Name: Videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen Arterien mit Murine Precision Cut Lung Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Lernen Sie die videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion in murinen Präzisions-Lungenschnitten. Diese Methode ermöglicht die quantitative Messung der Gefäßreaktivität kleiner intrapulmonaler Arterien.

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Diese Forschung wird vom Exzellenzcluster Cardio-Pulmonary System gefördert.

1. Herstellung von Gasmischungen, Ausrüstungen, Instrumenten und Lösungen
In diesem Abschnitt werden die für das Protokoll erforderlichen Geräte und Einstellungen beschrieben. Weitere Details und Herstellerinformationen finden Sie in der beigefügten Tabelle.
<ol><li>Besorgen oder bereiten Sie folgende Gasgemische vor:<ol>
<li>Zwei Flaschen mit normoxischem Gasgemisch bestehend aus 21%O2, 5,3%CO2, 73,7% N2.</li>
			<li>Eine Flasche mit hypoxischem Gasgemisch bestehend aus 1%O2, 5,3%CO2, 93,7% N2.</li>
		</ol></li>
	<li>Sammeln Sie die folgenden Geräte:<ol><li>Eine Mikrowelle, zum Schmelzen der Agarose.</li>
			<li>Ein Heizschrank zum Auswaschen der Agarose aus den Lungenabschnitten (siehe unten). Legen Sie ein Rohr, das mit einer Flasche mit normoxischem Gasgemisch verbunden ist, in den Schrank ein.</li>
			<li>Ein Vibratom mit geeigneten Rasierklingen, um die Lunge in 200 m dicke Scheiben zu schneiden. Es ist vorteilhaft, wenn das Vibratome mit einem Kühlset ausgestattet ist, um den Puffer im Vibrambecken abzukühlen.</li>
			<li>Eine durchlaufende Superfusionskammer, die auf einem invertierten Mikroskop montiert ist, zur Analyse der HPV von intrapulmonären Arterien.<ol>
<li>Um die Fixierung der Lungenabschnitte an der Unterseite der Kammer zu erleichtern, verbinden Sie Nylonsaiten mit einem Platinring (selbstkonstruiert). Verbinden Sie die Perfusionskammer mit einer peristaltischen Pumpe mit durchlässigen Durchflussraten von 0,7 ml/min bzw. 6 ml/min.</li>
					<li>Montieren Sie die Geräte so, dass während der Experimente die Medien in einem 37 °C-Wasserbad gelagert und mit normoxischem oder hypoxischem Gas mit 21 G x 4 3/4 Kanülen geblasen werden. Zusätzlich verwenden Sie eine zweite Verbindung aus der Gasflasche, um die normoxischen/hypoxischen Gasgemische in den Luftraum der Perfusionskammer einzuspeist. Stellen Sie sicher, dass alle Rohre dieses Systems gasdicht sind.</li>
				</ol></li>
			<li>Eine CCD-Kamera, die auf einem aufrechten invertierten Mikroskop montiert ist, um Bilder der analysierten Arterie aufzuzeichnen.</li>
			<li>Bereiten Sie die folgenden Instrumente vor:<ol>
<li>Zur Vorbereitung der Lunge: ein steriles Sezieren set mit einer rauen Schere und zwei PaarZangen, eine feine Schere zum Öffnen der Brust, eine Mikroschere, um ein Loch in die Luftröhre zum Füllen der Agarose zu schneiden, und Nähen von Baumwolle (ca. 20 cm) für ligation der Luftröhre, um den Abfluss der Agarose zu verhindern.</li>
					<li>Zum Befüllen der Atemwege mit Agarose: Verbinden Sie eine 2 ml Spritze mit dem flexiblen Kunststoffrohr einer IV-Indwelling-Kanüle (20 G x 1 1/4).</li>
					<li>Für die Perfusion der Lunge mit Puffer: Fixieren Sie eine 50 ml Spritze als Pufferbehälter ca. 40 cm über dem Arbeitsplatz für die Mausvorbereitung.</li>
					<li>Für den Abfluss des Puffers: Schließen Sie die Spritze an ein Rohr an, an dem eine 25 G x 1 Kanüle befestigt ist. Verwenden Sie eine Klemme am Rohr, um den Abfluss auf ca. 1 Tropfen/Sek. (ca. 0,3-0,4 ml/min) einzustellen.</li>
				</ol></li>
			<li>Bereiten Sie die folgenden Puffer und Medien vor:<ol>
<li>1.000 ml HEPES-Ringer Puffer (10 mM HEPES, 136,4 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2•6H2O, 2,2 mM CaCl2•2H2O, 11 mM Glukose, pH 7,4). Bewahren Sie den sterilen filtrierten Puffer (Porengröße des Filters: 0,2 m) bei 4 °C auf.</li>
				</ol></li>
			<li>Etwa 30 min vor Beginn der Isolierung der Lunge bereiten die folgenden Lösungen vor:<ol>
<li>1,5% w/v Niedrigschmelzpunkt-Agarose im HEPES-Ringer-Puffer (Gesamtvolumen 10 ml) auflösen und durch Kochen in einer Mikrowelle schmelzen. Anschließend auf 37 °C abkühlen, indem sie in einem Heizschrank gelagert werden. Die 2 ml Spritze zum Füllen der Agarose in die Lungenwege vorwärmen.</li>
					<li>20 ml des HEPES-Ringer-Puffers nehmen, Heparin zu einer Endkonzentration von 250 I.U./ml hinzufügen und den Puffer auf 37 °C erhitzen. Unmittelbar vor der Anwendung Natriumnitroprussid zu einer Endkonzentration von 75 m hinzufügen. Dies ist der Perfusionspuffer für das Abfließen des Blutes aus der Lungenvaskulatur.</li>
					<li>200 ml HEPES-Ringer-Puffer in einen Glasbecher geben und auf Eis aufbewahren. Dieser Puffer wird benötigt, um die mit Agarose gefüllte isolierte Lunge abzukühlen.</li>
					<li>Ca. 200 ml MEM, ergänzt mit 1% Penicillin/Streptomycin, in einen Glasbecher füllen und bei 37 °C im Heizschrank aufbewahren. Blasen Sie das Medium mit normoxischem Gasgemisch. Dies wird zur Entfernung der Agarose aus den Lungenabschnitten verwendet.</li>
					<li>Vorwarme 2 Flaschen MEM mit 1% Penicillin/Streptomycin in einem Wasserbad auf 37 °C ergänzt und mit normoxischem und hypoxischem Gasgemisch für mindestens 2 Stunden blasen, bevor die videomorphometrischen Messungen beginnen. Pro Messung werden ca. 250 ml MEM benötigt.</li>
				</ol></li>
			<li>Sammeln Sie die folgenden zusätzlichen Materialien:<ol>
<li>70% EtOH zur Desinfektion.</li>
					<li>Stammlösung von Heparin (25.000 I.U./5 ml), gelagert bei 4 °C (siehe oben).</li>
					<li>Lagerlösung des NO-Spenders Natriumnitroprussid (Nipruss): 10 mM in H2O, auf Eis gelagert (siehe oben).</li>
					<li>Lagerlösung von Thromboxan analog U46619: 10 'M in Ethanol, auf Eis gelagert.</li>
					<li>Sekundenkleber.</li>
					<li>Nähen von Baumwolle für ligation der Luftröhre nach dem Füllen mit Agarose.</li>
				</ol></li>
		</ol></li>
</ol>2. Tiere
Verwenden Sie Mäuse (z. B. den Stamm C57Bl6) beider Geschlechter im Alter von 10-25 Wochen. HPV kann auch in Knockout-Stämmen und den entsprechenden Wildtyp-Stämmen analysiert werden.
Alle Experimente wurden gemäß den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt und von den örtlichen institutionellen Gremien genehmigt.
3. Isolierung der murinen Lunge und Vorbereitung von Präzision geschnitten Enlung Scheiben (PCLS)
<ol><li>Töten Sie die Maus durch Zervix-Dislokation. Sofort nach dem Töten, sterilisieren Sie die ventrale Körperoberfläche mit 70% EtOH und verwenden Sie die grobe Schere, um die Haut entlang der ventralen Mittellinie vom Kinn bis zum Becken zu schneiden. Anmerkung: Da bekannt ist, dass inhalative Anästhetika wie Isofluran einen Einfluss auf den Gefäßton18,19haben, verwenden Sie keine flüchtige Anästhetika.</li>
	<li>Nach dem Öffnen der Bauchhöhle, legen Sie die Darmschlaufen beiseite und trennen Sie die großen Bauchgefäße für Blutungen. Nach dem Eindringen in das Zwerchfell mit der feinen Schere bricht die Lunge durch Lufteintritt in die Pleurahöhle zusammen. Verwenden Sie die Schere, um das Zwerchfell von der unteren Brustöffnung zu lösen. Schneiden Sie die Rippen und das Schlüsselbein seitlich, um den ventralen Teil des Rip-Käfigs zu entfernen. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Lunge in diesem Schritt nicht geschädigt wird, da sonst eine Blähung der Lunge mit Agarose unmöglich ist! Verwenden Sie nur sterile Instrumente und Laborglas.</li>
	<li>Vor Beginn der Perfusion der Lungenvaskulatur, schneiden Sie ein kleines Loch in die linke Herzkammer für die Entladung des Puffers. Füllen Sie das Spritzenreservoir mit einem warmen (37 °C) HEPES-Ringer-Puffer, der Heparin und Natriumnitroprussid (Perfusionspuffer) enthält, und durchdringen Sie die Lungenvaskulatur langsam über den rechten Ventrikel. Hinweis: Perfusion ist effizient, wenn die Lunge ihre Farbe ändert und ein weißes Aussehen erhält. In diesem Schritt ist es wichtig, Natriumnitroprussid in den Perfusionspuffer einzutragen; Dadurch wird verhindert, dass die Präacinararterien aus dem umgebenden Gewebe abreißen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Speicheldrüsen, kleine Muskeln und Bindegewebe aus der Luftröhre. Trennen Sie die Luftröhre vom umgebenden Bindegewebe und Faden nähen Baumwolle zwischen Speiseröhre und Luftröhre für spätere Ligation.</li>
	<li>Verwenden Sie die Mikroschere, um ein kleines Loch in den oberen Teil der Luftröhre zwischen zwei benachbarten Trachealknorpeln zu schneiden. Nun das flexible Kunststoffrohr einer IV-Indwelling-Kanüle über das kleine Loch in die Luftröhre einlegen und mit der Nähbaumwolle sorgfältig fixieren. Füllen Sie die Atemwege langsam mit der warmen (37 °C) niedrigen Schmelzpunkt-Agarose. Beobachten Sie die Lunge: Zuerst beginnt sich die rechte Lunge zu dehnen, gefolgt von der linken Lunge. Die Füllung wird abgeschlossen, wenn beide Lungen auf ein Volumen aufgeblasen werden, das mit der In-vivo-Situation vergleichbar ist (ca. 1,2-2,0 ml je nach Geschlecht, Alter und Gewicht). Hinweis: Wenn sich nur eine Lunge ausdehnt, ist das Kunststoffrohr möglicherweise zu tief eingelegt, so dass es den Bronchus erreicht hat. In diesem Fall muss es ein wenig herausgezogen werden. Denken Sie daran, dass die Agarose sich verfestigt, wenn sie allmählich abkühlt.</li>
	<li>Wenn die Lunge voll ist, ziehen Sie gleichzeitig das Kunststoffrohr heraus und ligan die Luftröhre mit der Nähbaumwolle, um einen Abfluss der Agarose zu verhindern. Anschließend schneiden Sie die Luftröhre über der Ligatur und lösen Lunge und Herz auf Block von der Brust. Hinweis: Für Anfänger kann es hilfreich sein, einen Kollegen um Unterstützung im Ligationsschritt zu bitten.</li>
	<li>Übertragen Sie das Organpaket in einen eiskalten HEPES-Ringer-Puffer, um die Agarose zu erstarren. Dies geschieht innerhalb weniger Minuten.</li>
	<li>Trennen Sie die einzelnen Lungenlappen und fixieren Sie einen Lappen mit Superkleber auf dem Probenhalter des Vibratom. Hinweis: Es ist hilfreich, ein Stück eines Champagnerkorkens auf den Halter zu kleben, der beim Schneiden des elastischen Lungengewebes als Schiefe dient. Je nach verwendetem Lungenlappen und seiner Ausrichtung auf dem Probenhalter kann der erhaltene PCLS besser für die Analyse kleiner oder großer Gefäße geeignet sein. Meistens verwenden wir den linken und den rechten Schädellappen für die Herstellung des PCLS. Um querschnittsige kleine Intra-Acinar-Arterien zu erhalten, kleben Sie den Schädel-Rechtslappen mit dem Hilum auf den Halter und schneiden Sie ihn von der Peripherie. Um querschnittsige Vor-Acinar-Arterien zu erhalten, richten Sie den Hilum des rechten Lappens mit dem Champagnerkorken aus.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Vibratom, das mit einer frischen Rasierklinge ausgestattet ist, um den Lungenlappen in 200 m dicke Scheiben zu schneiden (Geschwindigkeit: 12 = 1,2 mm/sec; Frequenz: 100; Amplitude: 1,0). Sammeln Sie die PCLS im Vibrambecken, gefüllt mit 4 °C kaltem HEPES-Ringer-Puffer. Hinweis: Die Kühlung des HEPES-Ringers wird empfohlen, ist aber nicht unbedingt erforderlich.</li>
	<li>Zur Entfernung der Agarose die Organpartien in einen glasbecher gefüllten Glasbecher mit ca. 200 ml 37 °C warmem MEM übertragen. Legen Sie den Becher in den Heizschrank, in den ein Mitrohr mit normoxischem Gasgemisch mit einer Flasche verbunden ist. Blasen Sie das MEM mit dem normoxischen Gas, so dass sich die Lungenabschnitte langsam im Medium bewegen. Nach ca. 2 Stunden werden die "Agarose-Plaques", die die Lufträume füllen, aus dem Lungengewebe entfernt. Dies lässt sich daran erkennen, dass die Abschnitte nicht mehr auf der Oberseite des Mediums schwimmen, sondern sich auf der Unterseite des Bechers niederlassen.</li>
</ol>4. Videomorphometrische Analyse der intrapulmonären Arterien von PCLS
<ol><li>Zur videomorphometrischen Analyse von intrapulmonalen Arterien, übertragen Sie ein PCLS in die durchströmende Superfusionskammer gefüllt mit 1,2 ml normoxisch vergastem MEM. Befestigen Sie die PCLS an der Unterseite der Kammer mit Nylonsaiten, die mit einem Platinring verbunden sind (Außen-/Innendurchmesser: 14/10 mm).</li>
	<li>Scannen Sie die PCLS mikroskopisch auf Querschnittsarterien mit Innendurchmessern zwischen 20-100 m. Hinweis: Das Lumen der Arterien wird von flachen Endothelzellen gefüttert. Die umgebenden glatten Muskelzellen können im Phasenkontrastbild als "dunkler Ring" identifiziert werden, der das Lumen umgibt (siehe Phasenkontrastbilder in Abbildung 2). Im Gegensatz dazu können die Atemwege durch das zunächst pseudostratifizierte Säulenepithel identifiziert werden, das sich auf dem Weg zur Pleuraoberfläche in ein einfaches säulenförmiges Epithel, gefolgt von einem einfachen quaderten Epithel, durchläuft. <ol>
<li>Messen Sie den Innendurchmesser zu Beginn jedes Experiments. Anmerkung: In leicht schräg geschnittenen Gefäßen kann der wahre Innendurchmesser der Rohrstruktur in einem 90°-Winkel zur längsten Achse des Lumens bestimmt werden. Große Präacinararterien mit Innendurchmessern >40 m laufen neben Bronchien und Bronchiolen. Kleine intraacinararterienarterien mit innendurchmesser <40 m befinden sich an Denkbögen von Alveolarsepta neben Alveolaund und Alveolenkanälen6.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Experimentelles Design:<ol>
<li>Beginnen Sie jedes Experiment mit einer "Anpassungsphase", in der die Kammer mit normoxischem Vergasten medium durchdrungen ist (Durchflussrate: 0,7 ml/min; 10 min). Als nächstes testen Sie die Lebensfähigkeit des Gefäßes: Analysieren Sie die Kontraktilität der Arterie durch Zugabe von 12 l von 10 'M U46619 (Endkonzentration 0,1 m; 10 min; kein Durchfluss). Anmerkung: Bei dieser Arbeit wird ein Behälter als lebensfähig definiert, wenn die Luminalfläche um mindestens 30 % reduziert wird (für die Art der Messung siehe unten).</li>
			<li>Nach dem Auswaschen des Arzneimittels mit normoxischem Vergasten Medium (Durchflussrate: 6 ml/min; 10 min) die Arterie durch Anwendung von 3 l von 10 mM Nipruss (Endkonzentration 25 m; 10 min; kein Durchfluss) zu delaten.</li>
			<li>Entfernen Sie das Medikament erneut durch eine 10 min Waschen mit normoxisch vergastem Medium (Durchfluss: 6 ml/min) gefolgt von 10 min bei einem Durchfluss von 0,7 ml/min.</li>
			<li>Induzieren Hypoxische pulmonale Vasokonstriktion durch Inkubation des PCLS mit hypoxisch vergastem Medium (Durchflussrate: 0,7 ml/min; 40 min). Durch ein zusätzliches Rohrsystem das hypoxische Gasgemisch in den Luftraum der Perfusionskammer einspeisen.</li>
			<li>Entfernen Sie das hypoxische Medium durch eine 20 min Waschen mit normoxisch vergastem Medium (Durchflussrate: 6 ml/min).</li>
			<li>Am Ende jedes Experiments fügen Sie der Perfusionskammer 1,2 l von 10 M U46619 (Endkonzentration 0,01 m; 20 min; kein Durchfluss) hinzu, um eine Vasokonstriktion zu induzieren. Anmerkung: Dieser letzte Schritt ermöglicht die Bestimmung, ob eine Änderung der hypoxischen Reaktion (z. B. durch gleichzeitige Anwendung eines Arzneimittels in der hypoxischen Phase oder beobachtet in einem PCLS, der aus einem Knockout-Mausstamm hergestellt wird) spezifisch für die Hypoxie-induzierte Verengung ist oder ob sie einen allgemeinen Einfluss auf die Kontraktilität widerspiegelt. Die Konzentration von 0,01 m entspricht dem EC50-Wert von U46619, der bei früheren (nicht veröffentlichten) Konzentrationskontraktionsmessungen geschätzt wurde.</li>
			<li>Verwenden Sie ein anderes PCLS, um Kontrollexperimente mit normoxischen anstelle von hypoxisch vergastem MEM und normoxischem Gasgemisch im Luftraum der Perfusionskammer durchzuführen.</li>
		</ol>
</li>
</ol>5. Analyse der Vasoreaktivität und grafische Darstellung
<ol><li>Mit geeigneter Software fotografieren Sie während des gesamten Experiments jede Minute von der Querschnittsarterie.</li>
	<li>Mit geeigneter Software können Sie Veränderungen des Luminalbereichs der Gefäße auswerten, indem Sie die inneren Grenzen mit Vollbildbildern von Hand aussäen. Hinweis: Es reicht aus, jedes zweite Bild zu analysieren, um übersichtliche Diagramme zu erhalten. Wenn jedoch eine Bedingung in der Durchfluss-Superfusionskammer in eine andere geändert wird, analysieren Sie jedes Bild. Die übrigen Bilder dienen als Back-up für den Fall, dass ein Foto nicht analysiert werden kann. Leider muss dieser zeitaufwändige Schritt von Hand und nicht von entsprechenden Programmen durchgeführt werden, da manchmal Blutzellen an der Gefäßwand befestigt sind, die sich während der Messung bewegen, oder es ist kein perfekter Querschnitt des Gefäßes, sondern ein tangentialer Abschnitt, in dem eine zuverlässige Lokalisierung der inneren Grenzen nur unter visueller Kontrolle erfolgen kann.</li>
	<li>Definieren Sie den wert, der zu Beginn des Experiments für die Fläche des Gefäßlumens erhalten wurde, als 100% und drücken Sie Diekonstriktion oder Dilatation als relative Abnahme oder Erhöhung dieses Wertes aus.</li>
	<li>Für jedes Experimentplot wird der relative Luminalbereich gegen die Zeit mit geeigneter Software erstellt.</li>
	<li>Um mehrere Experimente zusammenzufassen, zeichnen Sie die Mittelderweisen der relativen Luminalbereiche +/- Standardfehler des Mittelwerts (SEM) gegen die Zeit. Anmerkung: Für eine klare Darstellung der Auswirkungen verschiedener Substanzen auf hypoxia- oder U46619-induzierte Lungenvasokonstriktion oder der hypoxischen Reaktion von Knockout-Mausstämmen kann die Anfangsphase der Experimente, in der die Lebensfähigkeit des Gefäßes getestet wird, aus dem Diagramm weggelassen werden. In diesem Fall werden die Werte, die zu Beginn der Exposition gegenüber reduziertem Sauerstoff ermittelt wurden, als 100% definiert.</li>
</ol>6. Statistische Analyse
<ol><li>Analysieren Sie Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen mit dem Kruskal-Wallis- und dem Mann-Whitney-Test, wobei p≤0,05 als signifikant und p≤0,01 als hoch signifikant angesehen wird. Hinweis: Weitere Informationen zur Vorbereitung und Betriebsverwendung von PCLS finden Sie auch20,21.</li>
</ol>

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</ol>

Autoren haben nichts zu verraten.

Die isoliert eatierte und durchblutete Mauslunge ist ein hervorragendes Modell für die Analyse der physiologischen Reaktion des Lungengefäßsystems auf Veränderungen der Sauerstoffversorgung und ermöglicht unter anderem die kontinuierliche Messung des Lungenarteriendrucks1. Dieses Modell erlaubt jedoch nicht die Identifizierung und Analyse dieser Vaskulärensegmente, die die stärkste Reaktion auf Hypoxie zeigen. Dies ist der Vorteil unserer videomorphometrischen PCLS-Analyse, die die Messung von HPV einzelner Arterien mit Innendurchmessern von 20-100 m erleichtert. PCLS stellen ein attraktives In-vitro-Modell dar, da sie dem Organ, aus dem sie hergestellt werden, sehr ähnlich sind. Im Gegensatz zu Zellkultursystemen sind alle Zelltypen in ihrer ursprünglichen Gewebe-Matrix-Konfiguration vorhanden. Darüber hinaus reicht eine Lunge für die Vorbereitung vieler PCLS aus, so dass zumindest teilweise Experimente durch die Verwendung von Abschnitten aus derselben Maus standardisiert werden können. Nach dem 3R-Konzept (Reduktion, Verfeinerung und Ersatz von Labortieren in den Biowissenschaften) von Russell und Burch23 spricht diese Tatsache auch für den Einsatz von PCLS.
Allerdings muss man bedenken, dass das Gewebe durch Schneiden mit einem Vibratome und Längssignalsignalztion zum Beispiel über die Endothelzellen, wie von Kübler et alpostuliert, geschädigt wird. 14 ist nicht mehr möglich.
Ursprünglich wurden PCLS hauptsächlich für biochemische, pharmakologische und toxikologische Studien eingesetzt, aber in der Zwischenzeit werden sie auch zur Messung der Bronchialkontraktilität, der Mukocilia- und Gefäßreaktionen verwendet (für Bewertungen siehe Sanderson20 und Davies21). Held et al. haben eine Studie durchgeführt, in der sie die Modelle der isolierten perfundierten und belüfteten Mauslunge und von PCLS24verglichen haben. Sie stellten durch die Analyse der Reaktionen von Atemwegen und Lungengefäßen auf eine Vielzahl von endogenen Mediatoren fest, dass wichtige Eigenschaften der gesamten Lunge in PCLS beibehalten wurden.
Bei PCLS werden hypoxische Erkrankungen nicht über die Atemwege wie in der intakten Lunge festgestellt, sondern durch Inkubation des Lungenabschnitts im hypoxisch-vergasten Medium. Wir haben den Sauerstoffpartialdruck (pO2) des Mediums vorgasiert mit 1%O2, 5,3%CO2, 93,7% N2 und mit 21%O2, 5,3%CO2, 73,7%N2, mit einem Blutgasanalysator analysiert. Unmittelbar vor der Einspeisung in die Perfusionskammer betrug der pO2 des hypoxisch vergasten MEM 40 mmHg und das des normoxisch vergasten Mediums 160 mmHg6.  In der intakten Lunge wird HPV induziert, wenn alveolares pO2 unter 50 mmHg25fällt, eine Situation, die offensichtlich durch die Anwendung von hypoxisch-vergastem Medium nachgeahmt werden kann. Unsere Daten über das Ausmaß der HPV entsprechen gut den Ergebnissen, die mit einem anderen experimentellen Ansatz erzielt wurden. Yamaguchi et al. haben isolierte Rattenlungen aufgetragen, um Mikrogefäße mit einem Durchmesser von 20-30 m durch konfokale Laserscanning-Lumineszenzmikroskopie in Echtzeit zu untersuchen, gekoppelt mit einer hochempfindlichen Kamera mit einem Bildverstärker10. Sie beobachteten eine mittlere Reduktion des Durchmessers um 2,7 m nach Exposition der Lunge gegenüber Hypoxie. Man kann berechnen, dass eine 20%ige Reduzierung der Leuchtdichtefläche, wie wir sie in unserem System messen, einer etwa 15%igen Verringerung des Durchmessers entspricht.
In unseren Experimenten haben wir die Arterien als Vor- bzw. Intra-Acinargefäße mit Innendurchmessern von 40-100 m bzw. 20-40 m klassifiziert. Beim Menschen erfolgt der Übergang von muskulären zu nichtmuskulären Arterien im Durchmesserbereich von 70-100 m. Bei Mäusen sind glatte Muskelzellen bis zu einem Außendurchmesser von 20 m26vorhanden. Aus diesem Grund ist es nicht möglich, Arterien mit Durchmessern unter 20 m zu analysieren, da sie auf der Grundlage des Phasenkontrastbildes nicht zuverlässig identifiziert werden können. Am anderen Ende der Skala sind Gefäße mit Durchmessern von mehr als 100 m in PCLS kaum zu finden und werden häufig aus dem umgebenden Gewebe entfernt.
Tatsächlich werden eine Reihe molekularer Kandidaten als molekularer Sauerstoffsensor(n) oder als Bestandteil der Signalkaskade diskutiert, was zu HPV führt (für eine Überprüfung siehe Sylvester et al. 4). Sobald geeignete Knockout-Mäuse verfügbar sind, kann die Videomorphometrie zur Analyse der Vasoreaktivität von Prä- und Intra-Acinar-Arterien im Vergleich zu Wildtieren verwendet werden. Jedoch, PCLS wurden auch für andere Probleme verwendet: Faro et al. verwendet, um die Entwicklung der Endothel-abhängigen Dilatation in der Lunge nach der Geburt zu charakterisieren29 und PCLS von Meerschweinchen, die täglich Rauch oder Luft ausgesetzt 2 Wochen wurden verwendet, um die Auswirkungen von Zigarettenrauch auf Vasoreaktivität durch Induktion der endothelialen Dysfunktion30zu demonstrieren.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
In unseren Experimenten klassifizierten wir die Arterien als Pre-Acinar (Innendurchmesser von 40-100 m) und Intra-Acinar (Innendurchmesser von 20-40 m). Insbesondere für die Herstellung von Lungenabschnitten, die für die Analyse größerer Gefäße verwendet werden sollten, ist es wichtig, dem Perfusionspuffer Natriumnitroprussid hinzuzufügen. Dieses Medikament verhindert die Kontraktion der Gefäße während der Probenvorbereitung und damit ihre Abzocke aus dem umgebenden Gewebe, was zu einer unvollständigen Vasodilatation führt. Natriumnitroprussid im Perfusionspuffer ist nicht so wichtig für die Herstellung von Lungenabschnitten, die für die Analyse von kleinen Arterien verwendet werden sollten, weil sie stark in der Alveolar-Septa verankert sind.
Alle Experimente sollten mit Inkubationen begonnen werden, bei denen die Reaktivität der Arterien getestet wird. Selten erhielten wir Lungenpräparate, bei denen keine Reaktion von Gefäßen auf Auftragnehmer oder Dilatoren nachweisbar war. Wir wissen nicht, warum dies: Vielleicht war das Volumen der in die Lunge gefüllten Agarose zu groß oder zu niedrig, so dass das Schneiden des Organs in PCLS nicht optimal war. Alternativ ist vorstellbar, dass die Agarose während des Instillations zu schnell abkühlt, was zu einer schädlichen Scherspannung führt. Für den Fall, dass in einem einzelnen PCLS keine tragfähige Arterie nachweisbar ist, muss der Abschnitt verworfen und durch einen anderen ersetzt werden.
Die Entscheidung über die Lebensfähigkeit einer Verkehrsader wurde auf der Grundlage der Antwort auf U46619 getroffen. Die Anwendung von U46619 bei einer Konzentration von 0,1 m induziert eine Vasokonstriktion, die nach einer Übung direkt in der Bildsequenz auf dem Bildschirm sichtbar ist. Da es einige Abweichungen in der Vasoreaktivität gibt, untersuchen wir die Auswirkungen eines Medikaments auf HPV, indem wir die Vasoreaktion in Lungenabschnitten messen, die dem Medikament oder dem Medium allein ausgesetzt sind.
HPV einer einzelnen Arterie ist im Mikroskop oft kaum nachweisbar und führt im Durchschnitt zu einer Reduktion der Luminalfläche um etwa 20-30%. Kleine Veränderungen des Durchmessers einer Arterie haben jedoch einen deutlichen Input für den Strömungswiderstand. Gemäß der Gleichung "R = 1/r4"mit R=Widerstand und r=Radius ist der Strömungswiderstand umgekehrt proportional zur vierten Kraft des Radius. Lassen Sie mich ein Beispiel nennen: Eine "ideale Arterie", die einen kreisförmigen Querschnitt mit einem Durchmesser von 40 m (r=20 m) aufweist, hat eine Luminalfläche von ca. 1.260m2. Wenn die Luminalfläche um 20 % reduziert wird, können wir berechnen, dass der Durchmesser des Behälters um 10,5 % auf 35,8 m (r=17,9 m) reduziert wird. Nach der oben genannten Gleichung würde der Strömungswiderstand dieses Gefäßes von 6,25 x 10-6 auf 9,71 x 10-6, d. h. um etwa 55 % steigen. Im Falle einer Verkleinerung der Luminalfläche um 30 % würde der Radius um etwa 16 % abnehmen, aber der Strömungswiderstand würde um etwa 100 % zunehmen. Obwohl diese Berechnungen eine übersimplifizierungsgemäß ezipierte, bei der ein laminarer Blutfluss und eine Gefäßform eines starren Rohres angenommen werden, ist es ein Hinweis auf die Auswirkungen bereits geringfügiger Veränderungen des Durchmessers auf den Strömungswiderstand.

In den meisten systemischen Gefäßbetten induziert Hypoxie Eine Vasodilatation, im Vergleich zur Vasokonstriktion, die durch Hypoxie in der Lungenvaskulatur verursacht wird. Diese lungenspezifische Reaktion auf die verringerte Sauerstoffspannung wird hypoxische Pulmonamonakonstriktion (HPV) genannt, beginnt innerhalb von Sekunden und kehrt sich schnell nach der Umstellung auf normoxische Beatmung um. Obwohl HPV seit mehr als 60 Jahren bekannt ist, sind der zelluläre Sauerstoffsensor(e) und die Signalkaskade(n), die zu Vasokonstriktionen führt, noch in der Debatte. Es besteht ein relativ breiter Konsens darüber, dass Hypoxie-evozierte Redox- und ROS-Änderungen für HPV und die Entwicklung von pulmonaler Hypertonie (in Sylvester et al. 4 und Schumacker et al. 5). Unsere eigenen Daten unterstützen eine zentrale Rolle des Komplexes II der mitochondrialen Atemkette in HPV6,7. Kürzlich, Wang et al. präsentiert ein völlig neues Konzept für Sauerstoffsensorik und HPV: Basierend auf ihren Daten schlagen sie vor, dass alveolare Hypoxie durch die angrenzenden Kapillaren wahrgenommen wird, was zu einer Membrandepolarisation der Endothelzellen führt. Die Reaktion wird über Verbindung 40 Spalt-Kreuzungen der Endothelzellen propagiert, was zu einer Verengung der glatten Muskelzellen der vorgelagerten Arteriolen8führt.
Die Arterien der Lunge verlaufen entlang der Atemwege, zweigen mit ihnen, verringern kontinuierlich den Durchmesser und versorgen schließlich das Kapillarsystem in den Alveolarwänden mit Blut. Diese arterielle Zirkulation besteht aus anatomisch und funktional unterschiedlichen Segmenten. Auf die proximalen Leitungsarterien, die sich durch eine Fülle elastischer Fasern in den Wänden auszeichnen, folgen voll muskuläre intrapulmonale Arterien, die den pulmonalen Gefäßwiderstand weitgehend steuern. Schritt für Schritt werden diese Arterien in Segmente überführt, in denen die Muskelschicht unvollständig wird, und schließlich sind die Gefäße frei von glatten Muskel-Aktivin-Immunreaktiven Zellen. Die intra-acinararterienversorgung, die einen individuellen Lungenader mit Blut füttert, stellt ein teilweise muskulöses Segment6dar. Ebenso stellt das pulmonale arterielle System keine einheitliche Struktur in Bezug auf die hypoxische Reaktion dar, sondern weist eine ausgeprägte regionale Vielfaltauf 9,10. Zum Beispiel induziert in proximalen Lungenarterien, die aus der Lungenlunge der Ratte isoliert sind, eine biphasische Reaktion, die eine anfängliche schnelle Kontraktion von kurzer Dauer zeigt, die - nach unvollständiger Entspannung - von einer zweiten langsamen, aber anhaltenden Kontraktion gefolgt wird11. In Resistenzarterien, die aus Rattenlungenparenchym als vierte und fünfte Teilung der Lungenarterien isoliert sind (Außendurchmesser <300 m), verursacht Hypoxie monophasische Verengung9. Bereits 1971 kamen Glazier und Murray aus Messungen der Kapillarkonzentration roter Blutkörperchen in der Lunge von hunden, die mit hypoxischen Gasgemischen belüftet wurden, zu dem Schluss, dass die hypoxieinduzierte Erhöhung der Gefäßresistenz hauptsächlich vor den Kapillaren12auftrat. Heutzutage stellt die intravitale Mikroskopie intakter Lungen von anästhesierten und mechanisch belüfteten Mäusen ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse der Lungenmikrovaskulatur13,14dar. Die Exzision eines kreisförmigen Fensters in der Brustwand ermöglicht einen mikroskopischen Zugang zur Lungenoberfläche und ermöglicht die Analyse subpleuraler Lungengefäße mit einem Durchmesser von bis zu 50 m. Durch die Kombination dieser Technik mit der Infusion von FITC-Dextran, Tabuchi et al. zeigte, dass nur mittelgroße Arteriolen mit Durchmessern von 30-50 m eine deutliche Reaktion auf Hypoxie aufweisen, die über einen Zeitraum von 60 min mit einer geringfügigen Dämpfung nach 30 min anhielt. Im Gegensatz dazu zeigten kleine Arteriolen mit Durchmessern von 20-30 m nur eine geringe Reaktion auf Hypoxie3. Diese Technik erlaubt jedoch nicht die Analyse von Arterien mit einem Durchmesser von mehr als 50 m, da sich diese Gefäße zu tief im Lungengewebe befinden.
Um die Lücke in der Analyse von großen und sehr kleinen Lungenarterien (wie die subpleuralen Gefäße) der murinen Lunge zu überbrücken, haben wir eine Methode gewählt, die von Martin et al.beschrieben wurde. zur Analyse der Reaktivität der Atemwege15. Basierend auf einer Agarose-Gel-Instillationstechnik erleichtert es die Herstellung von präzisionsgeschnittenen Lungenscheiben (PCLS) aus diesem relativ weichen und elastischen Organ. Innerhalb der PCLS-Vasoreaktivität von Querschnittsarterien mit Innendurchmesser zwischen 20-100 m kann direkt per Videomikroskopie beobachtet werden. Die Anwendung von Medikamenten während der hypoxischen Inkubation des PCLS ermöglicht die Analyse ihrer Auswirkungen auf HPV. Es ist von besonderer Bedeutung, dass diese Technik auch auf gentechnisch veränderte Mäuse angewendet werden kann. Basierend auf ihrer Lage innerhalb der Lunge klassifizieren wir die Arterien als Prä- und Intra-Acinargefäße mit Innendurchmessern von 20-40 m bzw. 40-100 m. Unter funktioneller Sicht liefert die Intra-Acinar-Arterie einen individuellen Lungenader mit Blut und die Präacinararterie ist die vorhergehende Gefäßsektion. Die Aufnahme von Bildern auf einer Digitalkamera ermöglicht die anschließende Quantifizierung der Vasoreaktion. Ein offensichtliches Attribut dieses PCLS-Modells ist der Mangel an Scherspannung, die auf das Endothel wirkt. Im Gegensatz dazu führt akute HPV in durchbluteten Gefäßen zu einem Anstieg der Scherspannung und führt so zu sekundären Mechanismen wie NO-Freisetzung16. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von PCLS Messungen von HPV ohne extrapulmonale neuronale oder hormonelle Einflüsse. Im Gegensatz zu Zellkultursystemen, die beispielsweise aus den lästigen pulmonalen gelenkglatten Muskelzellen17hergestellt werden, ist die histologische Architektur der Gefäßwand nahezu vollständig erhalten.
Zusammenfassend bietet dieses Protokoll eine hilfreiche Methode zur Analyse potenzieller molekularer Sauerstoffsensoren und/oder zellulärer Bahnen, die für HPV von intrapulmonalen Arterien mit Innendurchmessern zwischen 20-100 m unter Bedingungen ohne Scherspannung verantwortlich sind.

<table><tbody><tr><td>Vibratom "Microm HM 650 V"</td><td>Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellenherd</td><td>Bosch, Frankfurt, Deutschland</td><td>HMT 702C</td><td></td></tr><tr><td>Wärmeschrank</td><td>Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchfluss-Superfusionskammer&nbsp;</td><td>Hugo Sachs Elektronik, März, Deutschland</td><td>PCLS-Bad Typ: 847 SN:4017</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechtes inverses Mikroskop mit 4X-, 10X-, 20X- und 40X-Objektiven&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera&nbsp;</td><td>Stemmer Imaging, Puchheim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe Minipuls 3</td><td>Gilson, Limburg-Offheim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad " Universal Wasserbad Isotem 205"</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>9452450</td><td></td></tr><tr><td>Gasdichte Rohre Tygon R3603-13 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &Oslash; i: 3/32 Zoll, &Oslash; a: 5/32 in, Wand: 1/32 in</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verschiedene Scheren und Pinzetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nähen von Baumwolle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Spritze&nbsp;</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Spritze</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexibles Kunststoffrohr einer IV-Verweilkanüle " IntrocanR-W" (Kanüle 20 G x 1 & frac14; in, 1,1 x 32 mm)</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Deutschland</td><td>4254112B</td><td>Zum Einträufeln der Agarose in die Lunge</td></tr><tr><td>Kanüle 21 G x 4 &frac34; in; 0,8 x 120 mm</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Deutschland</td><td>4665643</td><td>Zum Blubbern des Mediums</td></tr><tr><td>Kanüle Nr. 17, 24 G x 1, 0,55 x 25 mm&nbsp;</td><td>Terumo, Eschborn, Deutschland</td><td>NN 2425 88DSF18</td><td>Für die Lungenperfusion</td></tr><tr><td>Normoxisches Gasgemisch (21% O2, 5,3% CO2, 73,7% N2)</td><td>Linde, Hildesheim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypoxisches Gasgemisch (1% O2, 5,3% CO2, 93,7% N2)</td><td>Linde, Hildesheim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma, Deisenhofen, Deutschland</td><td>H 4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>3957,1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1,04936,0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1,02382,0500</td><td></td></tr><tr><td>Glukose D-(+)</td><td>Sigma, Deisenhofen, Deutschland</td><td>G 7021</td><td></td></tr><tr><td>Agarose bei niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Bio-Rad, München, Deutschland</td><td>161-3111</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm, Ulm, Deutschland</td><td>5120046</td><td></td></tr><tr><td>Phenolredfreies minimales essentielles Medium (MEM)</td><td>Invitrogen, Darmstadt, Deutschland</td><td>5120046</td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH zur Desinfektion</td><td>Stockmeier Chemie, Dillenburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>UHU, B&uuml; hl/Baden, Deutschland oder im Supermarkt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U46619 (ein Thromboxan-Analogon)</td><td>Calbiochem/Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>538944</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitroprussid (Nipruss)</td><td>Schwarz Pharma, Monheim, Deutschland</td><td>5332804</td><td></td></tr><tr><td>Optimas 6.5 Software&nbsp;</td><td>Stemmer, Puchheim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 19</td><td>AskNet, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

videomorphometrische analyse der hypoxischen lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen arterien mit murine precision cut lung slices

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Akute alveolare Hypoxie verursacht eine pulmonale Vasokonstriktion (HPV) - auch bekannt als von Euler-Liljestrand-Mechanismus -, der dazu dient, die Lungenperfusion mit der Beatmung abzugleichen. Bisher sind die zugrunde liegenden Mechanismen nicht vollständig verstanden. Das wichtigste Gefäßsegment, das zu HPV beiträgt, ist die Intra-Acinar-Arterie. Dieser Gefäßabschnitt ist verantwortlich für die Blutversorgung eines einzelnen Acinus, der als der Teil der Lungendistal zu einem terminalen Bronchiol definiert ist. Intra-acinar Arterien befinden sich meist in jenem Teil der Lunge, der durch eine Reihe von häufig verwendeten Techniken wie die Messung des Lungenarteriendrucks in isolierten perfundierten Lungen oder Kraftaufnahmen aus sezierten proximalen Lungenarteriensegmenten1,2selektiv erreicht werden kann. Die Analyse subpleuraler Gefäße durch konfokale Laserscanning-Lumineszenzmikroskopie in Echtzeit ist auf Gefäße mit einem Durchmesser von bis zu 50 m3beschränkt.
Wir bieten eine Technik zur Untersuchung der HPV von murinen intrapulmonalen Arterien im Bereich von 20-100 m Innendurchmessern. Es basiert auf der videomorphometrischen Analyse von Querschnittsarterien in präzisionsgeschnittenen Lungenscheiben (PCLS). Diese Methode ermöglicht die quantitative Messung der Vasoreaktivität kleiner intra-acinararterienarterien mit innendurchmesserzwischen 20-40 m, die sich an Denkbögen von Alveolarsepta neben Alveolarkanälen und von größeren präacinaren Arterien mit Innendurchmessern zwischen 40-100 m befinden, die neben Bronchien und Bronchiolen verlaufen. Im Gegensatz zur Echtzeit-Bildgebung subpleuraler Gefäße in anästhesierten und belüfteten Mäusen erfolgt die videomorphometrische Analyse von PCLS unter Bedingungen, die frei von Scherspannung sind. In unserem experimentellen Modell weisen beide arteriellen Segmente eine monophasische HPV auf, wenn sie einer mittleren Vergasung mit 1%O2 ausgesetzt sind, und das Ansprechverhalten verblasst nach 30-40 min bei Hypoxie.

In Abbildung 1 sind die Ergebnisse der Messung der HPV einer großen Präacinararterie und in Abbildung 2 der kleinen intraacinaren Arterien angegeben. In den Phasenkontrastbildern (Abbildungen 1A und 2A) wird deutlich, dass es möglich ist, diese beiden Arterienklassen aufgrund ihrer Lage im Lungengewebe zu unterscheiden: Präacinararterien verlaufen in unmittelbarer Nähe zu Bronchien und Bronchioli (Abbildung 1A), während sich die intraacinaren Arterien an Denkbögen von Alveolarsepten befinden und von Alveola umgeben sind (Abbildung 2A). Mit ein wenig Übung ist es möglich, die Veränderungen im Luminalbereich als Reaktion auf U46619 auf den Phasenkontrastbildern(Abbildungen 1A und 2A) zu sehen. Allerdings ist die hypoxische Lungenvasokonstriktion oft nicht so ausgeprägt und wird erst nach vollständiger Bewertung der Veränderungen der Leuchtkörperbereiche deutlich (Abbildungen 1B, 1C, 2B und, 2C). Aus didaktischem Grund haben wir ein Beispiel für eine Prä-Acinar-Arterie gegeben, die eine ungewöhnlich ausgeprägte Vasokonstriktion zeigt. Im Durchschnitt führt HPV zu einer Reduzierung der Leuchtdichte um 20-30%.
In Abbildung 2 werden die Aufnahmen kleiner intra-acinararterienarterien, die mit hypoxisch-vergastem Medium mit oder ohne 50 M Pinacidil (einem nichtselektiven Öffner von mitochondrialen ATP-empfindlichen Kaliumkanälen) inkubiert werden, gezeigt und die hemmende Wirkung des Arzneimittels deutlich sichtbar. Der letzte Teil des Experiments zeigt die Selektivität der Wirkung des Arzneimittels auf HPV: Vasokonstriktion, die durch das Thromboxan-Analog U46619 induziert wird, wird durch die Zugabe von Pinacidil nicht verändert. Tatsächlich verläuft die Kurve für die Arterie, die das Pinacidil freilegte, deutlich niedriger als die beiden anderen, aber das Ausmaß der Reduktion der Leuchtdichtefläche um U46619 allein ist vergleichbar. In diesem Fall war es die unvollständige Umkehrung von HPV, die den Unterschied zwischen den Kurven verursacht. In diesem Diagramm ist auch eine Arterie, die normoxischen vergasten Medien ausgesetzt ist, als zusätzliche Kontrolle enthalten. Unter dieser Bedingung sind keine Änderungen des Luminalbereichs nachweisbar.
In Abbildung 3 sind die Daten der vollständigen Messreihe über den Einfluss von Pinacidil auf HPV dargestellt. Zum Vergleich der beiden Gruppen für statistische Unterschiede wurden die Datensätze der angegebenen Zeitpunkte mit dem Kruskal-Wallis- und dem Mann-Whitney-Test analysiert. HPV wurde in Gegenwart von Pinacidil klar abgeschafft, während die U46619-induzierte Kontraktion unverändert blieb.
Alternativ ist es möglich, Unterschiede zwischen Gruppen durch Vergleich der Unterregion zu identifizieren, wie in Müller-Redetzky et al. beschrieben. 22
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig1.jpg"> Abbildung 1. Messung der HPV einer großen Vor-Acinar-Arterie. (A) Phasenkontrastbilder einer querschnitts-Präacinararterie (a), die in unmittelbarer Nähe zu einem querschnittsigen Bronchus verläuft (B). Die Bilder werden zu den in (B) angegebenen Zeitpunkten durch Kreise aufgenommen: zu Beginn der Messung (a), am Ende der Behandlung mit U46619 (b), am Ende der Exposition gegenüber Nipruss (c), nach 30 oder 40 min im hypoxisch vergasten Medium (d, e), nach dem Waschen mit normoxischem Vergasten Medium (f) und nach der endgültigen Anwendung von U46619 (g). Im Graphen (B) werden Änderungen des Luminalbereichs gegen die Zeit dargestellt, während die Luminalfläche zu Beginn des Experiments als 100% definiert ist und Vasokonstriktion/-dilatation als relative Werte angegeben werden. In diesem Fall induziert Hypoxie eine 60%ige Reduktion der Luminalfläche. (C) Für eine klarere Darstellung der hypoxischen Reaktion ist die Anfangsphase des Experiments, in dem die Vasoreaktivität getestet wurde, nicht enthalten, aber der unmittelbar vor der Exposition gegenüber reduziertem Sauerstoff ermittelte Wert wird auf 100 % festgelegt (siehe auch Abbildung 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig2.jpg"> Abbildung 2. Auswirkungen von Pinacidil (ein nichtselektiver Öffner von mitochondrialen ATP-empfindlichen Kaliumkanälen; MitoKATP) auf HPV kleiner intra-acinararterien. (A) Intra-acinar arterien (a) befinden sich an Denkbögen von Alveolarsepta. Alv = alveolus. Die Reihenfolge der einzelnen Bedingungen, die in diesen Experimenten angewendet werden, ist in der Überschrift des Graphen (B) angegeben. Hypoxische Exposition wird in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 'M Pinacidil durchgeführt. Kontrollinkubationen werden mit normoxisch vergastem Medium durchgeführt. Die in (A) gezeigten Bilder werden zu Beginn der Messung (a, a', a") am Ende der Behandlung mit U46619 (b, b', b"), am Ende der Exposition gegenüber Nipruss (c, c', c"), nach 30 oder 40 min in hypoxischem oder normoxischem Vergastenmedium (d, d', d"; e, e', e"), nach dem Waschen mit normoxischem Vergastenmedium (f, f', f"), und nach der endgültigen Anwendung von U46619 (g, g', g"). Für eine klarere Darstellung der Reaktion auf Normoxia/Hypoxie/Hypoxia+Pinacidil werden die Unmittelbar vor der Exposition gegenüber normoxisch-/hypoxisch-vergastem Medium auf 100% (C) festgelegt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig3.jpg"> Abbildung 3. Hemmung von HPV durch Pinacidil. Die Aufnahmen von kleinen intra-acinar Arterien, die hypoxischen vergastem Medium mit oder ohne 50 M Pinacidil ausgesetzt sind, werden zusammengefasst und als Mittel ± SEM dargestellt. In (A) werden die vollständigen Aufzeichnungen in (B) die relativen Daten in Bezug auf den Wert zu Beginn der hypoxischen Inkubation angezeigt. In PCLS, die hypoxisch-vergastem Medium mit Pinacidil ausgesetzt sind, ist keine Vasoreaktivität nachweisbar. Vasokonstriktion durch U46619 induziert wird nicht von dem Medikament betroffen. "n" in Klammern bezieht sich auf die Anzahl der Arterien/Anzahl der Tiere, aus denen PCLS hergestellt wurden. Mit anderen Worten, die erste Zahl beschreibt die Anzahl der analysierten Lungenabschnitte und die zweite Zahl gibt die Anzahl der Mäuse an, aus denen diese Abschnitte hergestellt wurden. Zu den gegebenen Zeitpunkten werden die Unterschiede zwischen beiden Gruppen auf Signifikanz getestet. n.s.: nicht signifikant, *: p≤0.05, **: p≤0.01, ***: p≤0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig4.jpg"> Abbildung 4. Schematische Übersicht über die Methode. Kurz gesagt, Mäuse werden durch zervikale Dislokation getötet. Nach dem Öffnen der Brust werden die Lungen mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose gefüllt und nach dem Abkühlen in 200 m dicke Präzisionsschnitt-Lungenscheiben (PCLS) geschnitten. Nach dem Entfernen der Agarose bei 37 °C wird ein PCLS in die Durchfluss-Superfusionskammer übertragen, in der sie normoxischen Oder mittelvergasten Mittel mit 1%O2ausgesetzt ist. Vasoreaktivität wird als Veränderungen im Luminalbereich aufgezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

Hypoxische Lungenvasokonstriktion (HPV) ist ein wichtiges physiologisches Phänomen, durch das bei alveolarer Hypoxie-Lungenperfusion auf die Beatmung abgestimmt wird. Das wichtigste Gefäßsegment, das zu HPV beiträgt, ist die Intra-Acinar-Arterie. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Analyse von HPV von murinen Lungengefäßen mit Durchmessern von 20-100 m.

Videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen Arterien mit Murine Precision Cut Lung Slices

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion von intra pulmonalen Arterien mit Innendurchmessern von 20 bis 100 Mikron zu analysieren. Dies wird erreicht, indem man zunächst die Atemwege der Lunge mit einem Niedrigschmelzpunkt-Paraffin füllt. Der zweite Schritt besteht darin, mithilfe eines Vibratoms die isolierten Lungen in 200 Mikron dicke Schnitte zu zerschneiden.Anschließend wird das Aros aus den Lungenschnitten durch Inkubation in einem bei 37 Grad Celsius warmen Medium entfernt, das mit normoxischem Gas durchblubbert wird, sodass sich die Schnitte langsam in der Flüssigkeit bewegen. Danach wird ein einzelner Lungenschnitt in eine Durchfluss-Überleitungsanordnung überführt und anschließend eine videomorphometrische Analyse der Vasoreaktivität der quer geschnittenen Arterie durchgeführt.Schließlich werden Änderungen der luminalen Fläche des Gefäßes als Reaktion auf verschiedene Behandlungen bewertet. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der intravitale Mikroskopie subpleuraler Mikrogefäße liegt darin, dass die Messung der vaskulären Spannung in isolierten proximalen Lungenarterien die quantitative Analyse der vasomotorischen Reaktivität intrapulmonaler Arterien mit Durchmessern zwischen 20 und 100 Mikrometern ermöglicht. Die Durchführung des Verfahrens wird Anna Goldenberg und zwei Techniker dieses Labors demonstrieren.Unmittelbar nach dem Töten einer Maus durch Halswirbelverrenkung öffnen Sie die Bauchhöhle, schieben die Darmabschnitte beiseite und durchtrennen die großen Bauchgefäße zur Blutentnahme. Anschließend dringen Sie mit einer feinen Schere durch das Zwerchfell. Dadurch kollabieren die Lungen infolge des Eintritts von Luft in den Pleuraraum.Setzen Sie den Schnitt fort, um das Zwerchfell von der unteren Brustöffnung zu lösen. Schneiden Sie nun die Rippen und das Schlüsselbein seitlich durch. Um den vorderen Teil des Rippenbogens zu entfernen, entfernen Sie den Thymus.Füllen Sie eine Spritze mit warmem Perfusionspuffer. Schneiden Sie anschließend ein kleines Loch in den linken Ventrikel des Herzens. Stellen Sie den Ausfluss des Perfusionspuffers ein und perfundieren Sie langsam das pulmonale Gefäßsystem über den rechten Ventrikel, bis die Lungen weiß erscheinen.Entfernen Sie anschließend die Speicheldrüsen, kleinen Muskeln und das Bindegewebe aus der Luftröhre. Lösen Sie die Luftröhre vom umgebenden Bindegewebe und legen Sie ein Stück Nähgarn zwischen Speiseröhre und Luftröhre für die spätere Ligatur ein. Schneiden Sie dann mit einer Mikroschere ein kleines Loch in den oberen Teil der Luftröhre zwischen zwei benachbarten Luftröhrenknorpeln.Nachdem eine Spritze mit 37 Grad Celsius warmem, niedrigschmelzendem Agarose gefüllt wurde, verbinden Sie sie mit einer flexiblen Kunststoffkanüle und drücken langsam den Kolben, bis die Luft aus der Kanüle entfernt ist. Führen Sie die Kanüle in das kleine Loch in der Luftröhre ein und befestigen Sie sie vorsichtig mit Nähgarn. Danach füllen Sie langsam die Atemwege mit der Agarose und beobachten die Lunge.Zunächst beginnt der rechte Lungenflügel sich auszudehnen, gefolgt vom linken Lungenflügel. Nach 30 bis 40 Sekunden ist die Füllung abgeschlossen und beide Lungen sind mit einem Volumen aufgeblasen, das der in-vivo-Situation entspricht, also etwa 1,2 bis 2,0 Milliliter. Abhängig von Geschlecht, Alter und Gewicht ist es wichtig, die Ei-Rosa-Lösung schnell genug zu injizieren, damit sie während des Verfahrens nicht zu stark verfestigt, aber nicht so schnell, dass die Lungen beschädigt werden.Nachdem die Lungen gleichzeitig gefüllt sind, die Plastikkanüle herausziehen und die Luftröhre mit der Nähtgarn abbinden, um ein Auslaufen des Agaros zu verhindern. Anschließend die Luftröhre oberhalb der Ligatur durchtrennen und die Lungen und das Herz gemeinsam als Block aus dem Brustkorb entfernen; übertragen Sie die Organe in eiskalten Hanks’ Ringer-Puffer, um das Agaros zu verfestigen, was innerhalb weniger Minuten während des Wartens erfolgt. Verwenden Sie Sekundenkleber, um ein Stück Sekt-Korken am Probenträger des Vibratoms anzubringen, der als Rückstau für das Lungengewebe dient. Nachdem das Agaros erstarrt ist, trennen Sie die einzelnen Lungenlappen voneinander.Nächster Schritt: Ein Lappen wird mit Sekundenkleber am Probenträger befestigt. Um Querschnitte der kleinen intraasneren Arterien zu erhalten, nehmen Sie den kranialen Lappen der rechten Lunge und kleben ihn mit der Hilum-Oberfläche mit Sekundenkleber am Träger fest. Schneiden Sie dann mit einem Vibratom, das mit einer neuen Rasierklinge ausgestattet ist, von der Peripherie aus, und zerteilen Sie den Lungenlappen in 200 µm dicke Schnitte. Um Querschnitte der größeren präaseriellen Arterien zu erhalten, richten Sie das Hilum der linken Lunge mit dem Sektverschluss aus, kleben Sie den Lappen in dieser Ausrichtung am Träger fest und schneiden Sie anschließend von der Peripherie aus, um das Aros zu entfernen.Überführen Sie die Organgewebeschnitte in ein Glasbechergefäß mit etwa 200 Milliliter MEM bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie den Becher in einen Heizschrank und spülen Sie mit normoxischem Gas, sodass sich die Lungenschnitte langsam im Medium bewegen. Nach etwa zwei Stunden haben sich die luftgefüllten Aros-Plaques aus dem Lungengewebe gelöst, und die Schnitte sind auf den Boden des Bechers gesunken.Übertragen Sie für die videobasierte morphometrische Analyse intra pulmonaler Arterien einen Lungenabschnitt in die Durchfluss-Überleitungs­kammer, die auf einem Mikroskop montiert ist und mit 1,2 Milliliter normoxisch gasifiziertem MEM gefüllt ist. Befestigen Sie den Lungenabschnitt am Boden der Kammer mit Nylonfäden, die an einem Platinring befestigt sind. Beginnen Sie mit der Perfusion der Kammer mit normoxisch gasifiziertem Medium.Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit einem 10×-Objektiv, um den Lungenschnitt nach quer geschnittenen Arterien mit Innendurchmessern zwischen 20 und 100 Mikron zu durchsuchen. Sobald ein geeignetes Gefäß lokalisiert ist, verwenden Sie das 20×-Objektiv, um ein Bild einer präalveolären Arterie aufzunehmen, oder – wie hier gezeigt – das 40×-Objektiv, um ein Bild einer intraalveolären Arterie zur Bestimmung des Innendurchmessers des Gefäßes aufzunehmen. Stellen Sie vor Versuchsbeginn die Software so ein, dass während des gesamten Experiments jede Minute ein Bild der quer geschnittenen Arterie aufgenommen wird.Nach Auslösung der Aufnahme fortfahren, die Kammer 10 Minuten lang mit normoxischem Gast-Medium zu perfundieren. Anschließend den Lungenabschnitt 10 Minuten lang ohne Fluss in U 466 19 baden, um die Kontraktilität der Arterie zu analysieren, wobei ausschließlich Gefäße verwendet werden, deren luminaler Bereich durch U 466 19 um mindestens 30 % verkleinert wurde. Spülen Sie das Medikament anschließend 10 Minuten lang mit normoxischem Gast-Medium aus.Anschließend weiten Sie die Arterie durch die Applikation von Res für 10 Minuten ohne Fluss. Entfernen Sie die Substanz erneut durch eine 10-minütige Spülung mit normoxischem, gasgesättigtem Medium bei einer Flussrate von sechs Millilitern pro Minute, gefolgt von 10 Minuten bei einem Fluss von 0,7 Millilitern pro Minute. Danach inkubieren Sie den Lungenpräparat für 40 Minuten mit stark hypoxischem, gasgesättigtem Medium.Leiten Sie außerdem die hypoxische Gasmischung über einen zusätzlichen Schlauchsatz in den Luftraum der Perfusionskammer ein. Entfernen Sie das hypoxische Medium durch eine 20-minütige Spülung mit normoxisch belüftetem Medium und wechseln Sie die Gaszufuhr in den Luftraum der Kammer von hypoxisch auf normoxisch, um die Vitalität des Gefäßes zu überprüfen. Am Ende des Experiments geben Sie U 466 19 in die Perfusionskammer und inkubieren 20 Minuten lang ohne Durchfluss, um eine Vasokonstriktion hervorzurufen.Wiederholen Sie diese Schritte mit einem frischen Lungenabschnitt, um die Vasoreaktivität eines anderen Gefäßes zu messen. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie die Bilder der quer geschnittenen Arterien in ein Bildanalyseprogramm laden. Verwenden Sie anschließend einen Cursor, um den luminalen Bereich des Gefäßes abzugrenzen.Das Händetrocknen ist notwendig, da es Artefakte vermeidet, die beispielsweise durch an der Gefäßwand anhaftende Blutzellen verursacht werden. Setzen Sie die Analyse der Querschnittsbilder auf ähnliche Weise fort. Jedes Bild sollte analysiert werden, wenn eine Bedingung in der Durchfluss-Inkubationskammer in eine andere geändert wird; es genügt jedoch, jedes zweite Bild zu analysieren, wenn sich die Bedingungen nicht ändern.Die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion ist in diesen Phasenkontrastaufnahmen eines im Querschnitt dargestellten prä-ASIN-Arterienabschnitts sichtbar, der in unmittelbarer Nähe zu einem im Querschnitt liegenden Bronchus verläuft. Die Aufnahmen wurden zu den Zeitpunkten angefertigt, die im Diagramm durch Kreise markiert sind: zu Beginn der Messung, am Ende der Messung mit U 466 19, am Ende der Exposition gegenüber RAs nach 30 oder 40 Minuten in hypoxisch gasifiziertem Medium, nach dem Spülen mit normoxisch gasifiziertem Medium und nach der abschließenden Applikation von U 466 19. Die Vasoreaktivität wird als relative Änderung der luminalen Fläche des quergeschnittenen Arterienabschnitts über die Zeit aufgezeichnet. Die Fläche zu Beginn des Experiments wird als 100 % definiert, und die Vasokonstriktion wird als Wert relativ zur anfänglichen Fläche angegeben.In diesem Fall führt die Exposition gegenüber Hypoxie zu einer 60 %igen Verringerung der luminalen Fläche, um die hypoxische Reaktion deutlicher darzustellen. Die anfängliche Phase des Experiments, in der die vaskuläre Reaktivität getestet wurde, ist hier nicht dargestellt, und der unmittelbar vor der Exposition gegenüber vermindertem Sauerstoff erhaltene Wert wird mit 100 % angesetzt. Die andere Art von Gefäßen, die in diesen Studien untersucht wurde, sind die intraalveolären Arterien, die sich an den Ecken der alveolären Septen befinden. In diesem Experimentssatz wird der Einfluss von Sidal, einem nichtselektiven Öffner der mitochondrialen ATP-sensitiven Kaliumkanäle, auf die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion kleiner intraalveolärer Arterien zu diesem Zweck analysiert.Die Schnitte werden in hypoxischem Medium inkubiert. In Abwesenheit oder Anwesenheit von 50 Mikromolar Sidal werden Kontrollinkubationen in normoxischem Gast-Medium durchgeführt, um die Darstellung der Reaktion auf Normoxie oder Hypoxie bzw. Hypoxie plus Sidal zu verdeutlichen. Die Werte, die unmittelbar vor der Exposition gegenüber normoxischem oder hypoxischem Gast-Medium erhalten wurden, werden als 100 % gesetzt. Die Arterie, die Pinal ausgesetzt ist, zeigt keine Abnahme der Fläche, im Gegensatz zur Arterie, die in hypoxischem Medium ohne Zusätze inkubiert wurde.In normoxischem Medium sind keine Veränderungen der luminalen Fläche nachweisbar. Die Aufzeichnungen von kleinen intra-ASIN-Arterien, die hypoxischem Gast-Medium mit oder ohne 50 Mikromolar Sidal ausgesetzt waren, werden als Mittelwerte plus oder minus SEM dargestellt. In diesem Diagramm sind die relativen Daten in Bezug auf den Wert zu Beginn der hypoxischen Inkubation gezeigt.Keine vasoaktive Reaktivität ist nachweisbar. In Lungen­schnitten, die hypoxischem Gas ausgesetzt waren, wird die durch U 466 19 in pinealem Vasokonstriktionsmedium hervorgerufene Vasokonstriktion durch das Medikament nicht beeinflusst. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man präzise Lungen­schnitte herstellt und wie man diese für die quantitative Messung der VA-Reaktivität kleiner intra­asinärer Arterien mit Durchmessern zwischen 20 und 40 Mikrometern, die sich an den Wänden alveolärer Septen befinden, sowie größerer prä­athenaler Arterien mit Durchmessern zwischen 40 und 100 Mikrometern, die neben Bronchien und Bronchiolen verlaufen, verwendet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Es wird eine Methode vorgestellt, um die mikrozirkulatorische Blutflussgeschwindigkeit bei Lungenkrebsmetastasen der Pleuraoberfläche bei Ratten automatisiert unter Verwendung der geschlossenen Lungen-Intravitalmikroskopie zu messen. Dieses Modell hat das Potenzial, als weit verbreitetes Werkzeug für die physiologische Forschung an Lungenmetastasen bei Nagetieren eingesetzt zu werden.

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

Pulmonale Hypertonie ist mit einer signifikanten Verringerung der Pulsatilität, Kontraktilität und Elastizität der Lungenarterie verbunden, was zu einer Erhöhung des Lungenarteriendrucks und des Lungenwiderstands beiträgt. Unter Verwendung eines hypoxischen Ferkelmodells konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass die Verbesserung der Plastizität der Lungenarterie mit einem neu entwickelten pulsierenden Katheter die hypoxische pulmonale Hypertonie verbessert.

Zunehmende Lungenarterie Pulsatile Flow verbessert hypoxische Lungenbluthochdruck in Ferkel

Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine Erkrankung der Lungenarteriolen, die zu deren Obliteration und der Entwicklung eines rechtsventrikulären Versagens führt. Nagetiermodelle der PAH sind entscheidend für das Verständnis der Pathophysiologie der PAH. Hier zeigen wir die hämodynamische Charakterisierung mit Rechtsherzkatheterisierung und Echokardiographie bei Maus und Ratte.

Hämodynamische Charakterisierung von Nagetiermodellen von pulmonaler arterieller Hypertonie

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion von pulmonaler Hypertonie (PH) bei Mäusen basierend auf der Exposition gegenüber Hypoxie und der Injektion eines VEGF-Rezeptor-Antagonisten. Die Tiere entwickeln 3 Wochen nach Beginn des Protokolls eine PH- und rechtsventrikuläre (RV) Hypertrophie. Die funktionale und morphometrische Charakterisierung des Modells wird ebenfalls dargestellt.

Induktion und Charakterisierung der pulmonalen Hypertonie bei Mäusen mit dem Hypoxia/SU5416-Modell

Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung einer invasiven hämodynamischen Beurteilung der rechten Herzkammer und der Lungenarterie bei Mäusen unter Verwendung eines Ansatzes für eine Operation in der offenen Brust vor.

Invasive hämodynamische Beurteilung des rechten ventrikulären Systems und Hypoxie-induzierte pulmonale arterielle Hypertonie bei Mäusen

Das Ziel dieser Technik ist die ex vivo Visualisierung von pulmonalen arteriellen Netzwerken von frühpostnatalen und erwachsenen Mäusen durch Lungeninflation und Injektion einer radio-opaque polymerbasierten Verbindung über die Lungenarterie. Mögliche Anwendungen für gegossenes Gewebe werden ebenfalls diskutiert.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Hier wird ein Protokoll zur Erhaltung der vaskulären Kontraktilität von PCLS-murinem Lungengewebe vorgestellt, was zu einem anspruchsvollen dreidimensionalen Bild des Lungengefäßsystems und der Atemwege führt, das bis zu 10 Tage konserviert werden kann und für zahlreiche Verfahren anfällig ist.

Präzisionsschnitt-Lungenschnitte als effizientes Werkzeug für Ex-vivo-Studien zur Struktur und Kontraktilität von Lungengefäßen

Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zur Durchführung der mehrfachen intravenösen Bolusdosisverabreichung und invasiven hämodynamischen Überwachung bei Mäusen. Forscher können dieses Protokoll für zukünftiges therapeutisches Wirkstoff-Screening auf pulmonalarterielle Hypertonie verwenden.

Multiple intravenöse Bolusdosierung und invasive hämodynamische Beurteilung in einem Hypoxie-induzierten Mausmodell für pulmonalarterielle Hypertonie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Verwendung von präzise geschnittenen Lungenschnitten der Maus zur Beurteilung der Kontraktilität der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur in einem nahezu in vivo Milieu.

Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur

Hier beschreiben wir ein einfaches und wirtschaftliches Protokoll zur unvoreingenommenen Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte für das Lungengewebe ganzer Mäuse unter Verwendung einer Einzelfärbung von Isolectin B4.

Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte bei Mäusen über Läppchen hinweg

Lernen Sie die videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion in murinen Präzisions-Lungenschnitten. Diese Methode ermöglicht die quantitative Messung der Gefäßreaktivität kleiner intrapulmonaler Arterien.

Videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen Arterien mit Murine Precision Cut Lung Slices (Video) | JoVE Journal

Videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen Arterien mit Murine Precision Cut Lung Slices

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