Beurteilung Myogenic Antwort und Vasoaktivität In Resistance Mesenterialarterien Mit Druck Myographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirkung eines pharmakologischen Wirkstoffs oder eines Krankheitszustands auf den druckinduzierten vaskulären Tonus in kleinen mesenterialen Widerstandsarterien zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die mesenteriale Arterienbogen aus einem murinen Modell isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Arterien vierter Ordnung, also kleine Widerstandsarterien, zu präparieren.

Die nächsten Schritte sind die Kanülierung, die Druckbeaufschlagung und die Inkubation der arteriellen Präparation. In PSS ist der letzte Schritt die Beurteilung der physiologischen Integrität der arteriellen Präparation, die durch die spontane Entwicklung eines vaskulären Tonus sowie durch eine geeignete, umkehrbare Reaktion auf einen Vasokonstriktor und einen Vasodilatator nachgewiesen wird. Letztendlich kann die druckinduzierte Konstriktion gemessen werden.

Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder Diagnose von Hypertonie, Hypotonie oder vaskulärer Dysfunktion. Da diese Technik Schlüsselmechanismen identifiziert, die den druckinduzierten Veränderungen des vaskulären Tonus zugrunde liegen, einem entscheidenden Faktor für vaskulären Widerstand, Perfusion und Blutdruck. Diese Prozedur wird von Dr. Jja demonstriert, einem Postdoktoranden in unserem Labor.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Glaskanüle in einen Mikropipettenhalter laden und den Mikropipettenhalter an eine Perfusionskammer anschließen, um die Perfusionskammer vorzubereiten. Spülen Sie sie nacheinander jeweils fünf Minuten lang mit Milli-Q-Wasser und mit Dissektionslösung aus. Anschließend füllen Sie die Kammer mit zwei Millilitern Dissektionslösung.

Füllen Sie anschließend vorsichtig die gesamte Kanüle und den angeschlossenen Schlauch, ohne Blasen zu erzeugen. Bereiten Sie unter dem Dissektionsmikroskop mit stumpfen Pinzetten zwei Nahtfäden mit jeweils einem halben Knoten vor. Laden Sie mit der Dissektionspinzette beide Kanülen mit leicht geschlossenen Nahtknoten leicht versetzt zur Spitze auf.

Führen Sie anschließend eine mediane Laparotomie an einer narkotisierten Ratte vom Becken bis zum Sternum durch, indem Sie zunächst einen Schnitt in die Haut und danach einen Schnitt in die darunterliegende Muskelschicht ausführen. Dabei ist darauf zu achten, die intraabdominalen Organe nicht zu verletzen. Binden Sie beide Enden getrennt ab, um ein Austreten von Speisebrei und Fäkalien zu verhindern und somit eine Kontamination der extrazellulären Bade­lösung zu vermeiden.

Anschließend schneiden Sie das proximale Ende des Darms nahe der Porus und das distale Ende nahe der Ileozäkalklappe ab. Danach führen Sie einen Einschnitt an der Mesenterialis an ihrer Basis in der Nähe der versorgenden Gefäße durch. Übertragen Sie anschließend das gesamte mesenterische Bett des Dünndarms in einen 50-Milliliter-Becher, der eiskalte Pufferlösung enthält, und inkubieren Sie ihn fünf Minuten lang.

Danach mit frischer Dissektionslösung abspülen, um das Blut zu entfernen. Nun das proximale Ende des Darms auf der rechten Seite in einer mit Sylgard beschichteten Schale fixieren und den verbleibenden Darm im Gegenuhrzeigersinn ausrichten. Das Segment fixieren, um das Mesenterium zu spreizen, und die Blutgefäße unter einem Stereozoommikroskop freilegen.

Präparieren Sie die kleinen mesenterischen Arterien dritter und vierter Ordnung, die parallel zum Dünndarm verlaufen, indem Sie zunächst das gesamte umgebende Fettgewebe in der Nähe des Zweigpunkts zweiter Ordnung entfernen. Danach präparieren Sie die Vene aus und isolieren die Arterie mit einem V-förmigen Abzweigungspunkt. Achten Sie darauf, das ausgewählte Segment nicht zu verletzen.

Isolieren Sie anschließend einen vier bis fünf Millimeter langen Abschnitt der Arterie, der parallel zum Dünndarm verläuft. Schneiden Sie alle Äste fünfter Ordnung, die in den Dünndarm eingebettet sind, leicht entfernt von ihrer Abzweigungsstelle ab und bewahren Sie einen Teilabschnitt auf. Diese Abschnitte dienen als Haltestellen, um arterielle Segmente in eine Perfusionskammer zu überführen und deren Kanülierung später zu erleichtern.

Schneiden Sie dann die arteriellen Segmente durch zwei Inzisionen distal zu den Ästen fünfter Ordnung auf jeder Seite der Arterie und überführen Sie sie in die Perfusionskammer. Kanülieren Sie ein Ende der Gefäße auf einer Glas-Mikropipette, indem Sie die Spitze des arteriellen Segments mit einer Präparationspinzette halten. Schieben Sie die zuvor geladene, teilweise geschlossene Naht auf das kanülierte Ende und befestigen Sie sie.

Anschließend eine mit 10 ml Dissektionslösung gefüllte Spritze an den Stopcock anschließen, der mit dieser Kanüle verbunden ist. Die Spritze vorsichtig anheben. Die Schwerkraft der Lösung bewirkt, dass das intravasale Blut aus dem offenen Ende des Gefäßes entfernt wird.

Nachdem das intraarterielle Blut entfernt wurde, den Hahn schließen. Nun das distale Ende der Gefäße auf eine zweite Glaskanüle binden, indem die andere Kanüle vorsichtig so nah wie möglich an das ungebundene Ende des arteriellen Segments herangeführt wird. Die zuvor belastete, teilweise geschlossene Naht auf das kanülierte Ende schieben und befestigen.

Es ist darauf zu achten, dass nicht an den arteriellen Segmenten gezogen wird, und sicherzustellen, dass die an beiden Kanülen befestigten Hähne geschlossen sind. Überführen Sie die Perfusionskammer auf den Objekttisch des umgekehrten Mikroskops, das mit einer Live-Videoaufzeichnung ausgestattet ist. Anschließend verbinden Sie den Hahn der an das proximale Ende des arteriellen Segments gebundenen Kanüle mit einer servogeregelten Druckregelvorrichtung.

Stellen Sie sicher, dass der an der anderen Kanüle angebrachte Hahn geschlossen bleibt, um einen stabilen intraluminalen Druck aufrechtzuerhalten. Anschließend schließen Sie den Vakuumschlauch an das Perfusionsrohr und die Absaugöffnung an die Perfusionsöffnung der Kammer an. Beginnen Sie damit, das Gefäß mit warmem PSS über den einzelnen Inline-Lösungsheizer mit zwei Milliliter pro Minute zu perfundieren.

Unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe das Vakuum einschalten und die Temperatur von PSS in der Kammer auf etwa 37 Grad Celsius einstellen. Den intraluminalen Druck langsam von 20 auf 100 Millimeter Quecksilber erhöhen. Überprüfen Sie das Gefäß auf Lecks mithilfe der automatischen Druckeinstellung des Druckreglers.

Anschließend den arteriellen Segmentabschnitt unter Beibehaltung eines Drucks von 100 Millimeter Quecksilbersäule auf Krümmungen überprüfen. Mithilfe des Schraubhebels die Kanüle so verschieben, dass der arterielle Segmentabschnitt geradegezogen wird, wobei die arteriellen Segmente nicht überdehnt werden dürfen. Danach den Druck auf 70 Millimeter Quecksilbersäule absenken, um den in-vivo-Druck im mesenterialen Bogen nachzuahmen, und dem arteriellen Segmentabschnitt Zeit geben, sich zu stabilisieren und einen myogenen Tonus auszubilden.

Sehen Sie sich in diesem Verfahren die Arterie mit einem 10x-Objektiv unter dem Mikroskop, das mit einer monochromen Videokamera ausgestattet ist, an. Koppeln Sie die Gerätekamera. Messen Sie den luminalen Durchmesser mithilfe eines Video-Framgrabbers und eines Echtzeit-Kantendetektionssystems.

Zeichnen Sie dann den Gefäßdurchmesser auf und verfolgen Sie die Entwicklung des myogenen Tons. Danach senken Sie den Druck auf 20 Millimeter Quecksilber und lassen Sie den Durchmesser sich stabilisieren. Anschließend erhöhen Sie den intraluminalen Druck in schrittweisen Stufen wie 20, 40, 60, 80 und 100 und lassen Sie die Arterie bei jedem Druck einen stabilen Durchmesser erreichen.

Als nächster Schritt wiederholen Sie die Druckstufenantwort in kalziumfreiem PSS, das 0,39 Millimolar EGTA und 0,1 Millimolar Natriumnitroprussid enthält, wie durch die Aufzeichnung angegeben. Der Durchmesser kleiner Mesenterialarterien von Ratten nimmt spontan ab, wenn sie bei 70 Millimeter Quecksilbersäule pressurisiert werden. Die Zugabe von einem Mikromolar Acetylcholin erhöhte den Durchmesser nahezu auf den Ausgangsdurchmesser. Die Zugabe von einem Mikromolar Phenylephrin zum Gewebeküvettenbad verringerte den arteriellen Durchmesser, und diese Abbildung zeigt, dass die Inkubation kleiner Mesenterialarterien in kalziumfreiem PSS den arteriellen Durchmesser erhöht. Der Durchmesser eines einzelnen pressurisierten arteriellen Segmentes bei verschiedenen Perfusionszuständen ist in dieser Tabelle dargestellt.

Hier wird der arterielle Durchmesser kontinuierlich aufgezeichnet, während der intraluminale Druck schrittweise erhöht wird, und zwar in Gegenwart von PSS und kalziumfreiem PSS. Hier sind die Kurven des erzielten arteriellen Durchmessers bei jedem Druckschritt sowie das Balkendiagramm des bei jedem Druckschritt erreichten myogenen Tonus dargestellt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das myogene Verhalten kleiner Widerstandarterien beurteilt werden kann.

Mit dieser Technik können Sie zusätzliche Verfahren wie die Endothelunterbrechung und die arterielle Perfusion durchführen. Beide Verfahren können weitere Fragen bezüglich der Rolle des Endothels und von Calcium bei der Regulation des Gefäßtonus kleiner Widerstandsgefäße beantworten.