A Practical Guide to Phylogenetics für Nichtexperten

Das übergeordnete Ziel dieses Artikels besteht darin, einen zuverlässigen phylogenetischen Baum aus DNA- oder Proteinsequenzen zu rekonstruieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mithilfe von Blast-Programmen am NCBI ähnliche Sequenzen identifiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, ähnliche Sequenzen auszurichten.

Anschließend wird das bestpassende Evolutionsmodell aus der Alignierung bestimmt. Der letzte Schritt besteht darin, die phylogenetischen Beziehungen aus den alignierten Sequenzen abzuleiten. Letztendlich dient die schrittweise Pipeline dazu, zu veranschaulichen, wie Nutzer von Sequenzdaten zu verlässlichen Phylogenien gelangen können.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in verschiedenen Bereichen zu beantworten, indem sie Identität und Funktion neuartiger Sequenzen erschließt. Um die Online-Version des Basic Local Alignment Search Tool oder BLAST zu nutzen, navigieren Sie zum National Center for Biotechnology Information oder NCBI BLAST-Webserver. Klicken Sie auf das entsprechende BLAST-Programm.

Geben Sie eine im FASTA-Format vorliegende Textsequenz, wie die hier gezeigte, in das Abfragefeld ein. Klicken Sie das geeignete BLAST-Programm für die Suche an und danach BLAST. Die Ausgabe erfolgt standardmäßig im HTML-Format und zeigt die Sequenzen an, die der Eingabesequenz am ähnlichsten sind.

Im nächsten Abschnitt wird die Verwendung eines lokalen Blast-Programms unter Windows und Mac behandelt. Benutzer können zum folgenden Abschnitt mit dem Titel Blast-Local-Programme für Macs x springen. Um das Blast-Befehlszeilenprogramm auf einer Windows-Maschine auszuführen, laden Sie das entsprechende Windows-Programm von der NCBI-Blast-Website herunter.

Nach der Installation des Blast-Programms konfigurieren Sie die Umgebungsvariable des PCs wie folgt: Klicken Sie auf die Startschaltfläche des PCs und dann mit der rechten Maustaste auf „Computer“. Klicken Sie anschließend auf „Eigenschaften“. Wählen Sie im neuen Fenster die erweiterten Systemeinstellungen aus, und klicken Sie im Reiter „Erweitert“ des neuen Pop-up-Fensters auf die Schaltfläche „Umgebungsvariablen“.

Danach im Bereich der Benutzervariablen die Schaltfläche „Neu“ klicken. Im daraufhin erscheinenden Popup-Fenster den Variablennamen „path“ und den hier gezeigten Variablenwert hinzufügen. Als Nächstes eine vorformatierte Blast-Datenbank herunterladen, die täglich von der NCBI-Website aktualisiert wird, oder ein Genom für einen bestimmten Organismus.

Öffnen Sie dann eine MS-DOS-Eingabeaufforderung, indem Sie auf Start klicken und CMD in die Suchleiste eingeben, und wechseln Sie zum NCBI-Blast-Ordner. Erstellen Sie die Datenbank mithilfe des hier gezeigten Befehls „Make blast DB“. Erstellen Sie eine abzufragende Proteinkontrollsequenz namens test, indem Sie eine proteinogene Textsequenz im FASTA-Format in den DB-Ordner einfügen.

Danach die am stärksten ähnlichen Sequenzen zum Testprotein identifizieren, indem die Datenbank über einen blast-P-Abfragebefehl durchsucht wird. Der folgende Abschnitt wiederholt diese Informationen für Mac-Nutzer. Windows-Nutzer können direkt zum Abschnitt fünf springen, in dem multiple Sequenzalignments erstellt werden.

Um das Blast-Befehlszeilenprogramm auf einem Mac auszuführen, laden Sie das entsprechende MAC-Exemplar herunter, indem Sie über Fernzugriff auf die N-C-B-I-F-T-P-Website zugreifen. Öffnen Sie dazu den Finder und suchen Sie im Terminalfenster nach „Terminal“. Geben Sie in das Terminalfenster die FTP-Adresse der N-C-B-I-F-T-P-Website ein. Geben Sie als Namen und Passwort „anonymous“ ein und anschließend „CD blast slash executables slash latest“.

Listen Sie die ausführbaren Dateien auf, indem Sie LS eingeben, und laden Sie die neueste Version herunter, die Ihren Systemanforderungen entspricht, indem Sie Folgendes eingeben. Entpacken Sie nun die heruntergeladenen Dateien. Fügen Sie anschließend den Speicherort der Binärdateien für die Blast-Ausführbare zu Ihrem Pfad hinzu, damit die Shell dieses Verzeichnis durchsuchen kann.

Beim Suchen nach Befehlen laden Sie eine vorformatierte Blast-Datenbank oder ein Genom von der NCBI-Website herunter. Durchsuchen Sie das Genomverzeichnis, indem Sie „CD genomes“ eingeben. Laden Sie anschließend das gewünschte Genom oder die gewünschte Sequenz wie folgt herunter und geben Sie dann „quit“ ein, um die FTP-Seite zu verlassen.

Als Nächstes erstellen Sie die Datenbank, indem Sie den Befehl „Make Blast DB“ eingeben. Fügen Sie eine in FASTA-Format vorliegende Abfragesequenz in den Bin-Ordner ein und durchsuchen Sie die Datenbank mit dem Befehl „blast P query“, um die der Testsequenz am ähnlichsten Sequenz zu finden. Zu den gängigsten Programmen für multiple Sequenzalignments (MSA) gehört Tea Coffee. Nachdem Sie die in FASTA-Format vorliegenden Sequenzdaten in das Abfragefeld auf der Tea-Coffee-Website eingegeben haben, zeigt die Ausgabe ähnliche Reste durch eine Farbkodierung an.

Ein weiteres häufig verwendetes MSA-Programm ist Clusteral MSA, das als Befehlszeilenversion CLUSTERAL W oder als grafische Version CLUSTERAL X für verschiedene Betriebssysteme heruntergeladen werden kann. Als Nächstes laden Sie die Daten in das Clusteral-Programm als schnell formatierten Sequenztext, indem Sie den Dateireiter auswählen. Danach klicken Sie auf die Schaltfläche „Sequenzen laden“.

Wechseln Sie nun zum Register „Align“ und klicken Sie auf die Schaltfläche „Do complete alignment“, um die Sequenzen für ein bestes Anpassungsmodell der Evolution auszurichten. Laden Sie das Protest-Programm herunter. Sobald Protest heruntergeladen ist, doppelklicken Sie auf Protest.

Wenn der Protest gestartet wurde, klicken Sie im Ausrichtungsfeld auf „Datei auswählen“, um die Sequenzdaten zu laden. Klicken Sie anschließend auf „Start“, um das Programm auszuführen. Nach Abschluss des Durchlaufs zeigt das Programm das beste Modell basierend auf den Kriterien zur Ableitung von Sequenzen an.

Nachdem Sie Phi ML heruntergeladen und gestartet haben, laden Sie die Eingabesequenz als Datei im lip-Format, indem Sie den Dateinamen und PY eingeben. Starten Sie dann das Programm, indem Sie y eingeben. Nachdem Sie ein bayessches Inferenzprogramm von der MrBayes-Website heruntergeladen haben, starten Sie das Programm, indem Sie auf die ausführbare Datei klicken. Lesen Sie dann die Sequenzdaten im Nexus-Format in das Programm ein, indem Sie „execute“ gefolgt vom Dateinamen und „.NEX“ eingeben.

Als Nächstes legen Sie das evolutionäre Modell fest und wählen die Anzahl der Durchläufe aus. Nachdem Sie die Analyse mit dem Befehl mc mc durchgeführt haben, fassen Sie die Bäume mit dem Befehl sum T zusammen, um einen phylogenetischen Baum anzuzeigen. Laden Sie das Programm zur Baumdarstellung herunter.

Als abschließender Hinweis sei erwähnt, dass kontinuierlich neue Software-Versionen veröffentlicht werden, die bessere Alignments, Ähnlichkeitsvorhersagen oder phylogenetische Bäume ermöglichen sollen. Obwohl der Überblick in diesem Video gängige Programme abdeckt, wird der Betrachter ermutigt, zusätzliche Optionen zu erkunden. Der Blast-Algorithmus führt lokale Alignments durch, bei denen nach kurzen Abschnitten sequenzieller Ähnlichkeit gesucht wird.

Nachdem der Algorithmus alle möglichen Abschnitte der Abfragesequenz ermittelt und diese Sequenzen maximal verlängert hat, setzt er die Alignments zusammen. Für jedes Paar von Abfragesequenzen gibt der E-Wert einen Hinweis auf die statistische Signifikanz eines Treffers. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter ist der Treffer.

Beispielsweise bedeutet eine Sequenzalignierung mit einem E-Wert von 0,05, dass die Wahrscheinlichkeit, dass diese Übereinstimmung allein zufällig auftritt, fünf von 100 beträgt. Der BIT-Score verwendet eine spezifische Bewertungsmatrix, um einen Hinweis darauf zu geben, wie gut die Alignierung ist. Je höher der BIT-Score, desto besser ist die Alignierung.

Eine multiple Sequenzalignment oder MSA ist ein Sequenzalignment von drei oder mehr primären Sequenzen, die aus Aminosäuren, DNA oder RNA bestehen. Die Ausgabe des hier gezeigten MSA-Tee-Kaffee codiert ähnliche Reste farblich. Hier ist eine Beispielalignment von sechs Proteinsequenzen dargestellt, die mittels Cluster X für Aminosäure-Alignments ausgerichtet wurden.

Das Programm protest dient dazu, die Auswahl der am besten passenden Modelle für Aminosäureaustausche zu bestimmen. Innerhalb der Daten listet das Programm die Modelle auf, während sie analysiert werden, und zeigt nach Abschluss des Programms das am besten passende Modell an. Phi ML schätzt die phylogenetischen Bäume nach dem Maximum-Likelihood-Verfahren anhand von Alignments von Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen. Es berücksichtigt eine große Anzahl von Substitutionsmodellen, die mit verschiedenen Optionen zur Untersuchung des Baumtopologieraums gekoppelt sind.

Mr.Bayes verwendet die bayessche CMC-Inferez über mehrere evolutionäre Modelle hinweg, um phylogenetische Beziehungen zu rekonstruieren. Sobald das Programm läuft, kann der Fortschritt in bestimmten Intervallen wie hier gezeigt verfolgt werden. Nachdem ein phylogenetischer Baum erzeugt wurde, muss die Topologie visualisiert werden.

In dieser Abbildung zeigt das Baumansicht-Fenster eine Beispielstruktur von Proteinen aus fly.Base. Die Baumansicht umfasst einen Baum-Editor, der es dem Benutzer ermöglicht, Äste zu verschieben und Bäume neu zu ordnen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Benutzeranleitungen für jedes Programm sorgfältig zu lesen.

Dieses Protokoll bietet einen praktischen Einstieg, um dem Leser zu vermitteln, wie diese Programme funktionieren. Ich ermutige den Leser jedoch, mit den zahlreichen Einstellungen jedes Programms zu experimentieren und sich mit ihnen vertraut zu machen.