Identifizierung einer Subpopulation Murine Erythroblast Enriched in Enucleating Veranstaltungen durch multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Identifizierung von Enukleationsereignissen mit einer aurn-Erythroblast-Subpopulation zu erleichtern. Der erste Schritt besteht darin, eine Population zu erstellen, die mit nukleierenden Ereignissen angereichert ist. Dies wird durch eine in vitro Erythropoese-Kultur erreicht, entweder langfristig ausgehend von Knochenmarkzellen niedriger Dichte, die aus den Femuren, der Tibia und den Beckenknochen einer nicht gestressten Maus isoliert wurden, oder durch eine Kurzzeitkultur.

Beginnend mit Peltozyten aus der Milz einer Maus, die zuvor einer Phlebotomie unterzogen wurde, um die Stresserythropoese zu erhöhen. Die kultivierten Zellen werden im letzten Schritt der Kultur fixiert, durchdrungen und mit den interessierenden Fluoreszenzmarkern gefärbt. Diese Zellen werden auf einem bildgebenden Durchflusszytometer laufen lassen und dann analysiert, um die Zellen zu identifizieren, die sich in der Population der nukleierenden Zellen einer Enukleation unterziehen, Signal- und Zytoskelettkomponenten, die den Prozess der Enukleation regulieren und vermitteln, können identifiziert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass die deutlich größere Anzahl von nukleierenden Zellen in kurzer Zeit beobachtet und analysiert werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Erythropoese zu beantworten, z. B. welche molekularen Mechanismen an der Erythroblasten-Keimbildung beteiligt sind. Um erythroide Zellen von Knochenmarkzellen niedriger Dichte zu unterscheiden, geben Sie zunächst einen Milliliter Nährmedium in ein steriles Durchflusszytometrieröhrchen.

Befestigen Sie dann eine 25 Gauge x fünf Achtel Zoll große Nadel an einer Tuberkulinspritze und spülen Sie frisches Nährmedium einige Male vorsichtig durch die entnommenen Femure und Tibia in das Durchflusszytometrieröhrchen. Nachdem Sie das Zellsuspensionsvolumen mit IMDM auf fünf Milliliter eingestellt haben, tragen Sie es vorsichtig auf fünf Milliliter Zelltrennmedium mit einem Dichtegradienten von 1,083 Gramm pro Milliliter in einem 15-Milliliter-Röhrchen auf. Übertragen Sie alles bis zur Zwei-Milliliter-Markierung in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie das gesammelte Buffy-Fell mit frischen Nährmedienläusen, die roten Blutkörperchen in drei Millilitern Erythrozyten-Lysepuffer für fünf Minuten bei Raumtemperatur, nachdem Sie die Zellen in Kulturmedien gewaschen und das Pellet in derselben Platte aufgehängt haben. die Zellen in einer Sechs-Well-Zellkulturplatte bei einer Konzentration von fünfmal 10 der fünften Zellen pro Well auf ein Endvolumen von 2,5 Millilitern in Wachstumsmedien und inkubieren die Zellen fünf Tage nach dem Plattieren der Kultur bei 37 Grad Celsius.

Zählen Sie die Anzahl der Erythroblasten in jeder Vertiefung der Originalkulturplatte und geben Sie dann jede Vertiefung in die entsprechenden einzelnen konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Schleudern der Zellen aspirieren Sie die Überstände und resuspendieren die Pellets in frischen Wachstumsmedien, die nur Erythropoietin enthalten, bis zu einer Konzentration von zweimal 10 der fünften Zellen pro Milliliter. Aspirieren Sie dann den Überstand aus einer Platte mit fünf MS-Zellen und geben Sie die erythroiden Zellen in die Vertiefungen.

Zwei Tage später ersetzen Sie den Überstand durch frische Wachstumsmedien ohne Zytokine toul Erythroblasten aus PLE-Zyten niedriger Dichte. Verwenden Sie den Kolben einer Fünf-Milliliter-Spritze, um die Milz durch ein 40-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu mazerieren. Waschen Sie das Zellsieb mit Wachstumsmedium und stellen Sie das endgültige Volumen der Zellsuspension auf fünf Milliliter ein.

Nach der Trennung der Zellschichten durch einen Dichtegradienten, wie gerade gezeigt, läusen Sie die roten Blutkörperchen und waschen Sie die Zyten in sieben Millilitern Nährmedien. Dann suspendiert Resus das Pellet in Wachstumsmedien, die mit Zytokinen ergänzt sind, und inkubiert die Zellen ein- bis fünfmal 10 bis zu den sechs Zellen in einem Endvolumen von einem Milliliter pro Well einer 24-Well-Zellkulturplatte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag.

Übertragen Sie die Zellen in Vertiefungen mit adhärenten MS-Fünf-Zellen, wie zuvor beschrieben, und analysieren Sie sie nach sechs bis acht Stunden, sammeln Sie die Erythroblasten aus den Kulturvertiefungen und fixieren Sie sie in 500 Mikrolitern 3,7% Formaldehyd in PBS Resus, wobei Sie das Pellet durch sanftes Pipettieren suspendieren. Nach 15 Minuten drehen Sie die Zellen bei 2000 GS für 20 Sekunden in einer Mikrozentrifuge, saugen den Überstand an und suspendieren das Pellet wieder in 500 Mikrolitern PBS. Nachdem Sie die Zellen in der Mikrozentrifuge wieder heruntergeschleudert haben, aspirieren Sie den Überstand erneut und legen die Zellen für mindestens 15 Minuten auf Eis.

Bei minus 20 Grad Celsius gelagerte Acetonlösungen auf Eis legen. Dann resuspendieren und schleudern Sie die Zellen in einer Reihe von Acetonwaschungen, wie nach dem Faxpufferwaschen angegeben, und inkubieren Sie die Zellpellets in 100 Mikrolitern des entsprechenden Antikörpercocktails für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem die Zellen erneut in Faxpuffer gewaschen wurden, suspendieren Sie die anhaltenden Pellets erneut in 60 Mikrolitern Faxpuffer, der Drac fünf enthält, und führen Sie die Proben auf einem bildgebenden Durchflusszytometer aus, wobei mindestens 10.000 Ereignisse pro experimenteller Probe erfasst werden.

Beginnen Sie dann die Analyse, indem Sie Zellen basierend auf ihrem Hellfeld-Seitenverhältnis, dem Verhältnis der Länge ihrer Neben- zu ihrer Hauptachse und ihrer Hellfeldfläche, die auf ihre Größe hinweist, auswählen. Ereignisse mit einem Hellfeldflächenwert kleiner als 20 und höher als 200 sind meist Trümmer bzw. Zellaggregate und werden von der Analyse ausgeschlossen. Anschließend analysieren Sie die einzelnen Zellen auf der Grundlage ihres Wertes für den Gradienten-RMS-Parameter, der die Schärfe des Bildes angibt, und erstellen ein zweites Gate, das die Zellen mit einem Gradienten-RMS-Wert über dem 50. Perzentil enthält, um die gut scharf aufgenommenen Bilder auszuwählen.

Nach dem nächsten Gate sind die Zellen basierend auf ihrer Größe, gemessen an ihrer Hellfeldfläche, und ihrer Positivität für den erythroiden Marker TER one 19, gemessen an der TER one 19 Fluoreszenzfärbung, mittlere Pixelparameterzellen sehr niedrig oder sehr hoch für TER eins 19 entweder nicht-erythroide bzw. verbleibende Zellaggregate und werden von der Analyse im nächsten Schritt ausgeschlossen. Die Zellen werden auf der Grundlage ihrer Intensität des DR-Fünf-Aspektverhältnisses, des Verhältnisses der Neben- zur Hauptachse ihres Zellkerns und der Intensität ihrer d Dr Fünf-Expression ausgewählt. DR fünf negative Zellen meist enukleierte Zellen wie Retikulozyten und rote Blutkörperchen sowie Zellen mit einem niedrigen Fünf-Aspekt-Verhältnis.

Meist werden Dubletten von der Ganganalyse ausgeschlossen. Sie ziehen fünf positive DNA-positive Zellen mit sich, die zu diesem Zeitpunkt hauptsächlich Erythroblasten sind. Diese Erythroblasten werden dann auf der Grundlage ihrer TER one 19-Fläche, die die Größe der Zelle angibt, und ihrer TER one 19 mittleren Pixelfläche oder Dichte der TER one 19-Expression analysiert, die die Helligkeit ihrer TER one 19-Färbung angibt.

Orthochromatische Erythroblasten werden als kleine TER mit 19 hohen Zellen erkannt. Schließlich ist eine Subpopulation der orthochromatischen Erythroblasten durch ihr niedriges Hellfeld-Aspektverhältnis und ihr hohes Delta sentu XY TUR 19 gekennzeichnet. DR fünf, definiert durch den Abstand zwischen dem Zentrum des beginnenden TUR 19 positiven Retikulozyten und dem Zentrum des DR fünf positiven Kerns zusammen mit Antikörper gegen ihr 19 und dem DNA-Farbstoff DRAAK fünf.

Die Zellen werden typischerweise auch gefärbt, um die Lokalisation von Aktin während der Erythroblast und der Keimbildung zu identifizieren. Bemerkenswert ist, dass der Verlauf der Enukleation als Zellen mit abnehmendem Aspektverhältnis visualisiert werden kann. Das sind Zellen, die sich zunehmend verlängern und mit zunehmendem Delta OID xy TUR eins 19 ziehen fünf beobachtet werden.

F-Aktin konzentriert sich während der Keimbildung an der Spaltfurche und löst sich dann auf, sobald der Kern extrudiert wird. Andere Proteine und Strukturen, die von Interesse sind, können ebenfalls mit den entsprechenden Antikörpern oder fluoreszierenden Markern gefärbt werden, um eine Abbildung ihrer Rolle während der Enukleation zu ermöglichen. Zum Beispiel kann die Bildung polarisierter Mikrotubuli in orthochromatischen Wildtyp-Erythroblasten vor einer Keimbildung sichtbar gemacht werden, nicht jedoch in Erythroblasten, die mit Colchicin behandelt wurden.

Die Hemmung der Tubulinpolymerisation durch Colchicin verringert die Zellpolarisation, wie die Messung des Parameters delta OID XYB FDR five zwischen dem Zentrum des Zellkörpers, das im Hellfeldkanal zu sehen ist, und dem Zentrum der Kernfärbung, die mit DR five erreicht wurde, gezeigt wurde. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, um Fragen zu den Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen zu beantworten, die an der Erythropoese beteiligt sind, wie sie auf Erythroblasteninseln beobachtet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Enukleationsereignisse in einer mit Erythroblast angereicherten Population visualisiert.