Name: Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Isolierung und Quantifizierung von Exosomen aus menschlichem Blut mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse. Diese halbautomatisierte Technik ermöglicht präzise Größenbestimmung für die Neurowissenschaft.

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Die Autoren danken Christina Ballázs, Hug Aubin und Jörn Hülsmann für die kritische Lektüre des Manuskripts und die hervorragende redaktionelle Unterstützung. Darüber hinaus danken die Autoren Gisela Müller für die technische Unterstützung. Die Autoren danken der Particle Metrix GmbH für die Bereitstellung der Mittel zur Deckung der Publikationskosten.

HINWEIS: Die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente wurden von der institutionellen ethischen Vorstand der Universität Düsseldorf zugelassen. 1. Exosom Vorbereitung <ol><li> Vollblut in 3 Zitratröhrchen über Venenpunktion (insgesamt 9 ml). Gießen Sie das Blut in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Probe bei 1500 × g für 20 min bei 4 ° C, um die Trennung von Zellen aus dem Plasma zu initiieren. Den Überstand in ein neues 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 2800 g für 20 min bei 4 ° C, um alle Zellen vom Plasma zu entfernen (zellfreie Plasma; GFP). Übertragen Sie die GFP einer Ultrazentrifugation Rohre, 1 ml pro Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren bei 100.000 · g für 90 min bei 4 ° C bis Exosomen abzureichern. Entfernen 900 ul des Überstands. Resuspendieren des Pellets in den verbleibenden 100 ul in der Ultrazentrifuge Rohr. Fügen Sie 900 ul PBS. </li><li> Zentrifuge erneut bei 100000 × g für 30 min bei 4 ° C. Entfernen 900 Mikroliter supernatant. Resuspendieren Sie das Pellet mit den verbleibenden 100 ul. </li><li> Transfer von 5 bis 20 &amp; mgr; l Resuspension in 40 ml destilliertem Wasser. Filtern der Suspension durch ein 450 nm Filter, Exosomen von größeren Teilchen zu trennen. Verwenden Sie diese endgültige Suspension zur Partikelmessung. </li></ol> 2. Startvorgang des Tracking-Instrument Particle <ol><li> Starten Sie das Programm durch einen Doppelklick auf die Software-Symbol. Klicken Sie auf die verschiedenen Software-Registerkarten (&quot;Zell Check&quot;, &quot;Messung&quot;, &quot;Analyse&quot;), um zwischen ihnen in der gesamten Protokoll wechseln. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm für eine automatisierte Umsetzung der Inbetriebnahme. Wählen Sie die Kontrollkästchen für beide Zellqualitätsprüfung und automatische Ausrichtung. HINWEIS: Jeder dieser Schritte kann separat bei Bedarf durch Drücken der Taste (A) oder (B) auf der &quot;Zellkontrolle&quot; Registerkarte wiederholt werden. </li><li> Öffnen Sie die Eingangs- und Ausgangsanschluss des NTA Instrument und injizieren 10 ml destilliertem Wasser mit einer Spritze in den Zellenkanal durch die Einlaßöffnung. Schließen der Austrittsöffnung, wie die letzte Menge an Wasser eingespritzt wird. Stellen Sie ein Becherglas unter der Austrittsöffnung an Abfalllösung zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass die Messzelle ist frei von Luftblasen und keine Spritze Luftblasen in das System. Schließen Sie die Einlassöffnung sofort. </li><li> Führen Sie die Zelle Qualitätskontrolle, indem Sie auf &quot;OK&quot;. Die Software wird die Zellqualität Ergebnisse nach ein paar Sekunden angezeigt. </li><li> Falls Partikel noch in der Live-View-Bildschirm der Software visualisiert oder wenn das Ergebnis der Qualitätsprüfung ist nur gut oder schlecht ist, werden wiederholen Sie Schritt 2.3, bis die verbleibenden Partikel aus der Messzelle entfernt. Auch wiederholen Sie Schritt 2.3 nach jeder Messung, um die Ansammlung von Partikeln zu vermeiden. Bei Wiederholung der destilliertes Wasser Injektion und Zellprüfung keine &quot;guten&quot; Ergebnis nicht zu produzieren, auf 2,9 fortzufahren. </li><li> Bereiten Sie eine Steuer Suspension, die gleichmäßige 200 nm Größe polystyrene Teilchen verwendet, um die Schwerpunkte der Lasermikroskop und auszurichten. Geben Sie einen Tropfen des Suspensionskonzentrats, vom Hersteller des Instruments vorgesehen ist, zu 500 ml destilliertem Wasser auf die erforderliche Konzentration, so dass 600 ± 100 Partikel pro Bildschirm im Live-Ansicht angezeigt zu erhalten. </li><li> Spritzen Sie die Ausrichtung Suspension in die NTA Instrument wie in Schritt 2.3 beschrieben. Drücken Sie &quot;OK&quot;, um die automatische Ausrichtung, eine automatisierte Routine, durch die das System automatisch die optimale Position der beiden Schwerpunkte finden starten. </li><li> Bei der entsprechenden Meldung besagt, das System ist jetzt bereit für Experimente, klicken Sie auf OK, um die Messung zu starten. </li><li> Gelegentlich Reinigung der Zelle Kanal manuell zwischen den Experimenten durch Spülen der Zelle mit einer 30% igen Lösung von Ethanol. Reinigen Sie den Kanal, wenn die Software zeigt einen automatischen Fehlerbericht. </li></ol> 3. Messung der Proben <ol><li> Spülen Sie den Kanal mit destilliertem Wasser vor each Probenmessung (wie in Schritt 2.3 beschrieben). </li><li> Spritzen Sie die Suspension in Exosom an den Kanal (in Abschnitt 1 hergestellt), wie in Schritt 2.3 beschrieben. </li><li> Passen Sie die folgenden wichtigsten Parameter in der Software je nach Bedarf: <ol><li> Empfindlichkeit. Um den optimalen Empfindlichkeitsbereich zu finden, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Anzahl der Partikel gegen Sensitivity&quot;, um eine Kurve für die gemessenen Partikel pro Bildschirm für verschiedene Empfindlichkeitsstufen anzuzeigen. Wählen Sie eine Empfindlichkeitsstufe, bevor die maximale Steigung der Kurve. Eine höhere Empfindlichkeit ermöglicht die Visualisierung von kleinen Partikeln, sondern erhöht auch Fragen im Zusammenhang mit Hintergrundgeräuschen zusammen. </li><li> Minimale Helligkeit. Wählen Sie einen Anfangshelligkeit von 20 für Exosom Messung, um diese Funktion als Filter zu verwenden. Regeln Sie diesen Parameter, bis zu leer aus stark lichtstreuenden Teilchen. Regulieren Sie es auf schwach verstärken Streuartefakten. Variieren Helligkeit während des Experiments nötig. HINWEIS: Partikel, die licht-streuen zu stark überlappen, und kann aus der Analyse aus Versehen ausgeschlossen werden kann. </li><li> Min- und Max-Größe. , Einen digitalen Filter, um Pixelrauschen und unerwünschte Streuung von übergroßen Teilchen durch Regulierung der Minimal- und Maximalgröße zu eliminieren. Verwenden Sie einen Bereich von 10 bis 500 Pixel zur Messung von Exosomen. </li><li> Shutter. Stellen Sie die Zeit, die die Kamera ist für 1/300 sec. </li></ol></li><li> Live-Auslesen von Parametern: <ol><li> Wechseln Sie zwischen einem digitalen und einem analogen Ansicht Modus jederzeit durch Klicken auf die &quot;Live-Bild&quot; -Taste. </li><li> Während des Experiments überwacht die Streuintensität Leiste, die den Sättigungszustand der Probe als eine farbcodierte Anzeige zeigt. Exosomen analysieren nicht, wenn die Streubalken rot. In einem solchen Fall weiterhin die Probe zu verdünnen, um dieses Phänomen zu vermeiden. Wenn die Versuchsbedingung verhindert eine Manipulation der Probensuspension, herunterregulieren die Empfindlichkeit oder hochregulieren die Helligkeit in der Software-sinstellungen um die Messergebnisse zu verbessern. ANMERKUNG: Bei Proben mit einer extrem hohen Konzentration von Partikeln analysiert die Streuung werden einzelne Teilchen zu verschmelzen, und sie werden als ein einzelnes Teilchen gezählt. </li><li> Beachten Sie die Anzahl von Teilchen in dem Sichtfeld der Anzeige gezählt. </li></ol></li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;Messen&quot;. </li><li> Wählen Sie die Einstellungen in der &quot;Ausführungsoptionen&quot; Array. <ol><li> Vor jeder Akquisition, wählen Sie &quot;Check Bewegung&quot; für eine wiederholte Prüfung Partikeldrift Test. Führen Sie den Test mindestens einmal vor dem Start der gesamten Analyse. Wenn die Drift höher als 20 &amp; mgr; m / sec, zu warten, bevor die Fortsetzung der Messung, so daß die Probe nicht mehr fließt. </li><li> Auswahl der Anzahl von Versuchen (5) und die Zeitverzögerung zwischen ihnen zu (0). </li><li> Führen Sie eine &quot;Stichprobenkontrolle&quot;, wenn nötig. Dieser Test ist Teil des Auto-Ausrichtung in der Startprozedur und können anschließend nach Bedarf wiederholt werden. </li&gt; </ol></li><li> Schließlich klicken Sie auf den &quot;Run Videoerfassung&quot; -Taste. In dem neuen Fenster definieren die Anzahl der Zyklen (15) und die Anzahl der Messpositionen (11). HINWEIS: Der Laserkopf und das Mikroskop bewegt, um die Partikelzahl bei 11 verschiedenen Positionen analysiert werden. Je nach experimentellen Nachfrage, ob der Versuch sollte auf einer einzelnen Position oder an unterschiedlichen Positionen durchgeführt werden. <ol><li> Bestätigen Sie die minimale Zeitdauer ein Teilchen verfolgt, als eine einzelne Partikel gezählt werden, indem Sie die Videoauflösung (low). Eine geringere Auflösung führt zu einer kürzeren Dauer Tracking. </li><li> Wählen Sie einen Dateinamen und klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um die Messung zu starten. </li></ol></li></ol> 4. Interpretation der Ergebnisse <ol><li> Sehen Sie die folgenden Ergebnisse und Parameter nach der Messung angezeigt auf der Registerkarte &quot;Ergebnisse&quot;: (1) Gesamtzahl der Partikel zurückzuführen, (2) durchschnittliche Zahl der Teilicles pro Position, und (3) Partikelkonzentration. <ol><li> Sehen Sie das Ergebnis durchschnittlich Tabelle für das Zahlenverhältnis der Teilchengröße (Durchmesser, Oberfläche und Volumen) auf den Anteil der Partikelanzahl sowie die Werte der Mittelwert und die Standard Differenzierung. </li><li> Verwenden Sie die Spitzenanalysetabelle, wenn mehr als ein Höhepunkt in der grafischen Analyse vorhanden ist. Diese Tabelle zeigt die Verteilung von Teilchen, die kleiner als die erste bzw. zweite Spitze sind. </li></ol></li><li> Sehen Sie sich die Grafik berechnet nach der Messung, um eine Verteilung der Partikel nach Größe zu sehen. Verwenden Sie die Symbole in den Anzeigemodus und über der Grafik, um die Einstellungen zu ändern. </li></ol>

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</ol>

Diese Arbeit wurde aus institutionellen Mitteln der Klinik für Herz- und Gefäßchirurgie der Medizinischen Fakultät der HHU unterstützt. Die Publikationskosten dieser Studie wurden von der Particle MetrixGmbH zur Verfügung gestellt.

Wir zeigen ein detailliertes Protokoll für Exosom isoliert von Blut und Gegenwart Nanopartikel Tracking als neuartige und innovative Methode, um Exosom Größe und Konzentration in einer biologischen Flüssigkeit zu messen. In den vorgestellten Experimenten wurde menschlichem peripheren Blut als Ursprung der Exosomen verwendet. Jedoch können auch andere Ursachen, wie etwa Urin, Sputum, Zellkulturüberstand etc., die auch als Testmaterial verwendet werden. Basierend auf der biologischen Variabilität exosome Konzentration beim Menschen kann von Tests verschiedener Individuen einen bemerkenswert unterschiedlichen Konzentration von Exosomen verfügen. Jedoch kann die Konzentration der Teilchen in dem biologischen Testsonde eine Auswirkung auf die Ergebnisse. Daher wird eine zuverlässige und Standardansatz für die Verdünnung der Proben notwendig. In der vorgestellten Methode wurde Exosom haltigen Plasma von 9 ml peripheres Vollblut erzeugt. Mit Differentialzentrifugation Schritte ein Exosom Pellet aus isoliert1 ml Plasma und in 5 ml destilliertem Wasser, um in der Arbeitsprobe ausgesetzt Exosomen führen resuspendiert. Diese vordefinierten Einstellung hat uns mit einer geeigneten Konzentration von Partikeln, dh entsprechende Streuintensität während NTA zur Verfügung gestellt. Neben dem Volumen und Verdünnen Aspekt ist die Zusammensetzung der Lösungen, die verwendet werden, von Bedeutung. Wir haben destilliertem Wasser für den letzten Resuspension von Exosomen verwendet. Natürlich können verschiedene Medien für die endgültige Verdünnung verwendet werden, je nach den Anforderungen des experimentellen Aufbaus. Im Fall des Zetapotentialmessungen von ionischen Lösungen, insbesondere für die Prüfung Proben mit Pufferkapazität ist jedoch eine vorsichtige Verdünnung in Turbulenz freien Bedingungen nützlich. Für den direkten Vergleich mehrerer Proben empfehlen wir halten die gleiche Verdünnungsstufe für alle Proben. Alle Einstellungen außer der Empfindlichkeit und der Bildauflösung kann anschließend mit der Zetaview Analysis Software geändert werden. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Obwohl die Autoren glauben, dass die hier vorgestellte System stellt derzeit das am besten geeignete Instrument, es ist nicht die einzige verfügbare NTA-System. Eine Reihe von früheren Berichten haben andere Systeme, die die gleichen Grundsätze gelten NTA, bieten aber ein anderes Instrument Design, das zusammen mit einigen unterschiedlichen Funktionen 10 geht beschäftigt. Wir glauben, dass die praktischen Aspekte bezüglich der Handhabung der Proben und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sind von zentraler Bedeutung bei der Auswahl der Methodensequenz für Exosom Auswertung. Wir glauben auch, dass eine ideale Erkennungssystem sollte benutzerabhängige Faktoren, die die Ergebnisse der Messungen stören, zu beseitigen. Die Exosom Analyse Ansatz, der hier präsentiert wird erfüllt das Kriterium der einfachen Handhabung zu einem hohen Grad. Als weiterer Vorteil ist die halbautomatische Analyse der Proben in einem schnellen Prozess durchgeführt wird, Erzeugen Ergebnisse in kurzer Zeit. Eine Online-Visualisierung von Exosomen hilft dem Analysator gain einem Augenblick Idee der Exosom Eigenschaften, zB Brutto-Konzentration. Eine sehr einfache, aber eleganten Neben der Meßtechnik präsentierten die Verwendung von Antikörper markiert Exosomen und die Erfassung der gestreuten Laserstrahl durch Verwendung eines vorhergehenden Filter vor dem Detektor. Auf diese Weise kann Exosom Subpopulationen entsprechend ihrer Oberflächenantigenen und anderen biologisch relevanten Eigenschaften, die technisch zugänglich selektiver Fluoreszenzfärbung sind zu unterscheiden. Ein Nachteil der gegenwärtigen Version unserer Particle Tracking Instrument ist die Tatsache, dass bei sehr hohen Empfindlichkeitsniveaus Artefakte wie Hintergrundrauschen vorhanden sein, die auf der Zellkanalwand basiert. Eine technische Lösung und Verbesserung des derzeitigen Systems verfügbar sein werden in der nahen Zukunft. Durch diese Methode Reflexionen des Laserlichtstreuung an der Kanalwand reduziert werden, wodurch die<html> die Genauigkeit der gemessenen Signale und erhaltenen Daten und Absenken der Nachweisgrenze. Obwohl die derzeit verwendete Protokoll für Exosom Isolierung ist gut etabliert und die aufgebrachte Partikelverfolgung Instrument hat eine bemerkenswert genaue Auflösung mit einer geringeren Größenverteilung von 30 nm, gibt es keine Garantie, dass die detektierten Partikel sind in der Tat ganz richtig Exosomen. Andere Teilchen, wie tot Zellfragmente oder größere Proteinkomplexe können auch im Exosom Suspension vorliegen und führen zu falsch positiven Signalen. Ein zuverlässiges Verfahren, mit denen solche &quot;Verschmutzung&quot; ausgeschlossen kann Elektronenmikroskopie (EM), entweder Übertragungs EM oder Scannen EM sein. Leider hat sich kein allgemeiner und spezifischer Marker für Exosomen wurden bisher identifiziert, obwohl eine Reihe von bisher vorgeschlagenen Oberflächenmarker haben eine zunehmende Menge an Aufmerksamkeit, einschließlich Tetraspanin (tspan), CD81, C63, CD9 usw. 11 gewonnen. &quot;&gt; Unabhängig von der künftigen Fortschritte der Forschung auf Exosom Biologie, insbesondere in Bezug auf Exosom spezifische Marker, das Protokoll, das hier vorgestellt wird, wird ein leistungsfähiges Verfahren zur Isolierung und zum Nachweis von Exosomen Verfügung zu stellen. Die Konzentration und Größe können leicht in einem softwaregestützten bestimmt werden einfache Art und Weise. Der Zusatz von selektiven Fluoreszenzmarkern oder Fluorophor gekoppelt Antikörper wird wahrscheinlich weiter erhöhen die Einsatzmöglichkeiten der vorgestellten Ansatz der NTA.

Die genaue Funktion des zirkulierenden Exosomen blieb lange Zeit unbekannt. Selbst jetzt der vollständige Pfad Mechanismus Exosomen ist nicht vollständig geklärt. Seit Exosomen tragen Antigene, Proteine ​​und RNA (mRNA und miRNA), die sie bezieht sich auf ihre elterlichen Ursprungszelle, ihre Funktion als Zell-Zell-Signalgeber wurde vor allem im Vordergrund. Viele unterschiedliche Verfahren werden in der Literatur für die Isolierung und quantitativen Nachweis von Exosomen 1,2 beschrieben. Jedoch keinen Konsens über eine &quot;Goldstandard&quot; erreicht wurde. Inzwischen ist die Mehrheit der Wissenschaftler auf dem Gebiet der Forschung tätig Exosom einig, dass eine konsistente Methode der Isolation ist sehr gerechtfertigt, um ein höheres Maß an Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Berichten und Studien zu erzielen. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist die häufigste und verbreitet Werkzeug zur Analyse exosome 3. FACS hat die beneFit, die über Fluoreszenzmarkierung, Zellen verschiedener Herkunft kann in einem Schritt verglichen werden. Die Hauptnachteile FACS sind, dass dieses Verfahren nicht empfindlich genug ist, um Teilchen, die kleiner als 0,5 um 4 zu identifizieren, während Exosomen sind im Allgemeinen zwischen 30-120 nm Durchmesser 5, sogar noch weniger, um ihre Größe zu messen. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sind andere Werkzeuge für die Analyse der Partikelgröße und die Morphologie der Exosomen. Sowohl SEM und TEM haben jedoch den Nachteil, dass die Probenvorbereitung ist zeitaufwendig, wobei beide Verfahren beinhalten arbeitsintensive Schritte, und jeder hat ein gewisses Risiko einer Artefakterzeugung. Beide Verfahren sind für einen hohen Probendurchsatz und Charakterisierung von mehreren tausend Einzelpartikeln einer Probe. Darüber hinaus, um eine quantitative Analyse der klinischen Alltag, wo Proben oft gleichzeitig oder zumindest in einem sehr kurzen Zeitraum analysiert werdenschwierig durchzuführen. Techniken der neuen Generation jetzt können wir Exosomen ohne vorherige intensive Vorbereitungsarbeiten (zB Umwelt SEM) analysiert. Die modernen Techniken sind immer noch für die Analyse von großen Volumen Suspensionen, die Exosomen, ihre durchschnittliche Anzahl und Größenverteilung 6 bestimmen eher unbequem. Ein weiteres hochempfindliche Methode zur Visualisierung und Analyse von Exosomen ist Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Dieses Verfahren nutzt den Vorteil von zwei unterschiedlichen physikalischen Prinzipien. Zunächst werden Teilchen, die durch das Licht gestreut, wenn sie mit einem Laserstrahl bestrahlt werden erkannt. Das zweite Phänomen ist als Brownsche Bewegung bekannt, wonach die Diffusion verschiedener Partikel in einer flüssigen Suspension ist umgekehrt proportional zu ihrer Größe. Im letzteren Fall hängt die Bewegung auch von der Temperatur und der Viskosität der Flüssigkeit. Dennoch ist diese Rate direkt an Partikelgröße bezogen und wird von NTA verwendet. Über Software-basierte Analyse, digitale Bilder von Streulicht aus einzelnen Teilchen werden aufgezeichnet. Grundstreulichtflecken und ihre Bewegungsgeschwindigkeit liefern die Daten, die die Bestimmung der Gesamtpartikelanzahl und Größenverteilung zu erleichtern. Diese Technik ist besonders leistungsfähig für die Analyse von Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm. Die Größe und Konzentrationsmessungen mit dem Zetaview Brownsche Bewegung und Elektrophorese Videoanalyse-Mikroskop durchgeführt. Dies ist ein halbautomatisches Tischnanopartikelanalysegerät für flüssige Proben (im folgenden als der Partikelverfolgungsinstrument bezeichnet). Es besteht aus der Partikelbewegung Analysator sowie einen Laptop mit der für die Datenanalyse verwendet Software. Heterogenen biologischen Proben sind für dieses Verfahren geeignet als homogener Suspensionen von anorganischen Partikeln. Ein Laserstreuung-Mikroskop mit einer Videokamera zur Erfassung von Teilchen und für die Obse verwendetrvation ihrer Bewegung. Während die Mikroskopachse horizontal ist und in den Zellkanal mit einer Suspension, die Exosomen gefüllt fokussiert, wird der Laserstrahl vertikal ausgerichtet. Die Teilchen, die durch die Laserlichtstreuung, die unter 90 ° von einer digitalen Videokamera über die Mikroskop (siehe Abbildung 1) bestrahlt wird. Die Intensität des gestreuten Lichts ermöglicht die Beobachtung der Teilchen größer 60 nm Durchmesser. In einer solchen Einstellung wird die Helligkeit eines Teilchens ist nicht die einzige Indikation der Partikelgröße. Wenn kein elektrisches Feld angelegt wird, nur Teilchenbewegung folgt Brownsche Bewegung und kann als Indikator für die Berechnung der Teilchengröße dienen. Jedoch ist das Gerät auch in der Lage, das Anlegen eines elektrischen Feldes über dem Zellenkanal. Wenn zu diesem Feld ausgesetzt wird, das Potential, Polarität und das Niveau der Ionenladung der suspendierten Exosomen werden weitere Determinanten für die Richtung der Bewegung an. Geschwindigkeit und Richtung ergeben eine elektrophoretische mokeit Histogramm. Während der Suche nach einer optimalen Methode isoliert Exosomen analysieren ist ein Problem, liegt ein weiterer in der wirksamen Isolierung von Exosomen aus unterschiedlichen Medien, wie etwa Blut, Aszites, Urin, Milch, Fruchtwasser oder Zellmedien. Verschiedene Methoden wurden bisher die basieren beschrieben, auf Ultrazentrifuge 1, industrielle Trennung Reagenzien (wie Exoquick) 7, magnetische Kügelchen für Antigen Einsatz Trennung 8 oder Ultrafiltration Schritte 9. In diesem Protokoll zeigen wir den gesamten Prozess der Exosom Trennung über Ultrazentrifugation und zeigen, wie man die resultierende Exosom enthaltende Suspension über die Partikelverfolgung Instrument analysieren. Besondere Erwägungen für die Analyse von menschlichem Plasma oder Zellkulturmedium abgeleitete Exosomen bereitgestellt.

<table><tbody><tr><td>Citratröhrchen</td><td>BD</td><td>364305</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>Braun</td><td>3880087</td><td>Aqua ad iniectabilia</td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td>PP Röhrchen, steril 15 ml</td></tr><tr><td>Ultrazentrifugationsröhrchen</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td>Microfuge Röhrchen Polyallomer 1,5 ml</td></tr><tr><td></td><td>Polybead Polysciences, Inc.</td><td>07304</td><td>2,6 % Feststoff-Latex Ausrichtungslösung</td></tr><tr><td>Spritze (Filter)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Spritze (ZetaView)</td><td>Braun</td><td>4606051V</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Nadel</td><td>BD</td><td>305180</td><td>BD stumpfe Nadel</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555</td><td>Spritzenfilter, hydrophil, 450 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td>L8-M</td><td>Rotor: 70Ti Ser.-Nr E21078</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX 100, Typ 101</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Rotor: A-4-44</td></tr></tbody></table>

eine innovative methode zur quantifizierung und exosom size measurement

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Obwohl die biologische Bedeutung von Exosomen in letzter Zeit zunehmend an wissenschaftlicher und klinischer Aufmerksamkeit gewonnen hat, ist noch viel über ihre komplexen Wege, ihre Bioverfügbarkeit und ihre vielfältigen Funktionen bei Gesundheit und Krankheit unbekannt. Aktuelle Arbeiten konzentrieren sich auf das Vorhandensein und das Verhalten von Exosomen (sowohl in vitro als auch in vivo) im Kontext verschiedener menschlicher Erkrankungen, insbesondere in den Bereichen Onkologie, Gynäkologie und Kardiologie.
Leider gibt es weder einen Konsens über einen Goldstandard für die Isolierung von Exosomen, noch gibt es eine Einigung über eine solche Methode für ihre quantitative Analyse. Da es viele Methoden zur Aufreinigung von Exosomen und auch viele Möglichkeiten zu deren quantitativer und qualitativer Analyse gibt, ist es schwierig, eine Kombination von Methoden für den idealen Ansatz zu bestimmen. 
Hier demonstrieren wir die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), eine halbautomatische Methode zur Charakterisierung von Exosomen nach Isolierung aus menschlichem Plasma durch Ultrazentrifugation. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz zur Isolierung sowie die Bestimmung der durchschnittlichen Anzahl und Größe von Exosomen reproduzierbare und valide Daten liefert, wie z.B. andere Methoden, wie z.B. die Rasterelektronenmikroskopie (REM), bestätigen.

Die für diese Demonstration verwendete Probe zeigt eine optimale Einstellung für die Messung mit einer Sensitivität von 85%, bevor die maximale Steigung der Empfindlichkeitskurve (Figur 2). Die Helligkeit, die Min / Max-Werte wurden ausgewählt, wie im Protokoll empfohlen. Eine Konzentration von 5,3 Teilchen / ml x 10 6 wurde gemessen, während die mittlere Größe der Teilchen 0,149 um, die meisten von ihnen 0,137 um. Die nach der Messung empfangenen Werte können in einem Bericht mit einem Dateiformat PDF oder als TXT für den Export in eine Datenbank gespeichert werden. Die Grafik kann eingestellt Bevorzugt seien wie im Protokoll (Abschnitt 4) beschrieben. Die Videosequenz wird ebenfalls gespeichert und kann für die spätere off-line erneute Analyse verwendet werden. Jedoch in solch einem off-line-Analyse, die vor der Akquisition Einstellungen der Kamera können nachträglich nicht verändert werden. Um die optimalen Parameter für eine Messung zu finden, beschreiben wir hier the Optimierung der Geräteeinstellungen am Beispiel eines 100 nm Polystyrolgrößenstandard. Der Einfluss von zwei Parametern, die Empfindlichkeit und Min / Max Größe für Videobild und die Partikelgrößenverteilung wird im Detail diskutiert. Alle anderen Parameter sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Eine visuelle Eindruck der Auswirkungen der Empfindlichkeit (im Bereich von 50 bis 94) über analoge und digitale Bilder ist in Figur 3 sichtbar gemacht. Die quantitative Informationen aus den Bildern abgeleitet ist, ist in 4 dargestellt, basierend auf den Einstellungen in der Tabelle 1 Min Size = 5 und Max.Grösse = 200. Ein typisches Verhältnis der Anzahl der detektierten Teilchen vs. Empfindlichkeit wird in 4A gezeigt. Zwischen 50 und 90, die Zahl der detektierten Partikel erhöht mit Sensibilität und stieg dramatisch für Empfindlichkeiten&gt; 90. Ein optimaler Bereich der Empfindlichkeit zwischen 66 und 86 (A) gefunden. Partikelgrößenverteilungen mit dif erhaltenschiedliche Empfindlichkeitseinstellungen sind in 4B gezeigt. Die Partikelgrößenverteilungen stellen den Mittelwert aus drei Einzelmessungen. Bei einer zu geringen Empfindlichkeit (Sensitivität = 62, rote Kurve) nur wenige Partikel wurden analysiert, was zu eher schlechte Statistik. Die Anzahl der analysierten Partikel erhöht mit Sensibilität und erreicht ein Optimum zwischen 70 (gelbe Kurve) und 86 (tan Kurve). Eine weitere Erhöhung der Empfindlichkeit führen zu einer Verschlechterung der Partikelgrößenverteilung mit der Anzahl der Partikel fallen und Grßenverteilung Verschiebung zu kleineren Größen (Empfindlichkeit = 94, blaue Kurve). 4C zeigt den Trend der Anzahl basiert x50 Durchmesser (50% der Teilchen kleiner sind als dieser Durchmesser) als eine Funktion der Sensitivität. In der beige-Intervall, die RSD der Teilchengröße betrug weniger als 8% und entspricht dem optimalen Intervall in A. Die roten Bereiche zeigen als Folge der schlechten Statistik (Empfindlichkeit zu gering) oder breit distri RSD&gt; 8%träge mit Verschiebung zu kleineren Größen (Empfindlichkeit zu hoch). Die Einstellungen der Mindestgröße und Maximale Größe sind Filter, digitale Bilder, um Teilchen mit Spotgrößen kleiner als Mindestgröße und größer als Max Größe zu entfernen. Aufgrund der Fähigkeit, Licht zu streuen, erzeugt ein Teilchen eine Stelle mit einer bestimmten Größe auf einem digitalen Bild. Die Größe des Punktes als eine Anzahl von Bildpunkten (Pixel) gemessen. Wenn ein Teilchen streut das Licht sehr gut (zB Partikel&gt; 200 nm oder Aggregate), ist die Punktgröße recht groß, zB&gt; 500 px. Die Punktgrße ist ziemlich klein (zB &lt;10 Pixel) für kleine Teilchen (zB &lt;20 nm) in Abhängigkeit von der Partikelmaterial. Fleckgrße (px) nicht mit Teilchengröße (nm) gegeneinander ausgetauscht werden, wenn sie nicht identisch sind, und es gibt keine direkte Beziehung zwischen diesen beiden Variablen. Eine Optimierung der Min- und Max-Größe ermöglicht es dem Benutzer, wie Agglomerate (Max Size) oder kleine Ausfiltern unerwünschter ObjekteObjekte wie Hintergrundgeräusche (Min Size). Der Einfluss der Min / Max Größe von der Partikelgrößenverteilung eines 100 nm-Größenstandard ist in Figur 4D (Empfindlichkeit = 82) gezeigt. Wenn das Intervall auf kleine Messfelder gesetzt ist (zB min = 1, max = 52; orange Kurve), die Anzahl der analysierten Partikel reduziert und die Anzahl der Basis x50 Durchmesser leicht nach kleineren Größen verschoben. Eine Einstellung für größere Flecken (min = 40, max = 1.000; rote Kurve) führt zu einer breiten Partikelgrößenverteilung verschoben hin zu größeren Größen. Um gleiche Gesamtzahl der Partikel zu erhalten, wurden die Intervallgrenzen der beiden orange und rot-Distributionen angepasst werden, um 80 Teilchen entsprechen. Die Verteilung mit den optimalen Einstellungen (min = 5, max = 200; tan Kurve) besteht aus 360 Teilchen. Eine Reihe von erfolgreichen Experimente wurden mit Exosomen durch Ultrazentrifugation isoliert und NTA, gemessen unter Verwendung des dargestellten Systems durchgeführt. Die erhaltenen Daten waren höchstkonsistent und bestätigten eine hohe Reproduzierbarkeit. Andere Isolierungsmethoden sollten ähnliche Ergebnisse. Jedoch wurde der Verdünnungsschritt als ein besonders kritischer Schritt identifiziert und neu bewertet werden die Auswirkungen auf die berechnete Gesamtanzahl von Partikeln aufweist. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Aufbaus der NTA. Das Mikroskop / Video-Achse und Laserstrahl sind orthogonal zueinander orientiert, kreuzen an der Zellkanalquerschnitt. Licht von den Teilchen gestreut wird im Fenster &quot;Live-Ansicht&quot; der Software angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. Anzahl der Partikel gegen Empfindlichkeitskurve. Die Anzahl der Partikel gegen Empfindlichkeitskurve zeigt die Partikel in einer Position in einem Moment während einer automatischen Empfindlichkeits Scan. Diese grafische Darstellung wird verwendet, um die besten Einstellungen für die ersten Messungen zu bestimmen. Eine Empfindlichkeitswert gewählt wird, bevor die maximale Steigung des Graphen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Artefakte werden in diesem Testversuch beseitigt und können den Graphen beeinflussen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Abbildung 3. Auswirkungen der Empfindlichkeit an analogen und digitalen Bild. Visualisierung von Partikeln auf der Live-Bildansicht wird Empfindlichkeiten zwischen 50 und 94 für analoges (obere Reihe) eine Anzeiged digital (untere Reihe) Blick. Wenn die Empfindlichkeit zu niedrig ist, sind nur wenige Teilchen detektiert (links). Auf optimale Empfindlichkeit erscheinen die Partikel als einzelne Punkte gut voneinander (Mitte) isoliert. Auf einem vergleichsweise hohen Empfindlichkeit Partikel verschmelzen mit der schlechten Bildqualität (rechts) führen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Abbildung 4. Einfluss von Empfindlichkeit min und max Formateinstellungen für eine Steuer 100 nm Polystyrolpartikelprobe (A) Plot der Empfindlichkeit gegenüber erkannt Anzahl der Teilchen. das optimale Intervall von 66 bis 86, vor der der maximalen Steigung der Kurve. (B) Partikelgrößenverteilungen mit verschiedenen Empfindlichkeitseinstellungen (62-94 erhalten); Graphen für zu niedrig (62) oder zu hoch (94) Empfindlichkeit erfassen nicht die Partikelgrößenverteilung für die 100 nm Polystyrol Kontrollprobe. (C) Anzahl der Basis x50 Durchmesser gegenüber Empfindlichkeit; der Fehler in der x50 beige Intervall weniger als 8%, ist von 66 auf 86 (D) Auswirkungen von Min- und Max-Größe auf der Partikelgrößenverteilung optimal Intervall; optimalen Parametern (min = 5 und max = 200) erfassen die korrekte Verteilung für die Kontrollprobe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Pre-Erfassungsparameter </td></tr><tr><td> Empfindlichkeit </td><td> Variable </td></tr><tr><td> Verschluss </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Bildrate </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Auflösung </td><td> Hallogh </td></tr><tr><td> Cycles </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Mehrere Übernahmen </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Position </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Post-Erfassungsparameter </td></tr><tr><td> Min Helligkeit </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Größe </td><td> Variable </td></tr><tr><td> Mindestgröße </td><td> Variable </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Zusammenfassung der vor und nach der Aufnahme-Parameter zur Einstellung der Partikelverfolgung Instrument.

In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung von Exosomen aus Vollblut und zur weiteren Analyse durch Nanopartikel-Tracking mit einem halbautomatischen Instrument vorgestellt. Die vorgestellte Technologie bietet eine äußerst empfindliche Methode zur Visualisierung und Analyse von Partikeln in flüssiger Suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Exosome nach ihrer Größe zu analysieren und sie mithilfe eines Instruments zur Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) über eine halbautomatische Methode zu quantifizieren. Dies wird durch differenzielle Zentrifugationsschritte erreicht, um ein Exosomen-Pellet aus menschlichem Blut zu gewinnen. Die Exosome werden in einer vorab bestimmten Konzentration je Menge des verwendeten Ausgangsplasmas resuspendiert, um die geeignete Streuintensität zu erzielen.Während der NTA wird die Suspension dann filtriert, um Exosomen von größeren Partikeln zu trennen. Anschließend erfolgt eine Kalibrierung des NTA-Geräts mithilfe einer Kontrollsuspension, die 200 Nanometer große Polystyrolpartikel enthält. Die Exosomenlösung wird danach in das NTA-Gerät injiziert, und die optimale Einstellung des NTA wird ausgewählt, indem vor dem endgültigen Test ein Vortest durchgeführt wird.Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine Quantifizierung aller gemessenen Partikel sowie eine Auflistung der Partikel nach ihrer Größe zeigen. Die Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Lösung und die Einstellung für jede hergestellte Exosomenlösung individuell durchgeführt werden muss, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die gemessenen Exosomen sollten in einer I-Konzentration vorliegen, sodass im Live-Ansicht-Modus etwa 600 Partikel pro Bildschirm angezeigt werden.Außerdem sollte ein Vortest durchgeführt werden, um den optimalen Empfindlichkeitsbereich für die Messung zu ermitteln. Eine hohe Empfindlichkeitseinstellung führt zwar zur Visualisierung kleinerer Partikel, erhöht jedoch auch Probleme durch Hintergrundrauschen. Das Verfahren wird von Anto May, einem Doktoranden aus unserem Labor, demonstriert. Um mit der Exosomen-Präparation zu beginnen, sammeln Sie Vollblut aus drei Zitratröhren mittels Venenpunktion für insgesamt neun Milliliter.Danach das Blut in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen geben und die Probe bei 1.500 ×g 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um die Trennung der Zellen vom Plasma einzuleiten. Überstand in ein neues 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführen. Anschließend die Probe erneut bei 2.800 ×g 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um alle Zellen aus dem Plasma zu entfernen.Überführen Sie das zellfreie Plasma oder CFP in Ultrazentrifugenröhrchen mit jeweils einem Milliliter pro Röhrchen. Zentrifugieren Sie das CFP anschließend bei 100.000 ×g für 90 Minuten bei vier Grad Celsius, um Exosome zu entfernen. Entfernen Sie 900 Mikroliter Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in den verbleibenden 100 Mikrolitern im Ultrazentrifugenröhrchen.Nach Zugabe von 900 Mikrolitern PBS Zentrifugieren Sie bei 100.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Wie zuvor entfernen Sie 900 Mikroliter des Überstandes und resuspendieren die Pellets in den verbleibenden 100 Mikrolitern. Überführen Sie fünf bis 20 Mikroliter der Resus-Suspension in 40 Milliliter destilliertes Wasser.Filtern Sie die Suspension durch einen 450 Nanometer-Filter, um Exosome von größeren Partikeln zu trennen. Verwenden Sie diese endgültige Suspension zur Partikelzählung mit dem Partikel-Tracking-Gerät. Starten Sie zunächst das Programm, indem Sie doppelt auf das Software-Symbol klicken.Klicken Sie während des Protokolls auf die verschiedenen Software-Registerkarten, um zwischen ihnen zu wechseln. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm. Wählen Sie die Kontrollkästchen für die Zellqualitätsprüfung und die automatische Ausrichtung aus, um die Startprozedur automatisch durchzuführen.Entweder dieser Schritt kann bei Bedarf separat wiederholt werden, indem die Taste A oder B auf der Zellenprüftaste gedrückt wird. Stellen Sie einen Becher unter den Auslasshafen, um die Abflüssigkeit aufzufangen, und injizieren Sie keine Luftblasen in das System. Öffnen Sie den Einlass- und Auslasshafen des Nanopartikel-Tracking-Analysesystems oder NTA-Instruments und injizieren Sie 10 Milliliter destilliertes Wasser mittels Spritze durch den Einlasshafen in den Zellkanal.Schließen Sie den Einlass- und Auslasshahn sofort, während die letzte Wassermenge injiziert wird. Stellen Sie sicher, dass die Messzelle frei von Luftblasen ist. Führen Sie die Qualitätsprüfung der Zelle durch, indem Sie auf Okay klicken.Die Software zeigt nach einigen Sekunden das Ergebnis der Zellqualitätsprüfung an. Wenn weiterhin Partikel im Live-Ansichtsfenster der Software sichtbar sind oder das Ergebnis der Qualitätsprüfung lediglich als gut oder schlecht eingestuft wird, wiederholen Sie die distale Wassereinspritzung, bis die verbleibenden Partikel aus der Messzelle L entfernt sind. Wiederholen Sie diesen Schritt außerdem nach jeder Messung, um eine Ansammlung von Partikeln zu vermeiden. Bereiten Sie anschließend eine Kontrollsuspension vor, die gleichförmige Polystyrolpartikel mit einer Größe von 200 Nanometern enthält. Um die Fokussierung von Laser und Mikroskop auszurichten, geben Sie einen Tropfen der von dem Gerätehersteller bereitgestellten Suspensoinkonzentrat in 500 Milliliter destilliertes Wasser, um die erforderliche Konzentration zu erreichen, sodass 600 ± 100 Partikel pro Bildschirm in der Live-Ansicht angezeigt werden.Spritzen Sie die Ausrichtungssuspension in das NTA-Gerät ein, wie zuvor bei dem destillierten Wasserdruck. Es ist in Ordnung, ebenfalls die Ausrichtung zu starten, ein automatisierter Vorgang, bei dem das System automatisch die optimale Position der beiden Fokuspunkte findet. Wenn eine Meldung erscheint, die besagt, dass das System nun bereit für Experimente ist, klicken Sie auf „Okay“, um die Messung zu beginnen.Reinigen Sie den Zellkanal gelegentlich manuell zwischen Experimenten, indem Sie die Zelle mit einer 30%igen Ethanol-Lösung spülen. Reinigen Sie den Kanal immer dann, wenn die Software eine automatische Fehlermeldung anzeigt. Um die Messung des Systems durchzuführen.Zuerst spülen Sie den Kanal vor jeder Probenmessung mit destilliertem Wasser durch. Anschließend injizieren Sie die Exosomen-Suspension in den Kanal. Danach passen Sie die Hauptparameter in der Software an, um die Empfindlichkeit einzustellen.Finden Sie den optimalen Empfindlichkeitsbereich, indem Sie auf die Anzahl der Partikel in Abhängigkeit von der Empfindlichkeit klicken, um eine Kurve mit der Anzahl gemessener Partikel pro Bildschirm für verschiedene Empfindlichkeitsstufen anzuzeigen. Wählen Sie eine Empfindlichkeitsstufe vor der maximalen Steigung der Kurve. Eine höhere Empfindlichkeit ermöglicht die Visualisierung kleinerer Partikel, erhöht jedoch auch Probleme im Zusammenhang mit Hintergrundrauschen.Um die Mindesthelligkeit einzustellen, wählen Sie eine Start-Helligkeit von 20 für die Exosomenmessung. Um diese Funktion als Filter zu nutzen, regulieren Sie diesen Parameter nach oben, um stark streuende Partikel auszublenden. Regulieren Sie ihn nach unten, um schwach streuende Artefakte zu verstärken, und passen Sie die Helligkeit nach Bedarf im Verlauf des Experiments an. Als Nächstes setzen Sie einen digitalen Filter zur Eliminierung von Pixelrauschen und unerwünschten Streulicht-artigen, überdimensionalen Partikeln ein. Durch Einstellung der minimalen und maximalen Größe verwenden Sie einen Bereich von 10 bis 500 Pixeln zur Messung von Exosomen. Stellen Sie den Verschluss ein, indem Sie die Belichtungsdauer, also die Zeit, in der die Kamera geöffnet ist, ändern; setzen Sie den Verschlusswert auf 300, was 3,3 Millisekunden entspricht.Um die Parameter der Live-Anzeige anzupassen, wechseln Sie jederzeit zwischen einem digitalen und einem analogen Ansichtsmodus, indem Sie auf die Live-Bild-Schaltfläche klicken. Überwachen Sie während des gesamten Experiments die Streuintensitätsanzeige, die den Sättigungszustand der Probe als farbcodierten Indikator anzeigt.Analysieren Sie Exosome nicht, wenn die Streubar rot ist. Klicken Sie auf den Messreiter, um die Messung zu starten. Wählen Sie die Einstellungen im Ausführungsoptionen-Array.Vor jeder Aufnahme die Bewegungsprüfung auswählen, einen wiederholten Partikeldrifttest durchführen, die Anzahl der Experimente sowie die Zeitverzögerung zwischen ihnen festlegen. Bei Bedarf eine Probeprobe durchführen. Abschließend auf die Schaltfläche „Laufende Videoaufnahme starten“ klicken.Definieren Sie im neuen Fenster die Anzahl der Zyklen und die Anzahl der Messpositionen. Bestätigen Sie die minimale Zeitdauer. Ein Partikel wird verfolgt und als einzelner Partikel gezählt.Indem die Videomessung auf eine niedrigere Auflösung eingestellt wird, verkürzt sich die Dauer der Positionsverfolgung. Abschließend einen Dateinamen auswählen und auf „Okay“ klicken, um die Messung zu starten. Die Kurve der Anzahl von Teilchen in Abhängigkeit von der Empfindlichkeit zeigt die Teilchen an einer Position zu einem bestimmten Zeitpunkt an.Während eines automatischen Empfindlichkeitsscans wird ein Empfindlichkeitswert vor der maximalen Steigung des Graphen gewählt. Artefakte werden in diesem Testexperiment nicht eliminiert und können den Graphen beeinflussen. Die Visualisierung von Partikeln auf dem Live-Anzeigebildschirm ist hilfreich, um den richtigen Empfindlichkeitswert einzustellen.Ein zu niedriger Wert führt zur Detektion nur weniger Partikel. Ein zu hoher Wert hingegen ergibt ein schlechtes Bild; bei optimaler Empfindlichkeit erscheinen die qualitativ guten Partikel als einzelne, gut voneinander isolierte Punkte. Die Ergebnisregisterkarte nach der Messung ermöglicht die Auslesung von Parametern, einschließlich der Gesamtanzahl der verfolgten Partikel, der durchschnittlichen Anzahl Partikel pro Position und der Partikelkonzentration, sowie des numerischen Verhältnisses der Partikelgröße zur prozentualen Anzahl der Partikel.Der nach der Messung berechnete Graph zeigt die Verteilung der Partikel nach Größe an. Symbole im Anzeigemodus können verwendet werden, um die Einstellungen des Graphen zu ändern. Außerdem gibt es verschiedene Möglichkeiten, Exosomen zu analysieren.Diese Methode zeigt ein sehr einfaches und elegantes Verfahren, um eine ähnliche Methodenanalyse in einem schnellen Prozess durchzuführen, um Ergebnisse in kurzer Zeit zu erzeugen. Um mehrere Proben vergleichen zu können, empfehlen wir, denselben Verdünnungsgrad für alle Proben beizubehalten. Alle Einstellungen außer der Empfindlichkeit und der Videoauflösung können anschließend mithilfe einer kleinen Analyse-Software geändert werden.Auf diese Weise steht ein vergleichender Ansatz für die Analyse von in unterschiedlichen Experimenten gewonnenen Daten zur Exosomenanzahl und -größe in halbautomatischer Form zur Verfügung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt die Verwendung von Dunkelfeldmikroskopie mit geringer Vergrößerung zur Quantifizierung spezifischer Exosomen in biofluidischen Proben mit kleinem Volumen. Die so identifizierten Exosomen können als potenzielle Biomarker für Krebs dienen.

Antikörper-konjugierte Nanopartikel-basierte Quantifizierung mittels Dunkelfeldmikroskopie: Ein Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung spezifischer Exosomen aus Körperflüssigkeiten

Dieses Video beschreibt eine dichtebasierte Ultrazentrifugationstechnik zur Isolierung von Exosomen aus konditionierten Medien, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellkulturen unter Verwendung eines in Deuteriumoxid hergestellten 25% (w/w) Saccharosekissens gewonnen wurden. Die isolierten Exosomen können für Downstream-Anwendungen eingesetzt werden.

Exosomenisolierung: Eine dichtebasierte Ultrazentrifugationstechnik, bei der Saccharosekissen verwendet werden, um Exosomen von konditionierten Medien kultivierter Zellen zu trennen

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin unter Verwendung einer modifizierten Fällungstechnik.

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Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung.

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Exosomen sind mikrovesikuläre Strukturen, die in Bioflüssigkeiten vorkommen und möglicherweise wichtige krankheitsdiskriminierende Biomarker tragen. Hier wird eine neuartige Methode verwendet, um Exosomen spezifisch zu extrahieren und die exosomale Fracht für beide RNA/Protein-Ziele nach dem Aufschluss von Exosomen mit ungleichmäßigen elektrischen zyklischen Rechteckwellen schnell zu testen.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Dieses Protokoll beschreibt die Machbarkeit, miRNA-Profiling in Exosomen, die im Plasma von NSCLC-Patienten freigesetzt werden, durch ein kommerzielles Exosomen-Isolationskit mit Proteinase K- und RNAse-Behandlungen durchzuführen, um eine Kontamination mit zirkulierenden miRNAs zu vermeiden und ihre Biomarker-Eigenschaften bei NSCLC zu bewerten.

Exosomalen miRNA-Analyse in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) der Patienten Plasma durch qPCR: ein gangbarer Flüssiges Biopsy-Tool

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Die klinische Übersetzung von exosominierten Biomarkern für kranke und bösartige Zellen wird durch das Fehlen schneller und präziser Quantifizierungsmethoden behindert. Dieser Bericht beschreibt den Einsatz von Mikroskop-Bildern mit geringer Vergrößerung im Dunkelfeld, um bestimmte exotische Subtypen in kleinen Volume-Serum-oder Plasmaproben zu quantifizieren.

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Wir zeigen, wie man ein neuartiges Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument verwendet, um die Größenverteilung und Gesamtpartikelkonzentration von extrazellulären Vesikeln abzuschätzen, die aus dem periigonadalen Fettgewebe der Maus und dem menschlichen Plasma isoliert wurden.

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

In diesem Artikel wird eine neue Generation multiparametrischer Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von extrazellulären Vesikel-Untergruppen vorgeschlagen. Die Methode basiert auf einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie, gekoppelt mit Raman-Spektroskopie, um vesikuläre Ziele zu qualifizieren, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind.

Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen

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