Videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen Arterien mit Murine Precision Cut Lung Slices

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Analyse der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion der spiegelnden intrapulmonalen Arterien mit einem Innendurchmesser von 20 bis 100 Mikrometern. Dies wird erreicht, indem zunächst die Atemwege der Lunge mit Aros mit niedrigem Schmelzpunkt gefüllt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die isolierte Lunge mit einem Vibrator in 200 Mikrometer dicke Scheiben zu schneiden.

Als nächstes wird der Aros durch Inkubation in 37 Grad Celsius, warmem Medium, das mit normoxischem Gas aufgeblasen wird, aus den Lungenabschnitten entfernt. Die Abschnitte bewegen sich also langsam in der Flüssigkeit. Dann wird ein einzelner Lungenabschnitt in eine Durchflusskammer durch die Superfusionskammer überführt, gefolgt von einer videomorphometrischen Analyse der Vasoreaktivität der Querschnittsarterie.

Letztendlich werden Veränderungen im luminalen Bereich des Gefäßes als Reaktion auf verschiedene Behandlungen bewertet. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der intravitalen Mikroskopie von subpleuralen Mikrogefäßen besteht bei der Messung der Gefäßspannung in isolierten proximalen Lungenarterien darin, dass sie die quantitative Analyse der VA-Reaktivität von intrapulmonalen Arterien mit Durchmessern zwischen 20 und 100 Mikrometern ermöglicht. Das Verfahren wird von Anna Goldenberg und zwei Technikern dieses Labors demonstriert.

Öffnen Sie unmittelbar nach dem Töten einer Maus durch Gebärmutterhalsluxation die Bauchhöhle, schieben Sie die Darmschlingen zur Seite und durchtrennen Sie die großen Bauchgefäße für Blutungen. Als nächstes dringen Sie mit einer feinen Schere in das Zwerchfell ein. Dies führt dazu, dass die Lunge durch den Lufteintritt in die Pleurahöhle kollabiert.

Schneiden Sie weiter, um das Zwerchfell von der unteren Thoraxöffnung zu lösen. Schneide nun die Rippen und das Schlüsselbein seitlich ab. Um den ventralen Teil des Brustkorbs zu entfernen, nehmen Sie den Thymus heraus.

Füllen Sie eine Spritze mit warmem Perfusionspuffer. Schneiden Sie anschließend ein kleines Loch in die linke Herzkammer. Passen Sie den Abfluss des Perfusionspuffers an und persolidieren Sie das Lungengefäßsystem langsam über den rechten Ventrikel, bis die Lunge weiß erscheint.

Als nächstes entfernst du die Speicheldrüsen, die kleinen Muskeln und das Bindegewebe aus der Luftröhre. Trennen Sie die Luftröhre vom umgebenden Bindegewebe und legen Sie ein Stück Nähwatte zwischen Speiseröhre und Luftröhre für die spätere Ligatur. Schneidet dann mit einer Mikroschere ein kleines Loch in den oberen Teil der Luftröhre zwischen zwei benachbarten Trachealknorpeln.

Nachdem Sie eine Spritze mit 37 Grad Celsius warmem, niedrigem Schmelzpunkt gefüllt haben, verbinden Sie sie mit einer flexiblen Kunststoffkanüle und drücken Sie den Kolben langsam ein, bis die Luft aus der Kanüle entfernt wird. Führen Sie die Kanüle in das kleine Loch in der Luftröhre ein und verankern Sie sie vorsichtig mit Nähwatte. Füllen Sie als nächstes langsam die Atemwege mit den Aros und beobachten Sie die Lunge.

Zuerst beginnt sich die rechte Lunge auszudehnen, gefolgt von der linken Lunge. Nach 30 bis 40 Sekunden ist die Füllung abgeschlossen und beide Lungen werden auf ein Volumen aufgeblasen, das mit der In-vivo-Situation vergleichbar ist und etwa 1,2 bis 2,0 Milliliter beträgt. Je nach Geschlecht, Alter und Gewicht ist es wichtig, die Ei-Rose schnell genug zu injizieren, damit sie sich während des Eingriffs nicht so verfestigt, aber nicht so schnell, dass die Lunge geschädigt wird.

Nachdem die Lungen gleichzeitig gefüllt wurden, ziehen Sie die Kunststoffkanüle heraus und ligieren Sie die Luftröhre mit der Nähwatte, um ein Auslaufen des Aros zu verhindern. Anschließend wird die Luftröhre über der Ligatur durchtrennt und um die Lunge und das Herz von der Brust zu lösen, werden die Organe in eiskalte Haufen Ringerpuffer übertragen, um die Agros zu verfestigen, was innerhalb weniger Minuten während des Wartens geschieht. Befestigen Sie mit Sekundenkleber ein Stück Sektkorken am Probenhalter des Vibrators, der als Rückstoß für das Lungengewebe dient. Nachdem sich der Agros verfestigt hat, trennen Sie die einzelnen Lungenlappen.

Als nächstes Sekundenkleber, eine Lappe auf den Probenhalter. Um Querschnitte durch die kleinen intraasnischen Arterien zu erhalten, nehmen Sie den Schädellappen der rechten Lunge und kleben Sie ihn mit der Hilumoberfläche auf den Halter, indem Sie ein Vibrato verwenden, das mit einer frischen Rasierklinge ausgestattet ist, die von der Peripherie geschnitten wird, und schneiden Sie den Lungenlappen in 200 Mikrometer dicke Scheiben. Um Querschnitte durch die größeren prä aser Arterien zu erhalten, richten Sie das Hilum der linken Lunge mit dem Champagnerkorken aus und kleben Sie den Lappen in dieser Ausrichtung auf den Halter, dann von der Peripherie aus in Scheiben geschnitten, um den Aros zu entfernen.

Übertragen Sie die Organteile in ein mit etwa 200 Millilitern gefülltes Becherglas mit 37 Grad Celsius. MEM stellt das Becherglas in einen Wärmeschrank und sprudelt mit normoxischem Gas, so dass sich die Lungenabschnitte langsam im Medium bewegen. Nach etwa zwei Stunden wurden die Aros-Plaques, die die Luft füllen, aus dem Lungengewebe entfernt und die Abschnitte haben sich am Boden des Becherglases abgesetzt.

Für die videomorphometrische Analyse der intrapulmonalen Arterien wird ein Lungenabschnitt in die Superfusionskammer übertragen, die auf einem Mikroskop montiert und mit 1,2 Millilitern normoxischem Gas gefüllt ist. MEM. Befestigen Sie den Lungenteil am Boden der Kammer mit Nylonschnüren, die mit einem Platinring verbunden sind. Beginnen Sie mit der Perfusion der Kammer mit normoxischem gasförmigem Medium.

Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit einem 10-fach-Objektiv, um den Lungenschnitt auf Querschnittsarterien mit Innendurchmessern zwischen 20 und 100 Mikrometern zu scannen. Sobald ein vernünftiges Kandidatengefäß lokalisiert ist, verwenden Sie das 20-fach-Objektiv, um ein Bild eines Vorasnergefäßes aufzunehmen, oder wie hier gezeigt, das 40-fach-Objektiv, um ein Bild einer intraasner Arterie zur Messung des Innendurchmessers des Gefäßes aufzunehmen. Richten Sie die Software vor Beginn des Experiments so ein, dass sie während des gesamten Experiments jede Minute Bilder der querschnittlichen Arterie aufnimmt.

Nach dem Auslösen der Fotografie die Perfusion der Kammer mit normoxischem Gastmedium für 10 Minuten fortsetzen. Anschließend wird der Lungenabschnitt in U 466 19 für 10 Minuten ohne Fluss gebadet, um die Kontraktilität der Arterie nur anhand von Gefäßen zu analysieren, deren luminale Fläche mit dem U 466 19 um mindestens 30 % reduziert wurde. Waschen Sie das Medikament 10 Minuten lang mit normoxischem Gastmedium aus.

Erweitern Sie dann die Arterie durch Anwendung von Res für 10 Minuten ohne geringen Durchfluss. Entfernen Sie das Medikament erneut mit einer 10-minütigen Wäsche mit normoxisch gasiertem Medium bei einer Durchflussrate von sechs Millilitern pro Minute, gefolgt von 10 Minuten bei einem Fluss von 0,7 Millilitern pro Minute. Inkubieren Sie anschließend die Lungenscheibe 40 Minuten lang mit hochhypoxischem Gasmedium.

Fließen Sie das hypoxische Gasgemisch ebenfalls über einen zusätzlichen Schlauchsatz in den Luftraum der Perfusionskammer. Entfernen Sie das hypoxische Medium mit einer 20-minütigen Reinigung mit normoxischem gasförmigem Medium und wechseln Sie von hypoxischem zu normoxischem Gasstrom in den Luftraum der Kammer, um die Lebensfähigkeit des Behälters zu überprüfen. Am Ende des Versuchs wird U 466 19 in die Perfusionskammer gegeben und 20 Minuten lang ohne Fluss inkubiert, um eine Vasokonstriktion zu induzieren.

Wiederholen Sie diese Schritte mit einem frischen Lungenschnitt, um die Vasoreaktivität eines anderen Gefäßes zu messen. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie die Bilder der Querschnittsarterien in ein Bildanalyseprogramm laden. Verwenden Sie dann einen Cursor, um den luminalen Bereich des Gefäßes zu umranden.

Das Trocknen der Hände ist notwendig, da dadurch Artefakte vermieden werden, die beispielsweise durch Blutzellen entstehen, die an der Gefäßwand haften. Analysieren Sie die Schnittbilder auf ähnliche Weise. Jedes Bild sollte analysiert werden, wenn eine Bedingung in der Durchfluss-Inkubationskammer in eine andere geändert wird, aber die Analyse jedes anderen Bildes ist ausreichend, wenn sich die Bedingungen nicht ändern.

Eine hypoxische pulmonale Vasokonstriktion ist in diesen Phasenkontrastbildern einer Querschnittsarterie vor ASIN zu beobachten, die in unmittelbarer Nähe eines Querschnittsbronchus verläuft. Die Bilder wurden zu Zeitpunkten aufgenommen, die durch Kreise in der Grafik zu Beginn der Messung angegeben sind, am Ende der Messung mit U 466 19 am Ende der Exposition gegenüber RA nach 30 oder 40 Minuten in hypoxisch gasiertem Medium nach dem Waschen mit normoxischem gasförmigem Medium, und nach der abschließenden Anwendung von U 466 19 wird die Vasoreaktivität als relative Änderungen der luminalen Fläche des Schnitts aufgezeichnet Arterie gegen Zeit. Die Fläche zu Beginn des Experiments wird als 100 % definiert, und die Vasokonstriktion wird als Werte relativ zur Anfangsfläche angegeben.

In diesem Fall führt die Exposition gegenüber Hypoxie zu einer 60%igen Verkleinerung der luminalen Fläche, um eine klarere Darstellung der hypoxischen Reaktion zu ermöglichen. Die Anfangsphase des Experiments, in der die vasale Reaktivität getestet wurde, ist hier nicht dargestellt, und der unmittelbar vor der Exposition gegenüber reduziertem Sauerstoff erhaltene Wert wird auf 100 % festgelegt. Die andere Art von Gefäßen, die in diesen Studien untersucht wurden, sind die Intra-ASIN-Arterien, die sich an den Zwickeln der Alveolärsepten befinden. In dieser Versuchsreihe wird zu diesem Zweck der Einfluss von Sidal, einem nicht-selektiven Öffner von mitochondrialen A TP-sensitiven Kaliumkanälen, auf die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion kleiner intraasner Arterien analysiert.

Die Scheiben werden in hypoxischem Medium inkubiert. In Abwesenheit oder Gegenwart von 50 mikromolaren Sidal-Kontrollinkubationen werden in normoxischem Gastmedium durchgeführt, um eine klarere Darstellung des Ansprechens auf Normoxie oder Hypoxie oder Hypoxie plus Sidal zu erhalten. Die Werte, die unmittelbar vor der Exposition gegenüber normoxischem oder hypoxischem Gastmedium erhalten wurden, werden auf 100 % festgelegt. Die Arterie, die der Zirbeldrüse ausgesetzt ist, zeigt keine Abnahme der Fläche, ebenso wie die Arterie, die in hypoxischem Medium ohne Zusätze inkubiert wurde.

In normoxischen Medien sind keine Veränderungen im luminalen Bereich nachweisbar. Die Aufzeichnungen von kleinen intra-ASIN-Arterien, die hypoxischem Gastmedium mit oder ohne 50 mikromolare Sidals ausgesetzt waren, werden als Mittelwerte plus oder minus REM dargestellt. In diesem Diagramm sind die relativen Daten im Verhältnis zum Wert zu Beginn der hypoxischen Inkubation dargestellt.

Es ist keine Vasoreaktivität nachweisbar. In den Lungenschnitten, die hypoxischem Gast ausgesetzt sind, wird Medium, das eine durch U 466 19 induzierte Zirbeldrüsen-Vasokonstriktion enthält, durch das Arzneimittel nicht beeinflusst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Spiegelpräzision vorbereitet, Lungenscheiben schneidet und wie man sie für die quantitative Messung der VA-Reaktivität von kleinen Intra-Asina-Arterien mit Durchmessern zwischen 20 und 40 Mikrometern verwendet, die sich an der Gase der Alveolensepten befinden, und von größeren Prä-Athena-Arterien mit Durchmessern zwischen 40 und 100 Mikrometern. die an Bronchien und Bronchioli angrenzen.