Name: Isolierung lebensfähiger mehrzelliger Drüsen aus Gewebe der fleischfressenden Pflanze Nepenthes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Lernen Sie eine mechanische Mikropräparationstechnik zur Isolierung lebensfähiger Drüsen aus Nepenthes-Gewebe. Diese Methode ermöglicht molekulare Analysen für biochemische und metabolomische Studien an fleischfressenden Pflanzen.

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Wir danken dem Gewächshausteam am MPI-CE im Botanischen Garten der Friedrich-Schiller-Universität Jena für die Kultivierung der Pflanzen und Wilhelm Boland und der Max-Planck-Gesellschaft für die Unterstützung.

1. Vorbereitung von Pflanzenmaterial
<ol>
	<li>Alle Nepenthes-Arten wurden entweder in den Gewächshäusern des MPI für chemische Ökologie oder im Botanischen Garten in Jena gezüchtet.</li>
	<li>Für die Vorbereitung des sezernierenden Gewebes wird ein Krug entnommen und das obere Drittel einschließlich Deckel, Peristom und rutschige Zone entfernt. Der Krug kann entweder frisch oder in flüssigem Stickstoff eingefroren verwendet und bei -80 °C gelagert werden.</li>
</ol>
2. Mikrodissektion von Kannengewebe
<ol>
	<li>Die Microsampling-Plattform besteht aus einem Stereomikroskop und einem Mikromanipulator, der direkt am Mikroskopkörper befestigt ist und über einen 3D-Joystick bedient wird. Hier wurde ein früher Prototyp der Aureka verwendet, wie dokumentiert (Abbildung 2A).</li>
	<li>Für die Dissektion der Sekretdrüsen aus Nepenthes-Kannen verwenden Kannen eine Mikrozange und befestigen sie am Manipulator (Abbildungen 2A und 2B).</li>
	<li>Für die RNA-Extraktion sind alle Instrumente (Rasierklingen, Pinzette, Mikromanipulator, Mikrozange, Objektträger) mit RNaseZAP zu behandeln.</li>
	<li>Bereiten Sie die Entnahmeröhrchen vor, indem Sie 9 μl nukleasefreies Wasser und 1 μl RNase-Inhibitor in ein PCR-Röhrchen für die RNA-Extraktion geben. Für die direkte PCR aus Gewebeproben verwenden Sie ausschließlich nukleasefreies Wasser (10 μl).
	<ol>
		<li>Nehmen Sie den frischen oder gefrorenen Krug und entfernen Sie mit einer Rasierklinge und einer Pinzette ein 1-2 cmgroßes Stück Gewebe, das die Sekretdrüsen enthält. Waschen Sie das Taschentuch mit Wasser; 0,1 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) hinzufügen, wenn RNA extrahiert wird.</li>
		<li>Befestigen Sie das Pflanzenmaterial mit doppelseitigem Klebeband auf einem Objektträger (die mit Stopfbuchsen bedeckte Oberfläche sollte nach oben zeigen, Abbildungen 2C und 2D) und befestigen Sie den Objektträger mit Klebeband auf einem Universaltisch, der mit einem beweglichen Tisch angebracht werden sollte.</li>
		<li>Für die Extraktion von Nukleinsäuren sollte die Zubereitung auf Eis erfolgen. Nehmen Sie dazu eine flache Styropordose, stellen Sie den Universaltisch mit der Probe hinein und füllen Sie die Box mit Eis. Legen Sie anschließend die Box unter das Mikroskop.</li>
		<li>Für die Vorbereitung ist die Positionierung der Drüsen sehr wichtig. Die Sekretdrüsen sind teilweise mit einer Schutzhaube bedeckt (Abbildung 3) und nur von einer Seite über die Pinzette zugänglich. Des Weiteren muss der Winkel der Probe zur Pinzette eingestellt werden, indem der Tisch des Universaltisches je nach Nepenthes-Spezies um ca. 135° gekippt wird.</li>
		<li>Die Mikrodissektion erfolgt unter visueller Kontrolle. Verwenden Sie für die Isolierung der Drüsen einen Nicht-UV-Filter, um den Abbau von DNA und RNA zu begrenzen.</li>
		<li>Mikromanipulator und Pinzette über das Bedienfeld auf die ausgewählte Drüse bewegen. Wenn du die Drüse erreicht hast, lege jeden Arm der Pinzette auf beide Seiten der Drüse. Entfernen Sie die Drüse aus dem restlichen Gewebe, indem Sie die Pinzette schließen (Abbildung 4A).</li>
		<li>Richten Sie die an der Pinzette befestigte Verschraubung vom Objekt weg und zum Sammelrohr. Bringen Sie die Spitzen der Pinzette mit der Lösung im Röhrchen in Kontakt (Abbildung 4B). Das Lösen der Drüse durch Öffnen der Pinzette muss gut beobachtet werden, da die Drüsen dazu neigen, an der Werkzeugspitze zu kleben. Das Gewebe kann bei -80 °C bis zur PCR oder RNA-Extraktion gelagert werden.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Direkte PCR-Amplifikation aus Nepenthes-Gewebe
<ol>
	<li>Um die Wirksamkeit der Präparationsmethode nachzuweisen, kann ein PCR-Ansatz direkt aus dem Drüsengewebe ohne DNA-Extraktionsschritt durchgeführt werden.</li>
	<li>Für die PCR-Amplifikation werden genspezifische Primer verwendet, die hier für die Sequenz eines Thhaumatin-ähnlichen Proteins (TLP) kodieren (vorwärts: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', rückwärts: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
	<ol>
		<li>Sammeln Sie 1-5 Drüsen in einem PCR-Röhrchen mit 10 μl nukleasefreiem Wasser. Für eine 50-μl-Reaktion fügen Sie 5 μl 10x Taq-Puffer, 1 μl 10 mM Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) Taq-DNA-Polymerase, 1 μl (100 pmol) jedes Primers und 28,6 μl nukleasefreies Wasser hinzu. </li>
		<li>Führen Sie PCR-Reaktionen in einem Thermocycler mit folgendem Programm durch: Erstdenaturierung 94 °C für 3 Minuten, 35 Zyklen Denaturierung (94 °C für 30 Sekunden), Glühen (59 °C für 30 Sekunden) und Verlängerung (72 °C für 1 Minute) und ein letzter Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C.</li>
		<li>Weisen Sie die Amplifikation des PCR-Produkts mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese nach. Verwenden Sie daher 1,5% (w/v) Agarose und lösen Sie sie in 1x TAE (40 mM Trisbase, 20 mM Eisessigsäure, 1 mM EDTA, pH 8) Puffer auf. Die Lösung in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose aufgelöst hat. Zu 100 ml Agaroselösung 1 μl Ethidiumbromid (10 μg/μl) für die nachgeschaltete Visualisierung hinzufügen. Lassen Sie das Gel in 1x TAE-Puffer bei 300 V, 115 mA für ca. 20 min in einer Elektrophoresekammer laufen. Die korrekte Größe des TLP-Amplikons muss bei 690 bp liegen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. RNA-Extraktion aus kleinen Gewebeproben und reverse Transkription
<ol>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte auf Eis aus. Für die Extraktion von RNA wurden zwei Extraktionsmethoden verwendet, ein Micro Kit für die Extraktion von Gesamt-RNA und ein mRNA-Isolationskit, das mit magnetischen Beads aufgetragen wurde.</li>
	<li>Sammeln Sie mindestens 30 sekretorische Drüsen durch Mikropräparation in einem PCR-Röhrchen, das 1 μl RNase-Inhibitor und 9 μl nukleasefreies Wasser enthält. Anschließend wird das Gewebe in einem Thermocycler 10 min bei 75 °C lysiert.</li>
	<li>Extraktion der Gesamt-RNA.
	<ol>
		<li>Nach der Vorbereitung 90 μl Lyselösung in die Probe geben und 10 min bei 75 °C inkubieren. Anschließend das Reaktionsgemisch auf die Säule (im Lieferumfang des Kits enthalten) laden und mit den Waschschritten fortfahren, wie in der Bedienungsanleitung des Herstellers beschrieben.</li>
		<li>Eluieren Sie die RNA zweimal mit jeweils 10 μl Elutionslösung und fahren Sie mit der DNase I-Behandlung fort.</li>
		<li>Zu 20 μl extrahierter RNA 2 μl 10x DNase I Puffer und 1 μl DNase I (im RNA-Extraktionskit enthalten) geben und 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 2 μl DNase Inaktivierungsreagenz hinzufügen und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach einem Zentrifugationsschritt von 1,5 min bei maximaler Geschwindigkeit kann die RNA in ein frisches RNase-freies Röhrchen überführt werden. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration jeder Probe mit einem Spektralphotometer. Die Proben sollten bei -80 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Extraktion von mRNA mit magnetischen Kügelchen.
	<ol>
		<li>Das Probenvolumen mit Lyse-/Bindungspuffer (im Kit enthalten) auf 100 μl einstellen und 10 Minuten bei 75 °C inkubieren. 20 μl magnetische Kügelchen mit einem Oligo (dT)25-Überhang hinzufügen und die Reaktion 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mischen. Die mRNA bindet über den Poly(A)-Schwanz an den Oligo (dT)25-Überhang der Kügelchen.</li>
		<li>Führen Sie die Waschschritte der an die magnetischen Kügelchen gebundenen mRNA gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Lösungen können mit Hilfe eines Magneten entfernt werden. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 20 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5).</li>
		<li>Entfernen Sie Verunreinigungen der genomischen DNA, indem Sie die Probe 1 Stunde lang bei 37 °C mit 2 μl (1 μl) DNase (2 μl 10x DNase-Puffer und 17 μl nukleasefreies Wasser) behandeln. Anschließend wird die Enzymlösung durch den Magneten entfernt und die Kügelchen werden in 20 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer resuspendiert. Es ist nicht möglich, die RNA-Konzentration zu messen, da sie an die Kügelchen gebunden ist. Die Proben sollten bei -80 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Für die reverse Transkription verwenden Sie ein cDNA-Synthesekit. Die Reaktionen wurden nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.
	<ol>
		<li>Für die reverse Transkription der Gesamt-RNA fügen Sie 1 μl (100 pmol) Oligo (dT)20 Primer oder 1 μl (0,4 μg) Random Hexamere, 1 μl RNase-Inhibitor und 1 μl 10 mM dNTP hinzu Mischen Sie 1 μg RNA und passen Sie das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 14 μl an. Bei 65 °C 5 min inkubieren und anschließend die Proben auf Eis legen. Fügen Sie 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl reverse Transkriptase und 4 μl 5x RT-Puffer hinzu. Die Reaktionen werden 55 min lang bei 50 °C inkubiert, gefolgt von einem Inaktivierungsschritt bei 70 °C für 10 min. Nach der reversen Transkription können die Proben bei -20 °C gelagert werden.</li>
		<li>Bei mRNA, die an magnetische Beads gebunden ist, ersetzen Sie den Tris-HCl-Puffer durch den ersten Reaktionsmix (1 μl RNase-Inhibitor, 1 μl 10 mM dNTP-Mix und 12 μl nukleasefreies Wasser) und inkubieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 65 °C. Aufgrund des Oligo (dT)25-Überhangs der Kügelchen ist es nicht erforderlich, den Proben einen Oligo (dT)20 Primer oder Random Hexamers zuzusetzen. Folgen Sie anschließend dem obigen Protokoll (Schritt 4.5.1).</li>
		<li>Messen Sie die cDNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Echtzeit-PCR
<ol>
	<li>Für die Analysen mit Real-time PCR verwenden Sie die mit dem Micro Kit extrahierte Gesamt-RNA und einen SYBR Green QPCR Master Mix. Um eine gleiche Menge an Transkripten zu gewährleisten, stellen Sie die cDNA-Konzentration jeder Probe nach der reversen Transkription auf den gleichen Wert ein.</li>
	<li>Zusätzlich zu den Proben Kontrollreaktionen einfügen. Verwenden Sie eine Nicht-Schablonenkontrolle, um die Reagenzien auf Verunreinigungen zu untersuchen und die Qualität Ihrer Primer zu überprüfen. Um das Fehlen genomischer DNA zu überprüfen, führen Sie eine Nicht-RT-Kontrolle durch. Beide Reaktionen sollten in der Real-time PCR negativ sein (kein Fluoreszenzsignal).</li>
	<li>Um ein gleiches Transkriptniveau zwischen den verschiedenen Proben zu gewährleisten, verwenden Sie mindestens ein Referenzgen. Hierbei wurden designte Primerpaare verwendet, die für ein Aktin (forward: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', reverse: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') und eine 18SrRNA (forward: 5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGTGGTG-3', reverse: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3') kodieren. Als Zielgen wurde das TLP (forward: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', reverse: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3') gewählt. Die Größe jedes amplifizierten Fragments betrug etwa 100 bp.</li>
	<li>Für eine 25-μl-Reaktion fügen Sie 12,5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ng), 400 nM jedes Primers und 30 nM des passiven Referenzfarbstoffs ROX (im Kit enthalten) hinzu. Stellen Sie das Probenvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 25 μl ein.</li>
	<li>Die Reaktionen wurden in einem QPCR-Thermocycler mit folgendem Programm durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 10 min, um die Polymerase zu aktivieren; 40 Zyklen Denaturierung (95 °C für 30 sec), Glühen (61 °C für 60 sec) und Verlängerung (72 °C für 1 min); gefolgt von der Dissoziationskurve (95 °C für 60 sec, 55 °C für 30 Sekunden, 95 °C für 30 Sekunden). Die Dissoziationskurve ist notwendig, um das Fehlen von Primer-Dimeren zu bestimmen, was durch einen zusätzlichen Peak nachgewiesen werden kann.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Effizienz (E) jeder PCR-Reaktion mit der Methode von Liu und Saint8. Der Wirkungsgrad kann vom linearen Teil der Verstärkungskurve abgelenkt werden. Dabei wird die relative Amplikonzahl (Rn, A) eines Zykluspunktes (CPA) mit der Anzahl der Amplikons (Rn, B) eines anderen Zyklus (CPB) verknüpft.</li>
	<li>Analysieren Sie die Real-time-PCR-Ergebnisse mit dem Relative Expression Software Tool (REST 2009, <a href="http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html" target="_blank">http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html</a>) oder einer ähnlichen Software. Verwenden Sie das Programm, um das Expressionsverhältnis eines Gens in einer behandelten Probe im Vergleich zu einer Kontrolle zu berechnen.</li>
</ol>

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</ol>

Wir haben nichts offenzulegen.

Lange Zeit wurden Studien über sekretorische Strukturen von Pflanzen, insbesondere Trichome, im Wesentlichen anatomisch durchgeführt und waren rein deskriptiv. Es gibt eine große Anzahl von Veröffentlichungen dieser Art, wie sie in Rezensionen von9-11 zusammengefasst sind. Unser biochemisches und molekulares Wissen über die sekretorischen Strukturen von Pflanzen ist immer noch begrenzt, trotz einiger früher bemerkenswerter Arbeiten , z.B. an Minzdrüsentrichomen, die zeigen, dass Drüsentrichome der Ort...

Pflanzen produzieren eine große Vielfalt an Verbindungen mit unterschiedlichen industriellen und pharmazeutischen Anwendungen, die von Molekülen mit geringem Molekulargewicht bis hin zu Polymeren reichen. Solche Verbindungen werden häufig von hochspezialisierten Strukturen produziert und abgesondert, von denen viele an der Oberfläche der Pflanzen lokalisiert sind, wie beispielsweise drüsenförmige Trichome oder Nektarien, oder innerlich, wie Idioblasten bzw. Latex- und Harzkanäle. Über die Biologie dieser spezialisierten sekretorischen Strukturen ist jedoch vergleichsweise wenig bekannt, obwohl alle Arten dieser Drüsen zahlreiche Merkmale aufweisen, die auf einen aktiven Stoffwechsel hindeuten. Insbesondere Drüsen fleischfressender Pflanzen wie Nepenthes können als Modellsysteme in der Pflanzenzellbiologie angesehen werden1.
Fleischfressende Pflanzen sind seit 1875 Gegenstand zahlreicher Studien, als Charles Darwins Werk „Insectivorous Plants“ veröffentlicht wurde.2. Allerdings wurde erst in den letzten Jahren auf molekularer Ebene geforscht, und nach wie vor sind unsere Erkenntnisse begrenzt. Zum Beispiel die Proteinzusammensetzung der Verdauungsflüssigkeit in den Kannenpflanzen der Gattung Nepenthes ist noch nicht vollständig bekannt. Erst kürzlich wurden mehrere hydrolytische Proteine identifiziert sowie einige der entsprechenden Gene3. In den Pheromone-Fallen von Nepenthes (Abbildung 1), mehrzellige Drüsen befinden sich an der inneren Unterseite der Kannen. Diese Drüsen produzieren und sezernieren Verdauungsenzyme in die Kannerflüssigkeit und absorbieren gelöste Nährstoffe aus der Kannerflüssigkeit4Daher stellen diese bifunktionellen Drüsen ein einzigartiges Mikrogewebe mit zentraler Position und Funktion in der Carnivorie von Nepenthes das einer detaillierten Untersuchung wert ist.
<img alt="Anatomie einer fleischfressenden Pflanze, Detail des Kannenblatts von Nepenthes, botanische Untersuchung, Fangmechanismus, Anpassung." src="/files/ftp_upload/50993/50993fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Kannenblatt von Nepenthes alata. Der untere Teil der Kanne enthält die Verdauungsflüssigkeit sowie Drüsen an der Innenseite.
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50993/50993fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.
In der Pflanzenwissenschaft beruhen viele experimentelle Ansätze auf „Bulk-Material“, da nicht ein definiertes Gewebe, sondern ganze Organe untersucht werden. Folglich können ihre Homogenisierung und Analyse nur Ergebnisse liefern, die im Hinblick auf einzelne Gewebe und Zellen verdünnt und anteilig sind5. Um dieses Problem zu lösen, wurden Mikropräparationstechniken wie beispielsweise die sogenannte Laser-Kapture-Mikrodissektion (LCM) entwickelt und erfolgreich zur Gewinnung spezifischer Pflanzengewebe sowie zur Analyse ihrer individuellen Inhalte eingesetzt6. Allerdings ist die LCM häufig eingeschränkt, wenn instabile und/oder schnell abbaubare zelluläre Komponenten wie RNA im Fokus stehen. In solchen Fällen ist die Notwendigkeit einer vorherigen Gewebefixierung, die zeitaufwändig ist und oft mit einem Abbau der Biomoleküle einhergeht, von Nachteil. Zudem scheitert die LCM aufgrund des hohen Wasseranteils vieler Pflanzengewebe und der Festigkeit der Zellwände häufig bei der direkten Präparation aus frischem Gewebe7. Jeder Ansatz zur Untersuchung zellulärer Komponenten, die in Drüsen vorkommen – von Genen, mRNA und Proteinen bis hin zu sekundären Verbindungen und deren Biosynthese – erfordert alternative Techniken für die spezifische Präparation. Daher sind spezielle Methoden zur Isolierung einzelner Zellen oder sogar mehrzelliger Drüsen, die nach der Präparation intakt bleiben, notwendig.
Hier wird eine Methode vorgestellt, die eine automatisierte Mikroprobenahme-Plattform mit direkter mikroskopischer Visualisierung verwendet. Diese Technik ist sowohl schnell als auch effizient bei der Gewinnung einzelner Drüsen aus den Kannen von Nepenthes-Arten. Diese vielzelligen Drüsen sind bifunktional, d. h. sie sind sowohl an Sekretions- als auch an Aufnahmeprozessen beteiligt, sie sitzen fest und nicht exponierte Zellschichten sind durchtränkt, um eine Endodermis zu bilden. Ganze Drüsen können ohne angrenzendes Gewebe isoliert und gezielt in eine PCR-Röhre überführt werden. Diese Technik wird angewandt, um spezifische Gene sowie die Genexpression in den Geweben der Drüsen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Deutschland</td><td>AM1931</td><td>Isolierung von Gesamt-RNA, 50</td></tr><tr><td>Proben Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Deutschland</td><td>61011</td><td>5 ml Dynabeads Oligo (dT)25</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies GmbH, Deutschland</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript CellsDirect cDNA Synthesesystem</td><td>Life Technologies GmbH, Deutschland</td><td>18080-200</td><td>25 Reaktionen</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies GmbH, Deutschland</td><td>10777-019</td><td>Rnase Inhibitor, 5.000 Einheiten</td></tr><tr><td>Zufällige Hexamere (0,4 &mu; g/&mu; l)</td><td>QIAGEN GmbH, Deutschland</td><td>79236</td><td>100 &mu; l</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, molekularbiologische Qualität</td><td>Fermentas GmbH, Deutschland</td><td>R0192</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Taq DNA-Polymerase, (rekombinant)</td><td>Fermentas GmbH, Deutschland</td><td>EP0402</td><td>Lieferung mit 10x Taq Puffer (mit KCl oder (NH4)2SO4) und 25 mM MgCl2</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies GmbH, Deutschland</td><td>AM2238</td><td>1.000</td></tr><tr><td>Einheiten Agarose</td><td>Carl Roth GmbH Co. Deutschland</td><td>T846.3</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Low Range DNA Leiter, gebrauchsfertig</td><td>Fermentas GmbH, Deutschland</td><td>SM1193</td><td>50 &mu; g</td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix</td><td>Agilent Technologies, Inc., USA</td><td>600828</td><td>Einzelset</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Carl Roth GmbH Co., Deutschland</td><td>CK08.1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Carl Roth GmbH Co., Deutschland</td><td>2801.1 / 2855.1</td><td></td></tr><tr><td>GE NanoVue Spektralphotometer</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Deutschland</td><td>28-9569-62</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland</td><td>5331 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P Real-Time PCR System</td><td>Stratagene, USA</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Agagel Standard Horizontal Gelelektrophorese Kammer</td><td>Biometra</td><td>Auslaufartikel</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>aura optik gmbh</td><td>aureka</td><td>Ausgestattet mit einer Mikrozange</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Jena, Deutschland</td><td>SteREO Lumar.V12</td><td>Ausgestattet mit einem AxioCam</td></tr><tr><td>Lumar Filterset 01</td><td>Carl Zeiss, Mikroskopie, Jena, Deutschland</td><td>485001-0000-000</td><td>UV-Filter</td></tr><tr><td>Lumar Filter Set 09</td><td>Carl Zeiss, Mikroskopie, Jena, Deutschland</td><td>485009-0000-000</td><td>Nicht-UV-Filter</td></tr></tbody></table>

isolierung lebensfähiger mehrzelliger drüsen aus gewebe der fleischfressenden pflanze nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Viele Pflanzen besitzen spezialisierte Strukturen, die an der Produktion und Sekretion von spezifischen niedermolekularen Verbindungen und Proteinen beteiligt sind. Diese Strukturen sind fast immer auf Pflanzenoberflächen lokalisiert. Darunter befinden sich Nektarien oder Drüsentrichome. Die sezernierten Verbindungen werden häufig in Wechselwirkungen mit der biotischen Umwelt eingesetzt, zum Beispiel als Lockstoffe für Bestäuber oder zur Abschreckung von Pflanzenfressern.
Drüsen, die in mehreren Aspekten einzigartig sind, finden sich in fleischfressenden Pflanzen. Bei sogenannten Kannenpflanzen der Gattung Nepenthes scheiden bifunktionale Drüsen im Inneren der Fallgrube einerseits die Verdauungsflüssigkeit einschließlich aller für die Beuteverdauung notwendigen Enzyme aus und nehmen andererseits die freigesetzten Nährstoffe auf. Somit stellen diese Drüsen ein ideales, spezialisiertes Gewebe dar, das prädestiniert ist, die zugrunde liegenden molekularen, biochemischen und physiologischen Mechanismen der Proteinsekretion und Nährstoffaufnahme in Pflanzen zu untersuchen. Darüber hinaus könnte generell die Biosynthese von Sekundärverbindungen, die von vielen Pflanzen produziert werden, die mit Drüsenstrukturen ausgestattet sind, direkt in Drüsen untersucht werden.
Um an solchen spezialisierten Strukturen arbeiten zu können, müssen sie effizient, schnell, metabolisch aktiv und ohne Kontamination mit anderen Geweben isoliert werden. Daher wurde eine mechanische Mikropräparationstechnik entwickelt und für Studien an Nepenthes-Verdauungsflüssigkeit eingesetzt. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das zur erfolgreichen Präparierung einzelner bifunktioneller Drüsen aus Nepenthes-Fallen verwendet wurde, basierend auf einer mechanisierten Mikroprobenahmeplattform. Die Drüsen konnten isoliert und nach Präparation der RNA direkt für die Genexpressionsanalyse mittels PCR-Techniken weiterverwendet werden.

Für die Gewinnung einzelner Drüsen aus Nepenthes-Kannengewebe wurde eine mechanisierte Mikrodissektionstechnik entwickelt und angewandt. Die Mikropräparationsplattform muss mit einer an den Mikromanipulator angebrachten Mikrozange ausgestattet sein, die wiederum über ein Bedienfeld gesteuert wird. Einzelne, unter dem Mikroskop sichtbare Drüsen konnten mit der Zange gezielt erfasst und mechanisch entfernt werden (Abbildung 4A).
Das Drüsengewebe wurde direkt in ein PCR-...

Pflanzendrüsen sind spezialisierte Strukturen, die für die Biosynthese und Sekretion vieler Verbindungen verantwortlich sind, die an Wechselwirkungen mit der biotischen Umwelt beteiligt sind. Um Untersuchungen zu ihren molekularen und biochemischen Eigenschaften zu ermöglichen, wurde eine mechanische Mikropräparationstechnik etabliert, um einzelne stoffwechselaktive Drüsen, hier aus der fleischfressenden Pflanze Nepenthes, zu isolieren.

Isolierung lebensfähiger mehrzelliger Drüsen aus Gewebe der fleischfressenden Pflanze Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Der Anwendungsbereich des vorgestellten Verfahrens besteht darin, einzelne und reine Drüsen aus frischem Pflanzengewebe für die molekularbiologische Analyse zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Kannenblatt von der Pflanze Nepenthes geerntet wird. Das Gewebe wird anschließend direkt auf einer mikroskopischen Probennahmeplattform auf Eis fixiert, um es frisch zu halten.Während des Mikroprobenahmeverfahrens werden die Drüsen präzise isoliert und vor der quantitativen PCR-Analyse des gewonnenen Materials in die PCR-Röhrchen überführt. Letztendlich kommt die mechanische Mikroprobenahmetechnologie zum Einsatz, um einzelne und reine Drüsen von Napes-Pflanzen zu gewinnen und so schnell und minimalinvasiv spezifisches Gewebe für weitere molekularbiologische Analysen bereitzustellen. Carnivals-Pflanzen sind Spezialisten unter der Flora, da sie in der Lage sind, tierisches Protein zu verdauen.Unser Wissen darüber, wie das auf molekularer Ebene funktioniert, ist noch begrenzt. Ein gutes Modell, um diese Frage zu untersuchen, ist die Bildmischung des genialen Anhangs, da er deutlich abgegrenzte Organe aufweist, Bilder, die Drüsen produzieren, die zu diesen Verdauungsprozessen bei

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isolierung lebensfähiger mehrzelliger Drüsen aus dem Gewebe der fleischfressenden Pflanze, Nepenthes

Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.

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Dieses Video beschreibt eine Methode zur Isolierung von Magenepithelzellen aus dem menschlichen Fundusgewebe. Die isolierten Epithelzellen können als in vitro Modell verwendet werden, um ihre regulatorische Rolle in der Magenphysiologie und Pathophysiologie zu untersuchen.

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Die intrazelluläre Aufnahme, Sinnes Field Mapping und Kultivierung identifizierten Neuronen in der Leech, Hirudo medicinalis</i

Aus Stammzellen gewonnene Kulturen bergen ein enormes Potenzial zur Modellierung von Infektionskrankheiten. Hier wird die Kultur von mausischen und menschlichen Magenorganoiden beschrieben, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden. Den Organoiden wird der Magenerreger Helicobacter pylori mikroinjiziert.

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung des gesamten, intakte Maus Milchdrüsen um Ausdruck der extrazellulären Matrix (ECM) und duktale Morphologie zu untersuchen. Maus #4 Bauch-Drüsen wurden von ca. 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous Mäusen, in neutral gepuffertem Formalin fixiert, geschnitten und gefärbt mit Immunohistochemistry für ECM Proteine extrahiert.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Einrichtung und Kultivierung von Mensch und Maus abgeleitet 3-dimensionale (3D) Magen Organellen und die Methode für die Übertragung von 3D Organellen auf eine 2-dimensionale monomolekularen Film. Die Verwendung von Magen epithelialen Monolage als eine neuartige Kratzer-Wunde-Assay für Regeneration Studien wird ebenfalls beschrieben.

Abgeleitet von Maus und Mensch primäre gastrische Epithelzellen Monolayer Kultur for the Study of Regeneration

Wir präsentieren eine Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer menschlicher Speicheldrüsen-abgeleiteten Epithelzellen. Diese Zellen zeigen Genexpressionsmuster, die mit ihrem Epithel-Ursprung übereinstimmen und können als Salisphären auf Kellermembranmatrizen aus Engelbreth-Holm-Schwarm-Tumorzellen oder als Monolayer auf behandelten Kulturgerichten angebaut werden.

Isolierung von Speicheldrüsenepithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für In-Vitro-Wachstum als Speicheldrüsen oder Monolayer

Es wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von Drüsen-, Kopfstiel- und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Das Protokoll basiert auf einer trockenen, nicht pufferartigen Extraktion von Trichomen, bei der nur flüssiger Stickstoff, Trockeneis und Nylonsiebe verwendet werden, und eignet sich für die RNA-Extraktion und transkriptomische Analyse.

Nicht-wässrige Isolierung und Anreicherung von glandulären, gestielten und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa

Ein robuster und reproduzierbarer Ansatz zur Etablierung von 2D-Primärkulturen von Zona-Glomerulosa- und Zona-Fasciculata-angereicherten Zellen wurde für den Nebennieren-Cortex der Maus entwickelt. Dieses System bewahrt wichtige molekulare und funktionelle Merkmale jeder Zone und ermöglicht so eine gezielte Untersuchung von Signalwegen, Hormonproduktion und dem Verhalten der Nebennierenkortikale Zellen ex vivo.

Etablierung von zonenangereicherten Primärkulturen aus dem Nebennierenkortex der Maus

Lernen Sie eine mechanische Mikropräparationstechnik zur Isolierung lebensfähiger Drüsen aus Nepenthes-Gewebe. Diese Methode ermöglicht molekulare Analysen für biochemische und metabolomische Studien an fleischfressenden Pflanzen.

Isolierung lebensfähiger mehrzelliger Drüsen aus Gewebe der fleischfressenden Pflanze Nepenthes

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