Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Ziel dieses Verfahrens ist es, Exosomen nach ihrer Größe zu analysieren und sie mit Hilfe einer Nanopartikel-Tracking-Analyse oder eines NTA-Instruments durch eine halbautomatische Methode zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem differentielle Zentrierschritte verwendet werden, um ein Exosom-Pellet aus menschlichem Blut zu gewinnen. Die Exosomen werden in einer Konzentration resuspendiert, die für die Menge des Ausgangsplasmas vorgegeben ist, um die entsprechende Streuintensität zu erreichen.

Während der NTA wird die Suspension dann filtriert, um Exosomen von größeren Partikeln zu trennen. Als nächstes wird eine Kalibrierung des NTA-Instruments mit einer Kontrollsuspension durchgeführt, die 200 Nanometer große Polystyrolpartikel enthält. Die Exosomenlösung wird dann in das NTA-Instrument injiziert und die ideale Einstellung des NTA wird ausgewählt, indem ein Vortest durchgeführt wird, bevor der endgültige Test durchgeführt wird.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine Quantifizierung aller gemessenen Partikel und eine Auflistung der Partikel nach ihren Größen zeigen. Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Lösung und die Einstellung für jede vorbereitete Exosomenlösung individuell durchgeführt werden müssen, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Die gemessenen Exosomen sollten in einer I-Konzentration liegen, so dass im Live-View-Modus etwa 600 Partikel pro Bildschirm angezeigt werden.

Außerdem sollte ein Pretest durchgeführt werden, um den optimalen Empfindlichkeitsbereich für die Messung zu finden. Eine hohe Einstellung der Empfindlichkeit führt zur Visualisierung von mehr kleinen Partikeln und erhöht auch die problematischen Hintergrundgeräusche. Das Verfahren wird von Anto May, einem Doktoranden aus unserem Labor, demonstriert. Um mit der Exosomenpräparation zu beginnen, entnehmen Sie Vollblut in drei Citratröhrchen mittels Venenpunktion für insgesamt neun Milliliter.

Gießen Sie dann das Blut in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen, zentrifugieren Sie die Probe bei 1.500 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Trennung der Zellen vom Plasma einzuleiten. Übertragen Sie die S-Röhre auf eine neue 15-Milliliter-Falcon-Röhre. Dann zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 2.800 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um alle Zellen aus dem Plasma zu entfernen.

Das zellfreie Plasma oder CFK wird mit einem Milliliter pro Röhrchen in Ultrazentrifugationsröhrchen überführt. Als nächstes zentrifugieren Sie das CFP bei 100.000 g für 90 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Exosomen zu erschöpfen. Entfernen Sie 900 Mikroliter Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in den restlichen 100 Mikrolitern im Ultrazentrifugationsröhrchen.

Nach der Zugabe von 900 Mikrolitern PBS-Zentrifuge gewinnen Sie 30 Minuten lang bei 100.000 g bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie wie zuvor 900 Mikroliter des Rückenmittels und resuspendieren Sie die Pellets mit den restlichen 100 Mikrolitern. Übertragen Sie fünf bis 20 Mikroliter der Resus-Suspension auf 40 Milliliter destilliertes Wasser.

Filtern Sie die Suspension durch einen 450-Nanometer-Filter, um Exosomen von größeren Partikeln zu trennen. Verwenden Sie diese endgültige Suspension für die Partikelmessung, um das Partikelverfolgungsinstrument zu verwenden. Starten Sie zunächst das Programm mit einem Doppelklick auf das Software-Symbol.

Klicken Sie auf die verschiedenen Software-Registerkarten, um im Protokoll zwischen ihnen zu wechseln. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm. Für eine automatisierte Implementierung des Startvorgangs aktivieren Sie die Kontrollkästchen für die Überprüfung der Zellqualität und die automatische Ausrichtung.

Jeder dieser Schritte kann bei Bedarf separat wiederholt werden, indem Sie die Taste A oder B auf der Zellenkontrolllasche drücken. Platzieren Sie ein Becherglas unter der Aussichtsöffnung, um die Abfalllösung aufzufangen, und injizieren Sie keine Luftblasen in das System. Öffnen Sie den Einlass- und Ausblick des Nanopartikel-Tracking-Analyse- oder NTA-Instruments und injizieren Sie 10 Milliliter destilliertes Wasser mit einer Spritze durch den Einlassanschluss in den Zellkanal.

Schließen Sie die Einlass- und Auslassöffnung sofort, wenn die letzte Wassermenge eingespritzt wird. Stellen Sie sicher, dass die Messzelle frei von Luftblasen ist. Führen Sie die Überprüfung der Zellqualität durch, indem Sie auf klicken. Okay.

Die Software zeigt das Ergebnis der Zellqualität nach einigen Sekunden an, wenn noch Partikel im Live-View-Bildschirm der Software sichtbar sind oder wenn das Ergebnis der Qualitätsprüfung nur gut oder schlecht ist, wiederholen Sie die distale Wasserinjektion, bis die restlichen Partikel aus der Messzelle L entfernt sind. Wiederholen Sie diesen Schritt nach jeder Messung, um eine Ansammlung von Partikeln zu vermeiden. Bereiten Sie als Nächstes eine Kontrollsuspension vor, die gleichmäßige, 200 Nanometer große Polystyrolpartikel enthält. Um die Brennpunkte von Laser und Mikroskop auszurichten, geben Sie einen Tropfen des vom Gerätehersteller bereitgestellten Suspensionskonzentrats auf 500 Milliliter destilliertes Wasser, so dass die gewünschte Konzentration so erreicht ist, dass 600 plus oder minus 100 Partikel pro Bildschirm in der Live-Ansicht angezeigt werden.

Injizieren Sie die Ausrichtungssuspension in das NTA-Instrument, wie es bei der Presse für destilliertes Wasser der Fall ist. Es ist in Ordnung, auch die Ausrichtung zu starten, eine automatisierte Routine, durch die das System automatisch die optimale Position der beiden Brennpunkte findet. Wenn eine Eingabeaufforderung erscheint, dass das System nun für Experimente bereit ist, klicken Sie auf OK, um die Messung zu starten.

Reinigen Sie den Zellkanal zwischen den Experimenten gelegentlich manuell, indem Sie die Zelle mit einer 30%igen Ethanollösung spülen. Reinigen Sie den Kanal, wenn die Software einen automatischen Fehlerbericht anzeigt. Zur Durchführung einer Messung des Systems.

Spülen Sie zunächst den Kanal vor jeder Probenmessung mit destilliertem Wasser. Injizieren Sie dann die Exosomensuspension in den Kanal. Der nächste Schritt besteht darin, die Hauptparameter in der Software anzupassen, um die Empfindlichkeit anzupassen.

Finden Sie den optimalen Empfindlichkeitsbereich, indem Sie auf Anzahl der Partikel über die Empfindlichkeit klicken, um eine Kurve für die gemessenen Partikel pro Bildschirm für verschiedene Empfindlichkeitsstufen anzuzeigen. Wählen Sie eine Empfindlichkeitsstufe vor der maximalen Steigung der Kurve aus. Eine höhere Empfindlichkeitsstufe ermöglicht die Visualisierung kleinerer Partikel, erhöht aber auch Probleme im Zusammenhang mit Hintergrundgeräuschen.

Um die minimale Helligkeit anzupassen, wählen Sie eine Starthelligkeit von 20 für die Exosomenmessung. Um diese Funktion als Filter zu verwenden, regulieren Sie diesen Parameter bis zum Ausblenden stark streuender Partikel. Regulieren Sie es herunter, um wöchentliche Streuartefakte zu verstärken, sehr hell, wie es während des gesamten Experiments benötigt wird.

Stellen Sie als Nächstes einen digitalen Filter ein, um Pixelrauschen und unerwünschte Streupartikel zu eliminieren. Durch die Regulierung der minimalen und maximalen Größe können Sie einen Bereich von 10 bis 500 Pixeln für die Messung von Exosomen verwenden. Stellen Sie den Verschluss ein, indem Sie den Verschluss auf 300 einstellen, indem Sie den Verschluss auf 3,3 Millisekunden einstellen.

Um die Live-Anzeigeparameter anzupassen, wechseln Sie jederzeit zwischen einem digitalen und einem analogen Ansichtsmodus, indem Sie auf die Livebild-Schaltfläche klicken. Während des gesamten Experiments. Überwachen Sie den Streuintensitätsbalken, der den Sättigungsstatus der Probe als farbcodierten Indikator anzeigt.

Analysieren Sie keine Exosomen, wenn der Streubalken rot ist. Um mit der Messung zu beginnen, klicken Sie auf die Registerkarte "Messung". Wählen Sie die Einstellungen im Array Ausführungsoptionen aus.

Wählen Sie vor jeder Aufnahme die Option "Bewegung prüfen", einen wiederholten Partikeldrifttest, die Anzahl der Experimente und die Zeitverzögerung zwischen ihnen. Führen Sie bei Bedarf eine Stichprobenprüfung durch. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Videoaufnahme ausführen.

Legen Sie im neuen Fenster die Anzahl der Zyklen und die Anzahl der Messpositionen fest. Bestätigen Sie die minimale Zeitdauer. Ein Partikel wird verfolgt, um als ein einzelnes Partikel gezählt zu werden.

Durch das Einstellen der Videoauflösung führt eine niedrigere Auflösung zu einer kürzeren Tracking-Dauer. Wählen Sie abschließend einen Dateinamen aus und klicken Sie auf OK, um die Messung zu starten. Die Kurve "Anzahl der Partikel im Verhältnis zur Empfindlichkeit" zeigt die Partikel zu einem bestimmten Zeitpunkt an einer Position an.

Während eines automatischen Empfindlichkeitsscans wird ein Empfindlichkeitswert vor der maximalen Steigung des Diagramms ausgewählt. Artefakte werden in diesem Testexperiment nicht beseitigt und können sich auf das Diagramm auswirken. Die Visualisierung von Partikeln auf dem Live-View-Bildschirm ist hilfreich, um den richtigen Empfindlichkeitswert einzustellen.

Ein zu niedriger Wert führt dazu, dass nur wenige Partikel detektiert werden. Während ein zu hoher Wert ein schlechtes Bild anzeigt, erscheinen Qualitätspartikel als einzelne Punkte, die in der optimalen Empfindlichkeitsstufe gut voneinander isoliert sind. Die Registerkarte "Ergebnis" nach der Messung ermöglicht das Auslesen von Parametern, einschließlich der Gesamtzahl der verfolgten Partikel, der durchschnittlichen Anzahl von Partikeln pro Position und der Partikelkonzentration sowie des numerischen Verhältnisses der Partikelgröße zum Prozentsatz der Partikelanzahl.

Das nach der Messung berechnete Diagramm zeigt die Verteilung der Partikel nach Größe. Über Symbole im Anzeigemodus können die Einstellungen des Diagramms geändert werden. Außerdem gibt es verschiedene Möglichkeiten, Exosomen zu analysieren.

Diese Methode zeigt eine sehr einfache und elegante Methode, um eine ähnliche Methodenanalyse in einem schnellen Prozess durchzuführen und in kurzer Zeit Ergebnisse zu erzielen. Um mehrere Proben vergleichen zu können, empfehlen wir, für alle Proben den gleichen Verdünnungsgrad beizubehalten. Alle Einstellungen akzeptieren die Empfindlichkeit und die Videoauflösung kann nachträglich mit einer Reihe von wenigen Analysesoftware geändert werden.

Auf diese Weise wird eine vergleichende Analyse von Daten, die in verschiedenen Experimenten zur Menge und Größe von Exosomen gewonnen wurden, auf halbautomatische Weise verfügbar.