Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität
28. Oktober 2013
Mammalian Zellen, die das bakterielle Biolumineszenz Genkassette ( Lux) Erzeugen Licht autonom. Die resultierenden Biolumineszenz Dynamik bei Exposition gegenüber chemischen Stoffen haben nachgewiesen, dass die Behandlung Auswirkungen auf das Zellwachstum und den Stoffwechsel zu reflektieren, so dass diese Zellen eine kostengünstige, kontinuierliche, Echtzeit-Toxizität Screening-Tool, das leicht für High-Throughput-Automatisierung angepasst werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, autonome, lumineszierende humane Zellen zur kontinuierlichen und echtzeitnahen Überwachung der Zytotoxizität zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine ausreichende Anzahl aktiv wachsender autobiolumineszenter Zellen gewonnen wird. Im zweiten Schritt werden gleiche Zellzahlen in einzelne Vertiefungen einer Mehrfachbrunnenplatte ausgesät.
Anschließend werden die Zellen mit einer Verbindung von Interesse über einen Konzentrationsbereich hinweg behandelt. Im letzten Schritt wird das biolumineszente Signal mit einem geeigneten Instrument gemessen. Letztendlich können die Dynamiken der biolumineszenten Signalabgabe genutzt werden, um den Effekt der Testverbindung auf die metabolische Aktivität der Zellen aufzuzeigen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie jenen mit Luciferase, die aus Insekten oder Tiefseearten isoliert wurde, besteht darin, dass weder Probendestruktion noch Zugabe eines Substrats erforderlich sind, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. James Webb, ein Student aus einem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Nachdem die biolumineszenten Zellen von Interesse im geeigneten Kulturmedium bis zu 80 % Konfluenz gezüchtet wurden, wird die Zellkultur vorsichtig durch Schwenken in PBS gewaschen. Danach wird Trypsin hinzugefügt und die Zellen bei 37 °C inkubiert, bis sie sich vom Kolben gelöst haben. Anschließend werden die resuspendierten Zellen in PBS gesammelt, in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt und die Zellzahl nach dem Zählen bestimmt. Die Zellsuspension wird fünf Minuten bei 300 G bei Raumtemperatur zentrifugiert und resuspendiert.
Suspendieren Sie das Pellet in frischem, vorgewärmtem Medium und säen Sie gleiche Zellzahlen in einzelne Vertiefungen einer undurchsichtigen Mehrfach-Well-Platte aus, wobei eine gleiche Menge reines Medium in einen Satz von drei Vertiefungen als Negativkontrolle gegeben wird. Lassen Sie anschließend drei Vertiefungen unbehandelt als Kontrollen und geben Sie die experimentelle Verbindung der Wahl direkt in die Zellen in den entsprechenden experimentellen Konzentrationen im Dreifachansatz hinzu. Unmittelbar nach der experimentellen Behandlung bringen Sie die Platte in die Bildgebungskammer des geeigneten Instruments zur Bildaufnahme und Messung der Biolumineszenz ein.
Stellen Sie anschließend die geeignete Integrationszeit für jede Messung ein und messen Sie die Biolumineszenz über einen Zeitraum von 24 Stunden alle 15 Minuten. Verwenden Sie abschließend eine geeignete kompatible Software, um in jedem Well einen interessierenden Bereich zu identifizieren. Um die biolumineszente Intensität jeder experimentellen Probe zu quantifizieren, zeigen Sie die Lichtemission in Photonen pro Sekunde an, um den Gesamtfluss darzustellen, oder in Photonen pro Sekunde pro Quadratzentimeter pro Ceridian, um die durchschnittliche Strahldichte jeder Probe zu veranschaulichen.
In dieser Studie wurden die Dynamiken von auto-chemilumineszenten HEC 2 9 3-Zellen kontinuierlich über einen Zeitraum von 24 Stunden hinweg in Reaktion auf die Exposition gegenüber einem Antibiotikum überwacht. Die toxischen Wirkungen dieses Antibiotikums, das zur Blio Mycin-Familie gehört und dafür bekannt ist, lebende Zellen abzutöten, indem es sich an zwei Stellen an die DNA bindet und diese spaltet, zeigten sich durch eine Abnahme der Chemilumineszenzproduktion im Vergleich zu unbehandelten Zellen, was direkt anhand von Pseudofarbbildern sichtbar gemacht werden kann. Wie hier gezeigt, ermöglicht die chemilumineszente Eigenschaft der HEC 2 9 3-Zellen eine wiederholte parallele Untersuchung von Proben unter variierenden Behandlungsbedingungen, wodurch der Vergleich verschiedener experimenteller Behandlungskonzentrationen zu jedem beliebigen Zeitpunkt für eine einfache Dosis-Wirkungs-Analyse erlaubt ist.
Beispielsweise wurde in diesem Diagramm die von den Zellen nach 15, 18 oder 20 Stunden Behandlung erzeugte Biolumineszenz gegen die Konzentrationen der hinzugefügten experimentellen Verbindung aufgetragen, was zeigt, dass eine Erhöhung der Antibiotikabehandlung zu einer dosisabhängigen Verringerung der biolumineszenten Produktion durch die Zellen führt. Die in diesem Video vorgestellte Technik eignet sich zur Verfolgung akuter toxischer Effekte, kann jedoch angepasst werden, um langsam wirkende oder langfristige Toxizität zu bewerten, indem die Zellen in zunehmenden Zeitabständen wiederholt abgebildet werden, während die Kultur zwischen den Messungen unter Standard-Inkubationsbedingungen aufrechterhalten wird.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie zeigt die Verwendung biolumineszenter menschlicher Zellen zur kontinuierlichen und Echtzeit-Überwachung der Zytotoxizität. Durch die Messung des biolumineszenten Signals können Forscher die metabolische Aktivität von Zellen als Reaktion auf verschiedene Verbindungen bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Biolumineszenz
- Toxizitätsprüfung
Hintergrund
- Säugerzellen können bakterielle Biolumineszenzgene exprimieren.
- Diese Zellen produzieren Licht autonom und spiegeln dadurch ihren Stoffwechselzustand wider.
- Die Echtzeitüberwachung bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden.
- Mithilfe dieses Ansatzes ist eine Hochdurchsatz-Automatisierung möglich.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Echtzeit-Überwachung der Zytotoxizität.
- Nutzung des biolumineszenten Signals als Indikator für die zelluläre Gesundheit.
- Erleichterung des Hochdurchsatz-Screenings von Substanzen.
Verwendete Methoden
- Beziehen Sie aktiv wachsende biolumineszente humane Zellen.
- Säen Sie gleiche Zellzahlen in Mehrfach-Well-Platten aus.
- Behandeln Sie die Zellen mit Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen.
- Messen Sie die biolumineszenten Signale mithilfe kompatibler Geräte.
Hauptergebnisse
- Biolumineszente Dynamiken korrelieren mit Behandlungseffekten.
- Das zelluläre Wachstum und der Stoffwechsel können in Echtzeit überwacht werden.
- Diese Methode ist kostengünstig und für die Automatisierung geeignet.
- Die Ergebnisse zeigen das Potenzial für Hochdurchsatzanwendungen auf.
Schlussfolgerungen
- Biolumineszente menschliche Zellen eignen sich effektiv für die Toxizitätsprüfung.
- Die Methode ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung zellulärer Reaktionen.
- Sie stellt ein vielversprechendes Werkzeug für Forscher in der Toxikologie dar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Autonom biolumineszente Säugetierzellen ermöglichen eine kontinuierliche, nicht destruktive Überwachung der Zytotoxizität und tragen so zur Reduzierung der hohen Kosten und des zeitlichen Aufwands traditioneller destruktiver Assays bei. Dieser Ansatz liefert Echtzeit-Daten zu Stoffwechselaktivitäten, die die Vorhersagesicherheit bei der frühen Target-Validierung und Wirkstoffidentifizierung verbessern, indem er die Exposition gegenüber Verbindungen mit der Dynamik der Zellgesundheit verknüpft. Die Kompatibilität der Methode mit bestehender Bildgebungstechnik sowie ihr Automatisierungspotenzial erhöhen die Skalierbarkeit für unternehmensweite Forschungs- und Entwicklungsabläufe.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Echtzeit-Korrelation von biolumineszentem Signal mit zellulärem Stoffwechsel und Wachstum.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem er einen biosentinelartigen Endpunkt liefert, der negative Effekte auf die Zellviabilität widerspiegelt, ohne die Probe zu zerstören.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert Dosis-Wirkungs-Analysen und die mechanistische Risikominimierung, indem wiederholte Messungen über verschiedene Konzentrationen und Zeitpunkte hinweg ermöglicht werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Bildschirmierung vor, indem stabile, autonome lichtproduzierende Zelllinien etabliert werden.
- Reproduzierbarkeit: Gewährleistet konsistente quantitative Ergebnisse durch normalisierte Ansiedlung und kontrollierte Umweltbedingungen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die parallele Probenvorverarbeitung in Mehrfach-Platten mithilfe standardmäßiger Bildgebungsgeräte und unterstützt die Hochdurchsatzbewertung von Verbindungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Gewährleistet eine krankheitsrelevante Überwachung von der Entdeckungsphase bis zu den präklinischen Stadien, indem die metabolische Anpassung an toxische Exposition verfolgt wird.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Fortschrittskriterien, indem biolumineszente Dynamiken mit zellulären Gesundheitsschwellenwerten verknüpft werden, die in Dosis-Wirkungs-Kurven beobachtet wurden.
- Biomarker-Abstimmung: Verwendet Lichtemission als funktionellen Biomarker des metabolischen Zustands und ermöglicht so die Korrelation mit phänotypischen Ergebnissen in präklinischen Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Biologie bis zur Identifizierung von Leitsubstanzen, wobei die Echtzeit-Überwachung der Zytotoxizität die Priorisierung von Verbindungen vor der präklinischen Investition unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem biolumineszente Signaländerungen mit durch Verbindungen verursachten Stoffwechselstörungen verknüpft werden.
- Screening: Gewährleistet Einsatzbereitschaft des Assays durch reproduzierbare Signalmessung über die Zeit und ermöglicht zuverlässige Vergleiche von Behandlungsbedingungen.
- Analytik: Liefert quantitative Fluss- und Strahlungsdaten, die es Teams ermöglichen, die Kinetik und Potenz der Zytotoxizität zu bewerten.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem lebensfähige Zellen für die Langzeitüberwachung erhalten bleiben und metabolische Reaktionen ähnlich wie im lebenden Organismus widerspiegeln.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Biosensor-Plattform, die an verschiedene Zielstrukturen und Verbindungsklassen über Projekte hinweg anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unschärfen durch kontinuierliche, markierungsfreie Stoffwechselüberwachung verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit, indem die Zugabe von Reagenzien und die Zerstörung von Proben entfallen.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitalnutzungseffizienz, indem Proben wiederverwendet werden können und die Kosten für Verbrauchsmaterialien bei der Toxizitätsprüfung gesenkt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Priorisierung, indem frühzeitige Daten zu metabolischen Risiken bereitgestellt werden, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten stützen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultivierung von Säugetierzellen und stabiler Transfektion, um Lux-exprimierende Zelllinien zu erhalten.
- Hängt vom Zugang zu Dunkellicht-Bildgebungsausrüstung ab, die in der Lage ist, Biolumineszenz durch Photonen-Zählung nachzuweisen.
- Erfordert die Standardisierung der Ansiedledichte, Inkubationsbedingungen und Messintervalle zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf primäre oder nicht-menschliche Zelllinien mit unterschiedlicher Transfektionseffizienz ausgeweitet wird.
- Ist durch die metabolische Abhängigkeit des Signals begrenzt, wodurch nicht-metabolische zytotoxische Mechanismen möglicherweise nicht erfasst werden.
