in Fig. 3 gezeigt. Der Schuss zu Schuss Variabilität des HVE Amplitude innerhalb von 5% der Signalamplitude und der Signal Reproduzierbarkeit wird hauptsächlich durch Schwingungen beeinflusst. </li><li> Überprüfen Sie die Linearität in der PBD Signalamplitude in Bezug auf die Freigabe von Wärmeenergie durch Messen der linearen Abhängigkeit der PBD-Signal von der Anregungslaserleistung und der Anzahl von Einst absorbiert, E a= (1-10 A), wobei A dem Referenz Absorption bei der Anregungswellenlänge. </li><li> Halten der Laserleistung unter etwa 1,000 &amp;mgr; J und Absorption der Probe / Referenzverbindung bei der Anregungswellenlänge von weniger als 0,5 auf Mehrphotonenabsorption und Verringerung der Pumpstrahlleistung bzw. zu verhindern und sicherzustellen, Linearität der PBD-Signal. </li></ol> 3. PBD Messungen <ol><li> Beginnen Sie mit der Messung der PBD Spuren für den Hinweis. Legen Sie die Lösung der Referenzverbindung in einem 1,0 cm x 1,0 cm oder 1,0 cm x 0,5 cm Quarzzelle und die Position der Zelle in der Temperatur gesteuert Halter. Beide Weglängen vergleichbare PBD Amplitude. </li><li> Erfassen die PBD Referenzsignals als eine Funktion der Temperatur in dem Temperaturbereich von 16 bis 35 ° C mit der Temperaturerhöhung von 3 ° C </li><li> Bei jeder Temperaturänderung, überprüfen Sie die Position der Sonde Strahl auf dem positionsempfindlichen Detektor und neuEinstellen der Position in der Mitte des Detektors, wenn nötig. </li><li> Überprüfen Sie die Linearität des PBD Signal als Funktion der [(dn / dt) / C p ρ] Begriff gemäß Gleichung 2. </li><li> Platzieren der Probenlösung in der gleichen optischen Zelle für die Referenzverbindung halten die gleiche Orientierung der optischen Zelle für die Referenzmessung. </li><li> Erkennen Sie die Beispiel PBD Spuren im gleichen Temperaturbereich wie für die Referenz und überprüfen Sie die Linearität der Probe PBD Amplitude in Bezug auf den [(dn / dt) / C p ρ] Begriff. </li></ol> 4. Datenanalyse Die Größe der Auslenkung direkt proportional zum Volumenänderung aufgrund der Erwärmung der Probe (&amp;Dgr; V th) und nicht-thermische Volumenänderung (&amp;Dgr; V nonth) gemäß Gleichung 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> Die Amplitude der Probe (A S) Und Referenz-(A r) PBD-Signal kann unter Verwendung der Gleichungen 2 bzw. 3 beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Gleichung 3" /> PBD-Signal ist direkt proportional zu der Instrumentenantwortparameter (K) und die Anzahl der Einst absorbiert (E a). Der erste Term in Gleichung 2 (dn / dt) (1/ρC p) Q, entspricht der Signaländerung aufgrund der Wärme zu dem Lösungsmittel befreit. Die dn / dt Term stellt die temperaturabhängige Änderung des Brechungsindex, ist ρ die Dichte des Lösungsmittels ist, C p die Wärmekapazität. Alle Parameter werden für das destillierte Wasser bekannt und kann für eine Pufferlösung, indem eine PBD Signal für die Referenzverbindung in destilliertem Wasser und in einem geeigneten Puffer bestimmt. Q die Wärmemenge returned zu dem Lösungsmittel. Die ρ (dn / d ρ) Begriff ist eine Einheit lose Konstante, die temperaturunabhängig ist im Temperaturbereich von 10-40 ° C 10. &amp;Dgr; N abs Term entspricht der Änderung des Brechungsindex aufgrund der Anwesenheit von absorbierenden Spezies in der Lösung, und es ist unerheblich, ob die Wellenlänge des Meßstrahls relativ zu den Absorptionsspektren jeder Spezies in der Lösung verschoben ist. Das Signal aus der Vergleichsverbindung (A r) wird durch Gleichung 3 wobei E h ν ist die Photonenenergie bei der Anregungswellenlänge, ausgedrückt E h ν = 80,5 kcal / mol für 355 nm-Anregung. <ol><li> Nehmen Sie die Amplitude des Referenzsignals PBD als die Differenz zwischen dem Pre-Trigger-und Post-Trigger-PBD-Signal wie in Abbildung 3 gezeigt. In ähnlicher Weise, bestimmen die Amplitude der schnellen (A s schnell) und langsamen Phase (A s langsam) Der Probe PBD-Signal. </li><li> Um die Antwortparameter Instrument, K eliminieren, skaliert die Amplitude der Probe PBD Signal mit der Amplitude des PBD-Signal für den Referenz. Das Verhältnis des Probensignals mit dem Referenzsignal ergibt Gleichung 4 und kann geschrieben werden als: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Gleichung 4" /> </li><li> Unter Verwendung dieser Gleichung bestimmen die Wärme an die Lösung (Q) und nicht-thermischen Volumenänderung (AV nonth) mit einem Foto-initiierte Reaktion von der Steigung und Achsenabschnitt jeweils von einem Grundstück von [assoziiert (A s / A r) E veröffentlicht h ν] tige Abhängigkeit von der Temperatur abhängige Term [(dn / dt) (1/ρCp)]. </li><li> Zur Bestimmung des Reaktionsvolumens und Enthalpieänderung für die schnelle und die langsame Verfahren skalieren Beobachtungsvolumen und Enthalpieänderung dem entsprechenden Quantenausbeute nach den Gleichungen 5-7. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = &quot;Gleichung 5&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Gleichung 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Gleichung 7" /> Für einen mehrstufigen Prozeß mit Kinetik auf der Zeitskala zwischen 10 usec ~ 200 ms auftritt, kann das Volumen und die Enthalpie Veränderungen bei den einzelnen Reaktionsschritten zugeordnet ermittelt werden. Die Amplituden und Laufzeiten der einzelnen Schritte werden durch Anpassung der Daten an die Funktion F (t), die den zeitlichen Verlauf des Volumenänderungen und Enthalpie beschreibt, analysiert. <img alt="Gleichung 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> wobei α 0 der A s schnell und α i entspricht einem s langsam für jeden einzelnen Prozess und τ i ist die Lebensdauer der einzelnen Reaktionsschritte. Aus der Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante for einzelne Prozesse (k i = 1 / τ i) die Aktivierung und-entropie Parameter können leicht unter Verwendung Eyring-Plots. </li></ol>

<ol><li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+photothermal+methods%3A+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li>
<li>Larsen, R. W., Mikšovská, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li>
<li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Bioph.+Chem%22%5BJournal%5D)">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li>
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<li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+calcium%3A+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li>
<li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+metalloproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li>
<li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds%3A+effect+of+proximal+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li>
<li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-%282-nitrobenzyl%29+caged+urea+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das physikalische Prinzip hinter photothermischen Verfahren ist, dass ein Foto-angeregten Molekül leitet überschüssige Energie über Schwingungsrelaxation in den Grundzustand, was zu einer thermischen Erwärmung des umgebenden Lösungsmittel 1,12. Für Lösungsmittel, wie Wasser, ergibt sich eine schnelle Volumenexpansion (&amp;Dgr; V th). Excited-State-Moleküle können auch photochemische Prozesse, die in nicht-thermische Volumenänderungen (AV nonth) führen durch Bindungsspaltung / Bildung un...

Foto-thermischen Methoden wie photoakustische Kalorimetrie, photothermischen Strahlablenkung (PDB) und transiente Gitter verbunden mit Nanosekunden-Laseranregung stellen eine leistungsstarke Alternative zu optischen Spektroskopie für die zeitaufgelöste Untersuchungen von kurzlebigen Zwischenprodukte 1,2 vorübergehend. Im Gegensatz zu optischen Techniken, wie transiente Absorption und IR-Spektroskopie, daß der zeitliche Verlauf der Absorptionsänderungen in dem Chromophor Umgebung zu überwachen; photothermische Techniken erfassen die Zeitabhängigkeit der Wärme-/ Volumenänderungen und sind daher wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung von Zeitverläufen von optisch &quot;stille&quot; Prozesse. Bisher hat photoakustische Kalorimetrie und vorübergehende Gitter erfolgreich angewendet, um Konformationsdynamik der photoinduzierten Prozesse, einschließlich zweiatomigen Liganden Migration in Globinen 3,4, Liganden-Interaktionen mit Sauerstoff-Sensor-Protein studieren FixL 5, Elektronen-und Protonentransport in Häm-Kupfer-Oxidasen 6 einnd Photosystem II sowie Foto-Isomerisierung in Rhodopsin 7 und Konformationsdynamik von Cryptochrom 8. Die Anwendung der photothermischen Verfahren auf biologische Systeme, fehlt eine interne Chromophor und / oder Fluorophor zu erweitern wurde der PBD-Technik unter Verwendung der photoaktivierbaren Verbindung zur Photo zu einem Anstieg der Ligand / Substrat-Konzentration innerhalb von wenigen Mikrosekunden oder schneller kombiniert, je auf dem Käfig Verbindung. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung von Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit der Ligand / Substrat-Bindung an Proteine, die fehlt, ist eine interne Fluorophor oder Chromophor sind und auf Zeitskala, die nicht von kommerziellen Stop-Flow-Instrumente zugänglich sind verbunden. Hier ist ein Einsatz von PBD die Thermodynamik der Käfigverbindung, Ca 2 + DM-Nitrophen Photospaltung sowie die Kinetik der Ca 2 +-Assoziation mit dem C-terminalen Domäne des neuronalen Kalziumsensor überwachen untenStrom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wird vorgestellt. Die Ca 2 +-Foto veröffentlicht von Ca 2 + DM-Nitrophen innerhalb von 10 Mikrosekunden und erneuten Bindungen zu einer unphotolysed Käfig mit einer Zeitkonstante von ~ 300 us. Auf der anderen Seite, in Gegenwart apoDREAM eine zusätzliche kinetische auf der Millisekunden-Zeitskala auftritt, beobachtet und reflektiert die Ligandenbindung an das Protein. Die Anwendung von PBD zu Konformationsänderungen in biologischen Systemen zu untersuchen wurde irgendwie durch den instrumentalen Schwierigkeiten beschränkt, zB beschwerliche Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl, eine starke und reproduzierbare PBD-Signal zu erreichen. , Eine sorgfältige Gestaltung eines Instrumentenaufbau, eine präzise Steuerung der Temperatur und eine sorgfältige Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl bieten jedoch eine konsistente und robuste PBD-Signal, das die Überwachung der zeitaufgelösten Volumen-und Enthalpie-Änderungen können auf eine breite Zeitskala von 10 Mikrosekunden auf etwa 200 msec. Außerdem modificErwartungen über die experimentellen Verfahren, um die Detektion von Proben-und Referenzspuren unter identischen Temperatur, Pufferzusammensetzung, optische Zelle Orientierung, Laserleistung, usw. gewährleisten die experimentellen Fehler in der gemessenen Reaktionsvolumina und Enthalpien reduziert.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyl)-1,2-diaminoethan-N,N,N&#039;,N&#039; -Tetraessigsäure</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-Nitrophen, Käfig-Calciumverbindung, halten Sie Stammlösungen dunkel, um Photodissoziation</td></tr><tr><td>zu verhindern 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N & -(2-Ethansulfonsäure)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>HEPES-Puffer</td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>Referenzverbindung für PBD-Messungen</td></tr><tr><td>Natriumchromat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>Referenzverbindung für PBD-Messungen</td></tr><tr><td>He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>Verwendung als Sondenstrahl für PBD-Messungen</td></tr><tr><td>Oszilloskop,&nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs 400</td><td>MHz Bandbreite mit</td></tr><tr><td>Nd:YAG-Laser</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>Pumpstrahl für PBD-Messungen</td></tr><tr><td>M355; Nd:YAG Laserspiegel</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>Laserspiegel für 355 nm Laserlinie</td></tr><tr><td>M1 und M2; Laserdiodenspiegel</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>visilbe Laser Flachspiegel, Wellenlängenbereich 300-700 nm</td></tr><tr><td>P1 und P2; Irisblende</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>Nadelloch zur Formung der Sonden- und Schaumstrahlen</td></tr><tr><td>L1; bikonvexe Linse</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>eine Linse zur Fokussierung des Sondenstrahls am Detektor, EFL 50 mm, Wellenlängenbereich 350-2.000 nm</td></tr><tr><td>TM, dichroitischer Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>ein dichroitischer Langpassspiegel mit einer Grenzwellenlänge von 505 nm</td></tr><tr><td>F1; Kantenfilter</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>ein Langpassfilter mit einer Grenzwellenlänge von 500 nm</td></tr><tr><td>Temperaturgesteuerter Küvettenhalter</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

submillisekunden konformationsänderungen in proteinen durch photothermische ablenkein gelöst

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Photothermische Strahlablenkung zusammen mit photoakustischen Kalorimetrie und thermische Gitter gehört zu der Familie der photothermischen Methoden, die die Zeit-Profil Volumen und Enthalpie Veränderungen von Licht induzierten Konformationsänderungen in Proteinen auf Mikrosekunde bis zu Zeitskalen, die nicht zugänglich sind Millisekunden mit traditionellen Stop überwachen Flussinstrumenten. Da außerdem Gesamtänderungen und / oder die Enthalpie sondiert werden, diese Techniken zu Proteinen und anderen Biomakromolekülen, die einen Fluorophor oder ein Chromophor Markierung fehlen angewendet werden. Um Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen verbunden mit Ca 2 +-Bindung zu überwachen, um Kalzium Wandler, wie neuronale Calcium-Sensoren, einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen ist auf Foto-Abzug eine schnelle (τ &lt;20 us) Anstieg der freien Kalzium beschäftigt Konzentration und das zugehörige Volumen und Enthalpie Änderungen werden mit photothermischen Strahlablenkung Technik sondiert.

Ein repräsentatives Beispiel für PBD Spuren für Ca 2 + Foto-Freisetzung aus Ca 2 + DM-Nitrophen ist in Abbildung 3 dargestellt. Die schnelle Phase entspricht der Photospaltung von Ca 2 + DM-Nitrophen und Ca 2 +-Freisetzung, während die langsame Phase reflektiert Ca 2 +-Bindung an den nonphotolysed Käfig. Die Handlung der Probe PBD Amplitude für die auf die Amplitude der Referenzverbindung als Funktion der Temperatur abhängig Faktor [C p ρ...

Eine Anwendung der photothermischen Strahlablenkung Technik in Kombination mit einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen zu Mikrosekunde und Millisekunde Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit dem Calcium-Verband zu einer neuronalen Kalziumsensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator verbunden überwachen Hier berichten wir .

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, konformationelle Veränderungen zu charakterisieren, die mit der Ligandenbindung an Kalziumtransduktoren im Submillisekundenbereich verbunden sind. Der konformationelle Übergang zwischen dem APO-Protein und dem kalziumgebundenen Protein wird durch die photolytische Spaltung einer verkapselten Kalziumverbindung, Calcium-DM-Nitro, ausgelöst, was zur Freisetzung von freiem Kalzium durch Licht führt. Die damit verbundene Änderung des Brechungsindex wird als Verschiebung des Messstrahls mittels eines vierfachen positionsensitiven Detektors gemessen.Anschließend werden die photothermischen Strahlablenkungssignale in Abhängigkeit von der Temperatur sowohl für die Probe als auch für die Referenz gemessen. Eine kombinierte Analyse der Signale der Strahlablenkung liefert Einblicke in den Mechanismus des calciuminduzierten konformationellen Umschaltens hinsichtlich Änderungen des Reaktionsvolumens und der Enthalpie. Der Hauptvorteil der photothermischen Strahlablenkung gegenüber etablierten Methoden wie der Top-Flow-Methode besteht darin, dass mit dieser Technik gleichzeitige Detektion von Volumen- und Entropieänderungen auf einer

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Forschung

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Chemistry

Chemie

Wir präsentieren eine Technik, die die räumliche Trennung verschiedener Konformer oder Cluster ermöglicht, die in einem molekularen Strahl vorhanden sind. Ein elektrostatischer Deflektor wird verwendet, um Arten durch ihr Massen-Dipol-Momentverhältnis zu trennen, was zur Produktion von Gasphasen-Ensembles eines einzelnen Konformators oder Clusterstoichiometrie führt.

Räumliche Trennung von molekularen Konformen und Clustern

Schlüsselschritte der Proteinfunktion, insbesondere Änderungen der Stützknochenkonformation und Protonentransferreaktionen, finden oft auf der Zeitskala von Mikrosekunden bis Millisekunden statt. Diese dynamischen Prozesse können mit der zeitaufgelösten Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie untersucht werden, insbesondere für Proteine, deren Funktion durch Licht ausgelöst wird.

Protonen-Transfer und Protein-Zustände Dynamics in Lichtempfindliche Proteine, die durch zeitaufgelöste Step-Scan Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erstellung eines Echtzeit-Films eines molekularen Rotationswellenpakets unter Verwendung eines hochauflösenden Coulomb-Explosionsbildgebungsaufbaus.

Direct Imaging von lasergetriebenen Ultrakurz Molecular Rotation

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle der Differential-Erkennung Analysen der Zeitaufgelösten Infrarot-Schwingungs-Spektroskopie und Elektron Beugung die Beobachtungen der Deformationen der lokalen Strukturen rund um Photoexcited Moleküle in einem einspaltigen ermöglichen Flüssigkristall, indem er eine atomare Perspektive auf die Beziehung zwischen der Struktur und der Dynamik dieses photoaktiven Materials.

Neuartige Techniken zur Beobachtung von Strukturdynamik von Photoresponsive Flüssigkristallen

Der Erfolg eines seriellen Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie Experiments ist effiziente Musterlieferung abhängig. Hier beschreiben wir Protokolle, um die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle aus eine hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor zu optimieren. Die Methodik setzt auf Probe Homogenisierung mit einem neuartigen Dreiwege Kupplung und Visualisierung mit einer Highspeed-Kamera.

Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

Wir präsentieren ein Protokoll zur Immobilisierung einzelner Makromoleküle in mikrofluidischen Geräten und zur Quantifizierung von Veränderungen in ihren Konformationen unter Scherfluss. Dieses Protokoll ist nützlich, um die biomechanischen und funktionellen Eigenschaften von Biomolekülen wie Proteinen und DNA in einer Strömungsumgebung zu charakterisieren.

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Wir präsentieren einen umfassenden Leitfaden für die Vorbereitung, Datenerfassung und Datenverarbeitung von Festnetzproben für die serielle Synchrotronkristallographie an der Diamond Beamline I24.

Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

Die zeitaufgelöste Einzelmolekül-Protein-induzierte Fluoreszenzverstärkung ist ein nützlicher fluoreszenzspektroskopischer Näherungssensor, der empfindlich auf lokale Strukturveränderungen in Proteinen reagiert. Hier zeigen wir, dass es verwendet werden kann, um stabile lokale Konformationen in α-Synuclein aufzudecken, das auch als globulär unstrukturiert und instabil bezeichnet wird, wenn es mit dem FRET-Lineal mit größerer Reichweite gemessen wird.

Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Hier stellen wir das Protokoll vor, um die lokale Flexibilität und Dynamik von Biomolekülen unter Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenzanisotropie auf Einzelmolekülebene im konfokalen Mikroskopiemodus zu untersuchen.

Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie von einzelnen Molekülen zur Charakterisierung der lokalen Flexibilität in Biomolekülen

Plasmonische Nanopinzetten nutzen die lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz in Goldnanostrukturen, um einzelne Nanopartikel, einschließlich Proteine, in einem optischen Feld im Nanometerbereich einzufangen. Veränderungen im Streusignal zeigen das Vorhandensein von Proteinen und die Konformationsdynamik und ermöglichen eine Überwachung ohne Fluorophormodifikationen oder Oberflächenbindung.

Überwachung der Konformationsdynamik einzelner unmodifizierter Proteine mit einer plasmonischen Nanopinzette

Erfahren Sie, wie Sie mit der photothermischen Strahlablenkung submillisekundene Konformationsänderungen in neuronalen Calcium-Sensoren untersuchen. Diese Methode ermöglicht die simultane Detektion von Volumen- und Entropieänderungen.

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

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