Isolierung lebensfähiger mehrzelliger Drüsen aus Gewebe der fleischfressenden Pflanze Nepenthes

Der Anwendungsbereich des vorgestellten Verfahrens besteht darin, einzelne und reine Drüsen aus frischem Pflanzengewebe für die molekularbiologische Analyse zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Kannenblatt von der Pflanze Nepenthes geerntet wird. Das Gewebe wird anschließend direkt auf einer mikroskopischen Probennahmeplattform auf Eis fixiert, um es frisch zu halten.

Während des Mikroprobenahmeverfahrens werden die Drüsen präzise isoliert und vor der quantitativen PCR-Analyse des gewonnenen Materials in die PCR-Röhrchen überführt. Letztendlich kommt die mechanische Mikroprobenahmetechnologie zum Einsatz, um einzelne und reine Drüsen von Napes-Pflanzen zu gewinnen und so schnell und minimalinvasiv spezifisches Gewebe für weitere molekularbiologische Analysen bereitzustellen. Carnivals-Pflanzen sind Spezialisten unter der Flora, da sie in der Lage sind, tierisches Protein zu verdauen.

Unser Wissen darüber, wie das auf molekularer Ebene funktioniert, ist noch begrenzt. Ein gutes Modell, um diese Frage zu untersuchen, ist die Bildmischung des genialen Anhangs, da er deutlich abgegrenzte Organe aufweist, Bilder, die Drüsen produzieren, die zu diesen Verdauungsprozessen beitragen. Im Anhang.

Diese Drüsen befinden sich innerhalb der unten stehenden Abbildungen. Für die molekulare Analyse ist es notwendig, diese breiten und flachen Strukturen mit einem Durchmesser von etwa 100 bis 200 Mikrometern direkt aus frischem Gewebe zu isolieren. Um die Aufgabe noch schwieriger zu machen, sind die Drüsen von einer schützenden Haube bedeckt.

Da die Struktur der Probe einer Carport-ähnlichen Anordnung ähnelt, die dreidimensionale Beobachtungen während der Probenahme erfordert, sowie eines Werkzeugs, das sich sanft in drei Dimensionen bewegen kann, stellten wir fest, dass die derzeitigen Mikrodissektionsverfahren nicht für die Lösung unserer Probleme geeignet sind. Ein Laser beispielsweise versagte aufgrund des hohen Wasseranteils im Pflanzengewebe.

Daher haben wir beschlossen, eine neue mechanische Mikrodissektionstechnik namens aika zu verwenden, um Teile von Geweben oder sogar einzelne Zellen aus 3D-Strukturen zu isolieren. Sie besteht aus einem Stereomikroskop oder Summenmikroskop, in das ein 3D-Mikromanipulator derart integriert ist, dass er sehr flache oder sehr hohe Objekte problemlos erreichen kann. Dieser bewegt sich gemeinsam mit dem Mikroskop als Säule. Bei Probenahmen an Pflanzen verwenden wir häufig Mikrokappillaren.

Jedoch stellten wir im Fall von Anhängerglas fest, dass die mikromechanischen Pinzette, angetrieben durch PTO, für unser Verfahren effektiver arbeitet. Bei der Anhängermethode wurde die Plattform modifiziert. Eine kleine VXY-Bühne trägt einen Behälter mit Eis, der groß genug ist, um sowohl die Gewebeprobe mit ihrem Halter als auch die Stelle aufzunehmen, an der die Drüse abgelegt werden soll.

Das Eis sorgt dafür, dass die Abbauprozesse im Gewebe so stark verlangsamt werden, dass der ursprüngliche molekulare Zustand des Gewebes erkannt werden kann. Das folgende Verfahren wurde aus dem unteren Bereich eines Bildes entnommen. Ein Stück von etwa ein bis zwei Quadratzentimetern wird ausgeschnitten und anschließend abgeflacht.

Das Gewebe wird anschließend mit doppelseitigem Klebeband auf einer Objektglasscheibe fixiert. Diese Gewebeprobe wird mit RNA-freiem Wasser bedeckt und während des Probenahmeverfahrens feucht gehalten. Die Probe wird dann so positioniert, dass die Drüsen und Schutzhauben der Manipulatorseite zugewandt sind.

Der Winkel zwischen Probe und Werkzeug muss so eingestellt werden, dass die Drüsen flach liegen. Mithilfe eines Universalständers kann die Neigung in zwei Achsen justiert und unter dem Mikroskop leicht korrigiert werden. Der Metallständer hält die Probe unter dem Mikroskop kühl.

Die Drüsen sind gut erkennbar. Die Fluoreszenz hilft, die Kontur sowohl der Drüse als auch der Schutzhülle leicht zu identifizieren. Die Probe wird mithilfe eines FSE-Filters zur Isolierung der Drüsen beobachtet.

Für die RNA-Extraktion wird ein UV-Filter verwendet. Eine sehr präzise Positionierung der Mikrozange ist für die Drüsenisolation unerlässlich. Es wird empfohlen, das Werkzeug im Niedriggeschwindigkeitsmodus zu bedienen.

Mit der Mikrozange wird eine Drüse angefahren, und die Arme werden mittels Joystick an ihren Rändern positioniert; anschließend wird die Mikrozange vorsichtig geschlossen. Die Drüse wird dann vorsichtig vom umgebenden Gewebe abgehoben. Nach präziser Isolierung ist die intakte Hohlkammer sichtbar, die das darunterliegende Gefäßgewebe freigibt.

Die isolierte Drüse wird anschließend in das PCR-Röhrchen überführt und in den vorbereiteten Puffer gegeben. Zur Validierung dieser Methode wurde die Genexpression von atoma leg Protein short, TAP, das in die Flüssigkeit abgegeben wird, bestimmt; das Gen kann direkt aus den Drüsen ohne vorherige Extraktion von genomischer DNA amplifiziert werden, allein durch Zugabe der PCR-Reaktionsmischung zum isolierten Gewebe.

Die Versuchsreihe umfasste Drüsen aus unterschiedlich behandelten Nepenthes-Pflanzen sowie Proben ihres umgebenden epidermalen Gewebes. Für jeden Versuch wurde insgesamt RNA extrahiert. Die gewonnene mRNA wurde mittels Reverse Transkription in die entsprechende cDNA umgeschrieben und für die anschließende PCR-Reaktion verwendet.

Um die gewünschte Gensequenz zu amplifizieren, wurde eine Echtzeit-PCR verwendet, um die TLP-Expressionsstufe in Nepenthes-Drüsen und Epidermis zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die TLP-Transkriptmenge in den sekretorischen Drüsen höher ist als im epidermalen Gewebe sowohl bei Nepenthes allotta als auch bei Nepenthes miis, wie durch ein Verhältnis des epidermalen Gewebes zu Drüsengewebe von weniger als eins veranschaulicht wird, um zu prüfen, ob der Kontakt mit Beute die Genexpression induzieren könnte. TLP-Transkriptmengen und unbehandelte Bilder sowie Bilder, die mit Drosophila melanogaster gefüttert wurden, wurden nach dem Fang von Beute verglichen.

Das epidermale Gewebe zeigte hier eine höhere TLP-Expression. Die TLP-Transkriptmenge in Drüsen und epidermalem Gewebe sowie ein behandeltes Bild von Nepenthes miis wurden verglichen. Die Hochregulierung der TLP-Expression in beiden Gewebetypen weist darauf hin, dass die Produktion von Proteinen der Kannenflüssigkeit tatsächlich durch Beute induziert werden kann.

Die PCR-Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Nahrungsaufnahme die TLP-Expression in beiden Gewebetypen effektiv verändert und das Expressionsverhältnis zwischen Drüse und Epidermis verschieben kann. Wir haben eine effiziente Methode zur Gewinnung von Reinigungsmaterial aus FA-Anhanggewebe entwickelt und eine ausreichende Menge an mRNA isoliert, um Genexpressionsanalysen durchzuführen. Mit dieser neuen Methode ist es nicht nur möglich, die Transkriptomik in Anhangdrüsen zu untersuchen, sondern zusätzlich auch die Metabolomik sowie die Proteomik.