Name: Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von endoplasmatischen Reticulum-Subdomains in kultivierten Zellen mittels konfokaler Live-Zell-Bildgebung und FRAP. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinmobilität und ER-Architektur.

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Die Autoren sind dankbar, Fondazione Filarete für seine Hilfe und Unterstützung bei der Veröffentlichung dieses Artikels. Wir würden auch gerne Centro Europeo di Nanomedicina für die Nutzung der TECNAI G2 Transmissionselektronenmikroskop danken.

1. Plasmid, Zellkultur und Transfektion mit ER Fluoreszierende Proteine <ol><li> Das in dieser Studie verwendete Plasmid besteht aus einer verbesserten Version des GFP am C-Terminus mit dem Heckbereich des ER-Isoform von Ratten-Cytochrom b fusioniert (5) über eine Linkersequenz (als B (5), hier abgekürzt). Der Heckbereich die gesamte Sequenz (Pro94-Asp134), die Membran nach der Trypsin-Spaltung der nativen b (5), einschließlich der 17-Rückstand TMD (Transmembran-Domäne), von vor-und nachgelagerten Polar Sequenzen flankiert (USV und DPS) zugeordnet bleibt, enthält . Der Linker besteht aus dem myc-Epitop, gefolgt von [(Gly) 4 Ser] 3, und die gesamte cDNA wird in die Hind3-Xba1-Stellen des Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3. Die Einzelheiten der Konstruktion dieses Plasmids wurden in einer früheren Veröffentlichung, in der sie als GFP-ER 16 bezeichnet wird beschrieben. </li><li> Wachsen COS-7-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% Feta ergänztl Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin in einem Inkubator bei 37 ° C und 10% CO 2. </li><li> Transfektion. Platte 3 x 10 5 Zellen auf einer runden Deckglas in einer 6-Well-Platte, und am folgenden Tag, Transfektion mit dem jetPEI System, wie vom Hersteller beschrieben. Beachten Sie, dass die optimale jetPEI / DNA-Verhältnis hat, um die maximale Effizienz der Transfektion in Abhängigkeit von der Plasmid-und Zelllinie zu etablieren getestet: in unserem Fall ein jetPEI: DNA-Verhältnis von 2:1 führt zu einer 70-80% Transfektionseffizienz. </li></ol> 2. Live-Fluoreszenzmikroskop-Mikroskopie <ol><li> Live-Cell-Imaging. Das Deckglas gelegt, auf dem die transfizierten Zellen wurden in einer Zellkulturkammer Stahl 24 mm Deckgläsern mit DMEM gefüllt w / o Phenolrot, mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin, 25 mM HEPES ausgesät , 50 ug / ml Cycloheximid und 1:100 OxyFluor, um die Proben von Photobleichung zu verhindern. Ein SP5 konfokalen mikroskopische mit einem temperaturgesteuerten CO 2-Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) ausgestattet ist zum lebenden Zellen Experimente verwendet, mit d-GFP-ER unter Verwendung eines 488-nm-Laser und einen 525/50 Bandpass-Emissionsfilter visualisiert. </li><li> Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Ziehung einer Region von Interesse (ROI), entsprechend einer OSER Struktur und entfärben mit 20 Iterationen und eine Kombination von 488 nm (100% eines 30 mW Argonlaser, entsprechend 5,5-6 &amp;mgr; W in der Probe) und 405 nm (60% der 30 mW Laserdiode 405, das entspricht 11,6 uW bei der Probe)-Laser, die in unserer Erfahrung, führt zu einer effizienten und schnellen Photobleaching. </li><li> Notieren Sie sich die Erholung der Fluoreszenz in den gebleichten ROIs, indem sie einen einzelnen Frame alle 10 s für 10 min (Pixelzeit = 1,61 Mikrosekunden / Pixel). </li><li> Fluoreszenzverlust in Photobleaching (FLIP). Ziehung einer ROI entsprechend einem OSER Struktur und Bleichmittel, wie oben beschrieben. Das Bleichen wird alle 30 Sekunden wiederholt,und Post-Bleich Bilder werden alle 10 Sekunden für 30 min (Pixelzeit = 1,61 Mikrosekunden / Pixel) aufgezeichnet. </li><li> FRAP und FLIP-Analyse. Alle Bilder sind mit ImageJ Software (analysiert <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). In den FRAP Experimenten wird die Wiederherstellung der Fluoreszenz des gebleichten ROI über die Zeit und normiert auf die Gesamtfluoreszenz der gebleichten Zell, das immer aktiviert ist über die Zeit konstant ist, gemessen. </li><li> Für die FLIP-Experimenten ziehen eine ROI außerhalb des gebleichten OSER und für die gesamte Zelle. Messung ihrer Fluoreszenzintensität über die Zeit zu normalisieren und die Fluoreszenzniveaus eines ROI auf einem ungebleichten Zell um für jede Abnahme der Fluoreszenz von der Abbildungs ​​selbst zu korrigieren gezogen. </li><li> In allen Experimenten, subtrahiert das Hintergrundsignal (in einem Bereich außerhalb der Zellen bestimmt) von den Fluoreszenzintensitäten der ROIs. Schließlich zeichnen die Ergebnisse mit GraphPad Prism Software. </li></ol> 3. Ultrastrukturelle Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie Angesichts der Toxizität vieler der Reagenzien sollten alle den Verfahren trägt einen geeigneten Labor durchgeführt werden. Mantel und Handschuhe unter einer Abzugshaube. <ol><li> Nach dem Entfernen des Deckglases aus der Petrischale, fixieren die restlichen Zellen am Boden der Schale als eine Monoschicht mit gefilterter 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,4, für 10 Minuten bei Raumtemperatur gezüchtet. </li><li> Kratzen Sie die Zellen mit einer Teflon Schaber und übertragen sie in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 9000 g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie frisches Fixiermittel, und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C </li><li> Waschen der Pellets mit Puffer, dann post-fix mit einer Lösung von 1% Osmiumtetroxid in Cacodylat-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie mit MilliQ Wasser und en bloc Fleck mit1% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 20-60 min. </li><li> Entwässern der Proben in steigenden Ethanolreihe (70%, 80%, 90%, 100% und 100% für jeweils 10 Minuten) und kurz waschen zweimal in Propylenoxid (jeweils 15 min). </li><li> Infiltrieren der Proben in einem Gemisch aus Propylenoxid + Epon (1:1) (2 h bis über Nacht). </li><li> In Epon Epoxidharz bei 60 ° C für mindestens 24 Stunden gehärtet einzubetten. </li><li> § die manuell getrimmt Harzblöcke mit Hilfe eines Ultramikrotoms LEICA UC6 mit einem 45 °-Diamantmesser ausgestattet, um Abschnitte mit einer Dicke von 60-70 nm zu erhalten. Sammeln Sie die Abschnitte über 300 mesh Kupfernetze. </li><li> Färben Sie die Abschnitte in der Startaufstellung mit einer gesättigten Lösung von Uranylacetat (20 min) und Blei-Citrat (7 min) gründlich waschen, in die Netze von bi-destilliertem gefiltertes Wasser eingetaucht werden, und es ihnen ermöglichen, bei Raumtemperatur trocknen. </li><li> Die gefärbten Gitter G2 TECNAI mit einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet, und die Bilder werden unter Verwendung eines erfassten Bottom-CCD-Kamera montiert in verschiedenen Vergrößerungen letzten (in der Regel zwischen 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
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<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die in diesem Dokument beschriebenen Protokolle und bildgebenden Verfahren sind verwendet worden, um die Verteilung und Mobilität von transfizierten TA fluoreszierende Proteine ​​im ER lebender Zellen resident untersuchen. Wir haben auch untersucht die Wirkung der Überexpression dieser Proteine ​​auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment durch ultrastrukturelle Analyse. Die Kombination aus Live-Zell-konfokale Bildgebung und Elektronenmikroskopie stellt ein sehr leistungsfähiges M...

Die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und dessen Varianten Spektralbereich und die parallele Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie wurden völlig neue Möglichkeiten für die Untersuchung von Protein-Verhalten in den Zellen geöffnet. Techniken wie Fluoreszenz-Erholung nach Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenzverlust Photobleaching (FLIP), die aufgrund der Eigenkapazität der Fluorophore ihrer Fluoreszenz unter intensiver Beleuchtung erlischt möglich sind, werden auf der konfokalen Abbildung lebender Zellen basiert und die Verwendung von transfizierten Fluoreszenz-Fusionsproteine ​​1-3. Sie sind weit verbreitet, nicht nur die Lokalisierung von Proteinen, sondern auch ihre Mobilität und vesikulären Transport, die wichtige Hinweise über ihre Funktion 4 offenbaren kann beurteilen. Das einzigartige Merkmal von eukaryontischen Zellen ist die Anwesenheit von intrazellulären Kompartimenten, die spezifische Lipid-und Proteinzusammensetzungen. Obwohl Organellen sind körperlich Isolated, müssen sie miteinander kommunizieren und molekularen Komponenten, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Die sekretorischen Weg garantiert, dass die Proteine ​​und Lipide im ER synthetisiert erreichen den richtigen Bestimmungsort in dem sie ihre Funktion ausüben. Intrazellulären Organellen kann auch durch dynamische Kontaktstellen, die Moleküle (Lipide), direkt zwischen den Abteilungen ausgetauscht werden können angeschlossen werden. Darüber hinaus haben viele Proteine ​​in großen heteromeren Komplexen zusammengesetzt oder mit bestimmten Lipidspezies (Lipid Rafts / Mikrodomänen), um sich funktionell aktiv oder an ihren Bestimmungsort transportiert werden verbunden. Alle diese biologischen Aspekte stark beeinflussen die kinetischen Eigenschaften der Proteine, und kann daher in geeigneter Weise mittels der unten beschriebenen Methoden untersucht werden. Unsere Gruppe hat sehr stark genutzt FRAP und FLIP mit Elektronenmikroskopie kombiniert, um die Architektur des ER und ihrer verschiedenen studierenDomänen. Das ER ist die erste Station des sekretorischen Weg und spielt eine Schlüsselrolle in der Protein-und Lipidsortierung 5. Es ist eine sehr dynamische Organellen, deren unterschiedliche Teilbereiche spiegeln die viele verschiedene Funktionen (zB Protein-und Lipid Biosynthese und Menschenhandel, Proteinfaltung, Ca 2 +-Speicher-und Freigabe und Fremdstoffmetabolismus). Obwohl sie morphologisch räumlich und funktionell verschieden sind diese Bereiche kontinuierlich zueinander und ihre relative Häufigkeit in Zellen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen modifiziert werden. Die bekannteste und meist räumlich getrennter Domänen des ER sind die Kernhülle und die glatten und rauen ER, allerdings haben wir und andere gezeigt, dass es ER Strukturen mit aufwendiger Architektur und dreidimensionale Organisation in verschiedenen Zelltypen und Geweben unter physiologischen Bedingungen, die auch durch Stressreize wie Hypoxie, Drogen induziert werden kannVerwaltung, oder die Überexpression von ER-residenten Transmembranproteine ​​2,6 (und darin). Wir haben vor kurzem auch die Anwesenheit solcher Strukturen in Zellmodellen menschlicher Krankheiten 1,7 nachgewiesen. Hervorgegangen aus dem gestapelten Zisternen des glatten ER, sie den gemeinsamen Namen der organisierten glatten endoplasmatischen Retikulum (OSER) im Jahr 2003 6 angegeben wurden, obwohl sie auch als karmellae, Lamellen und kristalloiden ER auf der Grundlage ihrer Architektur bekannt, die, wie ihre Größe kann variieren. Nachdem die Zellen mit GFP zu cytosolischen Schwanz-Bereich verankert (TA) ER fremde Proteine ​​(d EGFP-ER), die schwach Dimerisierung Tendenz von GFP in trans dramatisch verändert die Organisation und Struktur der ER fusioniert transfiziert. FRAP und FLIP-Experimente zeigten, dass d EGFP-ER ist kostenlos innerhalb Osers diffundieren, und die Tatsache, dass es von der retikulären ER bewegt sich nach OSER und umgekehrt &lt;/ Em&gt; zeigt an, dass die Aggregate sind kontinuierlich mit der umgebenden retikulären ER. Ultrastrukturelle Analyse hat uns erlaubt, die Fluoreszenzdaten mit einer detaillierten Beschreibung der OSER Architektur und Organisation auf Nanoebene korrelieren: Osers werden immer von Stapeln von gepaarten Zisternen des glatten ER gemacht, sondern kann verschiedene Formen der räumlichen Organisation, wie regelmäßig angeordneten Sinus haben Arrays oder Quirlen oder sechseckigen &quot;kristalloiden&quot; Rohr Arrays. Diese Umlagerungen führen zu kubischen Morphologien 8, die, wie sie in Zellen unter physiologischen Bedingungen 9 und folgenden Belastungen wie Hypoxie 10. Arzneimittelbehandlung 11, 9 und Krebs gefunden worden, erhebliche Potential als ultra Marker aufweisen kann. Nach dieser ersten Demonstration mit GFP-Fusionsproteine ​​verwendeten wir Abbildungsexperimente, die Proliferation von ER-Domänen analysiert als Reaktion auf pharmakologische Behandlungen 12, assess der Neigung von fluoreszierenden Proteinen in Zellen 13 oligomerisieren, und die Rolle eines mutierten ALS-verknüpften TA Protein an der Bildung von intrazellulären Aggregaten von ER Herkunft, die relevant für seine Pathogenität 1,8 sein kann, zu untersuchen. Es wurde vorgeschlagen, daß die Bildung von intrazellulären Aggregaten (die in vielen neurodegenerativen Krankheiten 14 auftritt) kann eine Schutzmechanismus, der die Wechselwirkungen zwischen toxischen mutierten Proteinen und den umgebenden Zellkomponenten 15 zu verhindern. Was folgt, ist eine Beschreibung einer Kombination optischer und Elektronenmikroskopie Verfahren zur Untersuchung Konstrukte, deren C-terminale hydrophobe Domäne in der Membran des ER eingeführt, und eine Analyse ihrer dynamischen Verhalten und die Wirkungen der Überexpression von ER-Domäne Architektur in kultivierten Zellen (siehe Abbildung 1 ein Ablaufdiagramm des experimentellen Protokolls).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfektion</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluoroxyrase</td><td> Inc.</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd Grade I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylat-Trihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid 4%ige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Science 19150</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat-Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td>leicht radioaktives</td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON Einbettmedium-Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>Bleicitrat </td><td>Elektronenmikroskopie Science</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Spektralmikroskop </td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Mikroskop-Käfig-Inkubationssystem </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Diamantmesser </td><td>Diatomee</td><td>Ultra 45 &deg;</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stahlkulturzellkammer für 24 mm Deckglas</td><td>Bioscience Tools</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmikroskopiegitter</td><td>Elektronenmikroskopie Science</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung des endoplasmatischen reticulum subdomains in kultivierten zellen

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Die Lipide und Proteine ​​in eukaryotischen Zellen kontinuierlich zwischen Zellkompartimenten ausgetauscht, obwohl diese trotz der intensiven interorganelle Molekularverkehr behalten ihre unverwechselbare Zusammensetzung und Funktionen. Die in diesem Beitrag beschriebenen Techniken sind mächtige Mittel des Studiums Protein-und Lipid Mobilität und Menschenhandel in vivo und in ihrer physiologischen Umgebung. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenzverlust in Photobleaching (FLIP) werden häufig für die Untersuchung intrazellulären Transport durch die exo-endocytischen, die Kontinuität zwischen den Organellen oder Unterkammern, die Bildung von Proteinkomplexen und Protein-Lokalisierung verwendet Live-Cell-Imaging-Techniken Lipidmikrodomänen, die alle unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu beachten. Die Grenzen dieser Ansätze sind hauptsächlich auf die Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteine ​​und ihre möglichen Nachteile umfassen artifactual überexprimierenIonen in Zellen und die Möglichkeit, Unterschiede in der Faltung und Lokalisierung von markierten und nativen Proteinen. Schließlich, als die Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie (etwa 200 nm) keine Untersuchung der Feinstruktur des ER oder den spezifischen Unterkammern, die in Zellen unter Stress entstehen kann damit (dh Hypoxie, Medikamentengabe, die Überexpression von Transmembran basierend auf Transmissions-Elektronenmikroskopie ER ansässig Proteine) oder unter pathologischen Bedingungen, kombinieren wir Live-Cell-Imaging von kultivierten transfizierten Zellen mit ultrastrukturelle Analysen.

Figur 2 zeigt ein Beispiel FRAP Untersuchung von Protein-Mobilität. Die Mobilität von d EGFP-ER-Protein wird durch die schnelle Erholung nach Fluoreszenzphotobleaching in gebleicht Osers demonstriert. Für die quantitative Analyse wurden die Halbzeit-und Mobil Fraktion aus experimentell gemessenen Daten durch Einsetzen der folgenden monoexponentiellen Gleichung abgeleitet: F (t) = F post + (F-F rec post) (1-e-t / τ) <p cl...

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zu untersuchen, wie transfizierte fluoreszierende Proteine in dem endoplasmatischen Retikulum verteilt sind und sich bewegen, sowie den Einfluss der Expression auf die ultraschwelligen strukturellen Architekturen zu bewerten. Dazu werden Kulturzellen vorübergehend mit GFP-markierten tail-ankergebundenen ER-residenten Proteinen transfiziert. Im Anschluss an die Transfektion wird eine konfokale Live-Cell-Abbildung durchgeführt, um die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching oder FRAP sowie den Fluoreszenzverlust zu bewerten.Bei der Photobleiche oder FLIP wird die ultrasruckturelle Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt. Die erhaltenen Daten zeigen, dass die Expression des mit GFP markierten B-five-Konstrukts die Organisation und Struktur des endoplasmatischen Retikulums erheblich verändert und die Bildung von Aggregaten induziert. Die hier dargestellte Methode kann Einblicke in grundlegende zellbiologische Prozesse liefern, wie beispielsweise die Mobilität und den Transport von Proteinen und Lipiden.Es kann auch zur Untersuchung von Reaktionen auf pharmakologische Behandlungen verwendet werden, um fluoreszierende Proteine, Oligo-Modernisierung zu evaluieren oder die Rolle pathogener mutierter Proteine bei der Bildung intrazellulärer Aggregate des Ursprungs zu untersuchen, die für ihre Pathogenität relevant sein könnten, wie beispielsweise bei amyotropher Lateralsklerose. Das in dieser Studie verwendete Plasmid besteht aus einer verbesserten Version von GFP, die über eine Linkersequenz an ihrem C-Terminus an den Schwanzbereich des er-Isoforms von Ratten-Cytochrom B fünf fusioniert ist. Der Schwanzbereich von B fünf enthält die gesamte Sequenz, die nach Spaltung durch Trypsin membranassoziiert bleibt.Dies beinhaltet die 17 Aminosäuren umfassende transmembrane Domäne, die von upstream und downstream gelegenen polaren Sequenzen flankiert wird. Der Linker besteht aus dem M-Epitop, gefolgt von GLY vier S3. Die gesamte cDNA wird in die Hindi-drei-XO-eins-Stellen des säugerzellenexprimierenden Vektors PC-DNA-drei eingefügt. Zum Vorbereiten der Transfektion werden COS-7-Zellen am Tag vor der Transfektion in supplementiertem DMEM bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 kultiviert; am nächsten Tag werden dreimal 10 hoch 5 Zellen auf runden 24-Millimeter-Glas-Deckgläsern in einer 6-Loch-Platte ausgesät.Transfizieren Sie die Zellen mit dem jet PEI-System gemäß Herstellerangaben, wobei ein Verhältnis von jet PEI zu DNA von zwei zu eins verwendet wird. Dies führt typischerweise zu einer Transfektionseffizienz von 70 bis 80 %. Inkubieren Sie die Zellen vor der Bildgebung 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Überführen Sie anschließend mit einer Pinzette einen Deckglaser mit transfizierten Zellen in die Bildgebungskammer.Stellen Sie die Zellkulturschale zurück in den Inkubator, um die verbleibenden Zellen zu lagern. Für die ultrasruckturelle Analyse mittels Elektronenmikroskopie. Für die Live-Cell-Bildgebung geben Sie zwei Milliliter Bildgebungsmedium in eine stählerne Zellkulturkammer. Xi Fluor wird dem Bildgebungsmedium hinzugefügt, um zu verhindern, dass die Proben durch Lichteinwirkung verblassen. O-Experimente müssen in Gegenwart von Smid, einem Translationsinhibitor, durchgeführt werden, um jegliche Zunahme des A-Fluoreszenzsignals und folglich der Gesamtfluoreszenz aufgrund der Proteinsynthese zu vermeiden. Stellen Sie die Bildgebungskammer auf den Objekttisch eines konfokalen Mikroskops, das mit einem temperaturgeregelten CO2-Inkubator sowie geeigneten Lasern und entsprechenden Photomultipliereinstellungen ausgestattet ist, um die Fluoreszenzwiederherstellung durchzuführen.Nach der Photobleiche oder Frack bringen Sie die Zellen in den Fokus und stellen Sie die Aufnahmeparameter so ein, dass eine Sättigung der Pixel vermieden wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Laserleistung so niedrig wie möglich eingestellt ist, um eine Photobleiche durch die Bildaufnahme zu vermeiden. Sobald die Bildaufnahmeparameter festgelegt sind, wechseln Sie zu einem neuen Bildausschnitt mit zwei oder mehr Zellen.Eine Zelle in jedem Erfassungsfeld sollte ungebleicht bleiben, damit sie zur Normalisierung des fluoreszierenden Signals der gebleichten Zelle oder Zellen verwendet werden kann. Zum Bleichen: Zeichnen Sie einen interessierenden Bereich oder ROI, der einem organisierten glatten endoplasmatischen Retikulum oder OSER entspricht.Stellen Sie das Bildgebungsprogramm so ein, dass unter Verwendung einer geeigneten Anzahl von Iterationen eine effiziente und schnelle photobleachende Wirkung erzielt wird. Bei Bedarf kann eine Kombination aus 488 Nanometer und 405 Nanometer Laser verwendet werden. Weisen Sie die Software an, während des gesamten Experiments alle 10 Sekunden einen einzelnen Bildrahmen über einen Zeitraum von 10 Minuten aufzuzeichnen. Dies umfasst die Vorbleich-, Bleich- und Erholungsphasen.Wenn alles eingestellt ist, starten Sie die Bleiche und Aufnahme. Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, wechseln Sie zu einem neuen Bildausschnitt und wiederholen Sie diesen Vorgang. Nehmen Sie vier bis fünf Bildausschnitte für jede Deckglasprobe auf.Bewegen Sie sich neben die Stelle, um den fluoreszenten Verlust bei der Photobleiche oder dem Flip zu messen. Weisen Sie das Programm an, eine Abfolge von Bleich- und Nach-Bleich-Aufnahmen alle 30 Sekunden für jeweils 10 Sekunden über einen Zeitraum von 10 Minuten durchzuführen, und wechseln Sie dann zu einem neuen Bildausschnitt. Zeichnen Sie eine ROI, die einer OSER-Struktur entspricht, und starten Sie wie zuvor die Bleiche und Aufnahme zur Analyse.Importieren Sie die FRAP- und FLIP-Bilder in die Image-J-Software. Bewerten Sie zuerst die Fluoreszenzrestitution des gebleichten ROI über die Zeit für die FRAP-Experimente und bestimmen Sie anschließend die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie einen Bereich außerhalb der Zellen auswählen und dessen mittlere Intensität über die Zeit messen. Subtrahieren Sie danach das Hintergrundsignal von den Fluoreszenzintensitäten der ROIs.Normalisieren Sie die Daten auf die Gesamtfluoreszenz der gebleichten Zelle, die über die Zeit konstant sein sollte. Anschließend wird die hier gezeigte monoexponentielle Gleichung angepasst, wobei F_post das Fluoreszenzsignal nach der Photobleiche, F_rec der maximale nach der Bleiche erreichte Fluoreszenzrückgewinnungswert, T die Endzeit der Aufzeichnung und tau die Halbzeit der Aufzeichnung ist.Zeichnen Sie für die Analyse der Flip-Experimente eine ROI außerhalb des gebleichten OSER, die die gesamte Zelle abdeckt, und messen Sie die Fluoreszenzintensität über die Zeit. Subtrahieren Sie bei Frack-Experimenten den Hintergrund mithilfe eines Bereichs außerhalb der Zellen. Normalisieren Sie die Daten anhand der Fluoreszenzniveaus einer ROI, die auf einer ungebleichten Zelle platziert wurde, um eine durch die Bildaufnahme selbst verursachte Abnahme der Fluoreszenz zu korrigieren.Abschließend sollten die Ergebnisse mit GraphPad Prism oder einer ähnlichen Software dargestellt werden. Viele der Reagenzien, die bei der Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie verwendet werden, sind toxisch. Daher sollten die folgenden Schritte unter einer Abzugshaube sowie mit Laborkittel und Handschuhen durchgeführt werden.Nachdem die Deckglas von der Petrischale für die optische Mikroskopie entfernt wurde, die verbleibenden Zellen, die als Monolayer auf dem Boden der Schale gewachsen sind, 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Anschließend die Zellen mit einem Teflon-Spatel ablösen und in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die Zellen durch Zentrifugation bei 9.000 × g für 10 Minuten pelletieren. Den Überstand entfernen, frisches Fixansatzmittel hinzufügen und über Nacht bei vier Grad Celsius stehen lassen; am nächsten Tag fortfahren.Waschen Sie die Pellets, indem Sie vorsichtig das Fixans mit einer Pasteurpipette abpipettieren und Cate-Puffer hinzufügen. Um die Pellets nicht zu stören, lassen Sie den Puffer beim Hinzufügen an der Seitenwand des Röhrchens herunterlaufen. Pipettieren Sie die Waschlösung ab und führen Sie die Nachfixierung durch, indem Sie die Zellen in einer Lösung mit 1 % Osmiumtetroxid in Cate-Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur geben.Als Nächstes mit Milli-Q-Wasser spülen und 1 % Urinylacetat in destilliertem Wasser direkt in das Mikrozentrifugenröhrchen geben. Die Färbung 20 Minuten bis eine Stunde lang entsperren, die Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe von 70 %, 80 %, 90 %, 100 % und erneut 100 % jeweils 10 Minuten lang entwässern. Anschließend die Pellets jeweils 15 Minuten lang zwei Mal in Propylenoxid waschen.Infiltrieren Sie die Proben, indem Sie das Propylenoxid durch eine 1:1-Mischung aus Propylenoxid und Epon ersetzen, und inkubieren Sie mindestens zwei Stunden, bis hin zu über Nacht. Anschließend bringen Sie die Zellpellet-Fragmente zur Einbettung in Einbettformen, die vorab mit Epon-Epoxidharz gefüllt wurden, und härten sie bei 60 Grad Celsius mindestens 24 Stunden lang aus. Am nächsten Tag montieren Sie den Harzblock an einem Ultramikrotom, das mit einem Diamantschneidmesser mit 45 Grad Winkel ausgestattet ist.Trimmen Sie die Harzblöcke mit einem Tranchiermesser manuell, um die Bereiche des Harzblocks zu entfernen, in denen die eingebettete Probe nicht vorhanden ist. Anschließend schneiden Sie mit dem Ultramikrotom Schnitte von 60 bis 70 Nanometer Dicke. Sammeln Sie die Schnitte auf Kupfergittern mit 300 Maschen, um die Schnitte zu färben.Platzieren Sie die Objektträger auf 30 Mikroliter großen Tropfen einer gesättigten Uranylacetatlösung und inkubieren Sie 20 Minuten lang. Anschließend spülen Sie dreimal mit Milli-Q-Wasser ab und inkubieren die Objektträger erneut sieben Minuten lang auf kleinen Tropfen Zitratlösung mit Blei. Nach der Inkubation waschen Sie die Objektträger gründlich, indem Sie sie in Milli-Q-Wasser eintauchen, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur trocknen.Beobachten Sie die gefärbten Gitter mit einem Durchstrahlungselektronenmikroskop und fertigen Sie Aufnahmen mit einer unten montierten CCD-Kamera bei einer Endvergrößerung von 6.000- bis 39.000-facher Vergrößerung an, um die laterale Diffusion von D-E-G-F-P ER im organisierten, glatten endoplasmatischen Retikulum zu untersuchen. Transient transfizierte Zellen (sieben Zellen von drei Deckgläsern) wurden mittels FRAP wie in diesem Video beschrieben analysiert; wie in dieser Zeitrafferaufnahme gezeigt, wurden zwei OSER-Strukturen gebleicht und die Fluoreszenz-Wiederherstellung über die Zeit aufgezeichnet. Eine deutliche Fluoreszenz-Wiederherstellung wurde eine Minute nach der Bleiche beobachtet, gefolgt von einer weiteren Signalzunahme vier Minuten später, um die Halbwertszeit der Wiederherstellung zu bestimmen und den mobilen Anteil von D-E-G-F-P-E-R zu quantifizieren.Die aufgenommenen Bilder wurden wie in diesem Video beschrieben analysiert, wie hier zu sehen ist. Die Fluoreszenzintensität des ausgeblichenen Bereichs nahm im Laufe der Zeit zu, was zeigt, dass das fluoreszierende Protein innerhalb der Aggregate hochgradig mobil ist. Um die Kontinuität zwischen verschiedenen Teilbereichen des endoplasmatischen Retikulums zu untersuchen, wurden Flip-Experimente durchgeführt, wie in dieser Zeitrafferaufnahme gezeigt.Die kontinuierliche Bleiche eines OSER, hier durch den gelben Pfeil markiert, führt zu einem progressiven Abfall der Fluoreszenz im übrigen ER sowie in anderen OSER-Strukturen innerhalb derselben Zelle. Der rote Pfeil zeigt einen Bereich einer ungebleichten Zelle, in dem das fluoreszierende Signal über die Zeit konstant bleibt. Die quantitative Analyse dieser Daten zeigte eine fortschreitende und schnelle Entleerung des retikulären ER, was belegt, dass die Aggregate physisch mit dem restlichen ER verbunden sind. Um die feine Architektur dieser Aggregate zu untersuchen, wurden Zellen mit hohen Expressionen von D-E-G-F-P ER mittels Transmissionselektronenmikroskop beobachtet.Dieses Mikrofoto zeigt eine Aufnahme mit niedriger Vergrößerung des Zellzytoplasmas, das ein Membranaggregat enthält. Das Aggregat besteht aus dem Stapel cyi und wellenförmigen sinusförmigen Membranen. Wie hier zu sehen ist.Man kann sehen, dass Mitochondrien um die OSER-Strukturen herum angeordnet sind, während Ribosomen, die durch die Pfeilspitzen markiert sind, lediglich die Membranen der äußersten Zisternen bedecken. Beachten Sie, dass der 11 Nanometer breite, elektronendichte Raum zwischen den Membranen kontinuierlich mit dem Zytoplasma verbunden ist. Ein OSER kann durch lamelläres ER gebildet werden, das aus Stapeln abgeflachter ER-Zisternen besteht, die im Querschnitt kontinuierlich oder fragmentiert erscheinen können; gelegentlich lassen sich Vesikel beobachten, die von der äußersten Zisterne des Stapels abstülpen, wie hier dargestellt.Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die in kultivierten Zellen, die mit D-E-G-F-P ER transfiziert wurden, beobachteten fluoreszierenden Aggregate Bereiche aus glatten und abgeflachten er-Steri darstellen, die sich räumlich in gut definierte 3D-Geometrien organisieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets darauf zu achten, alle Bilder ohne gesättigte Pixel aufzunehmen, da diese die fluoreszenztechnische Wiederherstellung und folglich die Analyse der Proteinmobilität verfälschen könnten. Normalisieren Sie stets das fluoreszierende Signal in der gebleichten Region von Interesse anhand der Gesamtfluoreszenz derselben Zelle, um Intensitätsschwankungen der Fluoreszenz aufgrund der Bleiche während der Bildaufnahme oder geringfügige Veränderungen der Fokusebene zu berücksichtigen.

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen,...

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

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Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

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