Helminthensammlung und -bestimmung von Wildtieren
14. Dezember 2013
Wilde Tiere werden häufig von einer Vielzahl von Helminthen parasitiert. Die vier Haupttypen von Helminthen sind "Spulwürmer" (Nematoden), "Dornkopfwürmer" (Acanthocephalane), "Egel" (Trematoden) und "Bandwürmer" (Cestoden). Hier beschreiben wir, wie Helminthen von einem Wirbeltier gesammelt werden und wie sie konserviert und taxonomisch identifiziert werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Helme von Wildtieren zu sammeln, zu konservieren und zu identifizieren. Dies wird zunächst durch eine Sektion eines Wildtieres erreicht. Anschließend werden Helme aus verschiedenen Organen gewonnen und mithilfe verschiedener Techniken konserviert, um sie zu einem späteren Zeitpunkt identifizieren zu können.
Schließlich werden die Helme gereinigt, gefärbt und präpariert, und die Arten werden identifiziert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die spezifische Helmstrukturen mittels Klär- und/oder Färbetechniken zeigen, was die Artenbestimmung erheblich erleichtern kann. Obwohl diese Methode zur Identifizierung von Helmen bei Säugetieren, Vögeln, Reptilien und Amphibien angewendet werden kann.
Es kann auch auf andere Organismen wie Fische angewendet werden. Legen Sie das Tier zunächst auf eine ebene Fläche und untersuchen Sie mithilfe einer Lupe alle äußeren Öffnungen, einschließlich Ohren, Mundhöhle und Augen, auf das Vorhandensein von Nematoden, CSEs, Zehen und Trematoden. Verwenden Sie dazu eine scharfe Klinge oder ein Messer sowie eine anatomische Pinzette.
Erstellen Sie einen Einschnitt über der Bauchhöhle, wobei darauf zu achten ist, keine Organe zu verletzen. Öffnen Sie anschließend mit Knochenzangen oder gegebenenfalls einer kleinen Handkreissäge die Brusthöhle. Untersuchen Sie beide Körperhöhlen auf Fädenwürmer, Spulwürmer und große Saugwürmer.
Dann binden Sie einen Faden nahe dem Anfang der Speiseröhre und einen weiteren am Ende des Dickdarms zur Untersuchung fest. Unter einem Stereomikroskop trennen Sie Herz und große Blutgefäße, Luftröhre und Lungen und legen sie in einzelne Petrischalen. Entfernen Sie Leber, Gallenblase und Pankreasgang, Milz, Nieren und Harnblase und untersuchen Sie diese unter dem Stereomikroskop.
Entfernen Sie dann das gesamte Verdauungssystem und legen Sie jeden Abschnitt in eine Glaswanne. Nachdem die Organe entfernt wurden, spülen Sie die Körperhöhle mit einem Schlauch oder einer Spritzflasche, die mit 0,9 %iger Kochsalzlösung gefüllt ist, aus, wobei die Flüssigkeit durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 106 Mikrometern läuft. Spülen Sie den Inhalt des Siebs rückwärts in eine Petrischale und untersuchen Sie den Inhalt unter einem Stereomikroskop. Öffnen Sie mithilfe einer Schere jeden Abschnitt des Verdauungstrakts, um nach Fal-Würmern oder Blutegeln zu suchen.
Skrapieren Sie die Mukosa und untersuchen Sie sie sorgfältig auf das Vorhandensein großer Parasiten. Die Psci von Encanto cephas sind oft tief in der Darmwand eingebettet. Verwenden Sie daher gegebenenfalls Pinzette und/oder kleine Schere, um sie vorsichtig aus dem Gewebe zu lösen.
Legen Sie jeden offenen Abschnitt unter fließendes Wasser und spülen Sie den Inhalt in ein 106-Mikrometer-Sieb. Öffnen Sie anschließend das Herz und die großen Blutgefäße, die Luftröhre sowie die Harn- und Gallenblase, und untersuchen Sie deren Inhalt auf dieselbe Weise. Verwenden Sie eine scharfe Klinge und eine Pinzette, um feste Organe wie Leber, Lunge, Niere, Milz und Bauchspeicheldrüse aufzuschneiden und auseinanderzuziehen, und spülen sowie untersuchen Sie den Inhalt. Notieren Sie die Arten der Parasiten.
Geben Sie die Anzahl der einzelnen Typen und die Organe an, in denen sie vorkommen. Kennzeichnen Sie die Gefäße oder Gläser, indem Sie eine kleine, mit Bleistift beschriftete Karteikarte hineinlegen, um die Helme für spätere genetische Untersuchungen zu erhalten. Stellen Sie sie zunächst direkt in Ethanol.
Nachdem die Probe einen bis mehrere Tage fixiert wurde, überführen Sie sie in ein fünf Milliliter fassendes Glasfläschchen, das mit 70 %igem Ethanol gefüllt ist, um sie für die Langzeitlagerung aufzubewahren. Um Trematoden zu konservieren, legen Sie lebende Exemplare auf einen Objektträger in einen Tropfen physiologischer Kochsalzlösung, setzen ein Deckglas auf und führen den Objektträger kurz über eine Flamme, ohne die Salzlösung zum Kochen zu bringen. Danach legen Sie den Objektträger in eine Petrischale, die Alkohol, Formalin oder Essigsäure oder eine FA-Lösung enthält, und lassen das Deckglas abtreiben.
Fixieren Sie tote Trematoden 48 Stunden lang in FA oder 10 % gepuffertem Formalin, bevor Sie sie zur Langzeitlagerung in ein Gefäß mit 70 %igem Ethanol überführen. Um Estos zu fixieren, entspannen Sie lebende Tiere in einer Petrischale, indem Sie nahezu kochendes Wasser darüber gießen, und überführen Sie sie anschließend zur Langzeitlagerung in ein Gefäß mit 70 %igem Ethanol. Entspannen Sie lebende Encanto-Cephas, indem Sie sie für eine bis mehrere Stunden in eine Petrischale mit Leitungswasser im Kühlschrank stellen, bis der Rüssel vollständig eingezogen ist.
Überführen Sie sie in ein Gefäß, das mit 70 % Ethanol oder einer FA für die Langzeitlagerung gefüllt ist. Töten Sie kleine oder empfindliche Nematoden mit heißem 70 % Ethanol und bewahren Sie sie in einem Gefäß mit 70 % Ethanol und 5 % Glycerin zum Abtöten auf. Mittelgroße bis große Nematoden.
Legen Sie sie in kalte, reine Essigsäure und überführen Sie sie nach 15 Minuten in ein Gefäß, das mit 70 % Ethanol und 5 % Glycerin gefüllt ist. Bereiten Sie Harris-Hämatin vor, indem Sie Hämatin in Alkohol und Ammoniumalumsulfat in Wasser unter Erhitzen auflösen. Mischen Sie beide Lösungen und bringen Sie sie zum Kochen.
Danach Natriumjodat zugeben und zwei bis drei Minuten lang kochen. Nach dem Abkühlen die Lösung durch ein 5 41-Filterpapier filtrieren, um Trematoden sichtbar zu machen, und die Proben über Nacht in Harris-Hämatoxylin oder Semichromsäurekarmesin zur Fixierung aufbewahren. Anschließend in 70 %iger säurehaltiger Ethanollösung geben, bis die Organe sichtbar sind.
Um die Des-Färbung zu stoppen, überführen Sie die Proben in 70 % basisches Ethanol und belassen Sie sie dort mindestens 30 Minuten lang. Dehydrieren Sie die Proben in einer Ethanol-Reihe und klären Sie sie mit Xylol oder Methylsalicylat, um sie auf einem Objektträger zu montieren. Geben Sie einen Tropfen Canada-Balsam hinzu und decken Sie mit einem Deckglas ab. Lassen Sie die Präparate über Nacht trocknen. Klären Sie kleine bis mittlere Nematoden und Enchytraeiden, indem Sie sie in Lactophenol-Montagen auf einem Objektträger geben und mit einem Deckglas abdecken; belassen Sie sie 15 bis 30 Minuten lang in dieser Anordnung für große Nematoden und Enchytraeiden.
Im 80 % Phenol bis zu 60 Minuten belassen. Unter einem Lichtmikroskop untersuchen, um die Klärung kleinerer Strukturen zur Untersuchung der Culex-Atos zu überprüfen. Abschneiden und auf eine Menge Laktophenol geben.
Auf einem Objektträger. Verwenden Sie einen Deckgläser, um die Culex zu zerdrücken, um das Messen und Zählen der rose stellar Haken zu ermöglichen. Schneiden Sie das vordere Ende ab und montieren Sie es auf Foss unter dem Mikroskop.
Einrücken unter einigen Tropfen Lactophenol oder in einer Glycerin-Gelatine-Lösung zur dauerhaften Einbettung. Die Mundteile unter einem Lichtmikroskop beobachten. Nachdem die Schwänze großer Nematoden abgeschnitten und in Lactophenol eingebettet wurden, die ventralen Paolli und die Spicula-Morphologie der Männchen unter einem Lichtmikroskop mit den in diesem Video beschriebenen Methoden untersuchen.
Es wurde eine Untersuchung der Helme der Maskenspitzmäuse in den Sox-Szenarien im Missoula County, Montana, durchgeführt. Zwischen 2007 und 2011 wurden insgesamt 56 Spitzmäuse aus Grubenfallen gesammelt und innerhalb von zwei Stunden nach dem Tod untersucht.
Die Gesamtprävalenz der Infektion betrug 96 %. Lediglich zwei Spitzmäuse waren frei von Parasiten. Es wurden 15 Arten von Helm-Parasiten identifiziert, darunter neun Arten von Esto und sechs Arten von Nematoden. Eine Art der Gattung Esto, Staphylo authorities, war zuvor noch nicht beschrieben worden.
Befallene Organe umfassten das Kleine Darm, den Magen, die Lungen und die Harnblase. Die Gesamtintensität der Infektion reichte von sieben bis 234 Würmern pro infiziertem Wirt; die Artenreichtum der Helminthen oder die Anzahl der Helmintenarten pro infiziertem Wirt lag zwischen ein und acht mit einem Mittelwert von 4,1. Nach Beherrschung dieser Technik kann sie an einem kleinen Säugetier wie einem Eichhörnchen in ein bis zwei Rs und an einem größeren Säugetier wie einem Waschbären in vier bis fünf Rs durchgeführt werden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie Helme von Wildtieren gesammelt, konserviert und identifiziert werden können.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein umfassendes Protokoll zur Sammlung, Konservierung und Identifizierung von Helminthen aus wildlebenden Wirbeltierwirten. Die Methode umfasst eine systematische Sektion, Organuntersuchung, Parasitengewinnung, Konservierung und Artdiagnose mithilfe von Aufhellungs- und Färbetechniken. Das Protokoll ist auf eine breite Palette von Wirbeltieren anwendbar und ermöglicht eine genaue Beurteilung der Helminthenvielfalt sowie der Infektionsintensität in Wildtierpopulationen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Parasitologie
- Wildtierbiologie
- Taxonomie
Hintergrund
- Wilde Tiere werden häufig von Helminthen parasitiert, darunter Nematoden, Acanthocephalen, Trematoden und Cestoden.
- Eine genaue Identifizierung der Helminthen ist entscheidend für das Verständnis der Wirt-Parasit-Beziehungen und der Krankheitsökologie.
- Die Sammlung und Identifizierung von Helminthen erfordert spezialisierte Techniken für die Organpräparation, Parasitengewinnung und morphologische Analyse.
- Konservierungs- und Färbemethoden sind entscheidend für die langfristige Untersuchung und die Identifizierung auf Artenebene.
Zweck der Studie
- Eine standardisierte Anleitung für die Sammlung, Konservierung und Identifizierung von Helminthen aus Wildtieren bereitstellen.
- Techniken zur Extraktion von Helminthen aus verschiedenen Organen und deren Vorbereitung für die morphologische Untersuchung demonstrieren.
- Die genaue Artenbestimmung durch Klärungs- und Färbeprozeduren erleichtern.
Verwendete Methoden
- Nekropsie frisch verendeter Wildtiere (innerhalb von 4–6 Stunden nach dem Tod).
- Systematische Sektion und Untersuchung aller wichtigen Organe mittels Stereomikroskopie.
- Durchspülen der Organe über ein 106 μm-Sieb zur Sammlung von Helminthen.
- Konservierung der Helminthen in Ethanol, Formalin oder Alkohol-Formalin-Essigsäure, abhängig von der Parasitenart.
- Aufhellung (mit Lactophenol oder Phenol) und Färbung (mit Harris-Hämatoxylin oder Semichon-Karmin) zur morphologischen Identifizierung.
- Präparation der Proben auf Objektträgern zur detaillierten Untersuchung.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht eine effiziente Gewinnung und Konservierung von Helminthen aus einer Vielzahl von Wirbeltierwirten.
- Die Artbestimmung wird durch die Visualisierung wichtiger morphologischer Merkmale nach Klärung und Färbung erleichtert.
- In einer Fallstudie an Maskenspitzmäusen (Sorex cinereus) in Montana waren 96 % infiziert, wobei 15 Helminthenarten identifiziert wurden (9 Cestoden, 6 Nematoden), darunter eine bisher nicht beschriebene Art.
- Die Infektionsintensitäten lagen zwischen 7 und 234 Würmern pro Wirt, die Artenvielfalt pro Wirt reichte von 1 bis 8.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige und anpassungsfähige Methode zur Sammlung und Identifizierung von Helminthen in der Wildtierforschung.
- Es erfordert grundlegende Laborausrüstung sowie etwas Fachkenntnis in Anatomie und Parasitenerkennung.
- Die Identifizierung auf Artenebene kann bei schwierigen Fällen eine Expertenberatung oder molekularanalytische Untersuchungen erfordern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Sammlung und Identifizierung von Helminthen aus Wildtieren unterstützt die Zielvalidierung in der Parasitologie und der Infektionsforschung, indem sie eine mechanistische Absicherung von Wirt-Pathogen-Interaktionen ermöglicht. Diese Methode liefert eine vorhersagebasierte Sicherheit in präklinischen Modellen, indem sie die Parasitenlast und Artenvielfalt bei Wirbeltierwirten charakterisiert. Sie trägt zur entdeckungsorientierten Identifizierung translationsrelevanter Biomarker und zur Entwicklung krankheitsrelevanter Systeme für die Identifizierung antiparasitärer Leitsubstanzen bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen zu Wirt-Parasit-Interaktionen durch organspezifische Parasitengewinnung.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Ent风险bewertung, indem die Zugänglichkeit von Zielstrukturen in nativen Gewebekontexten validiert wird.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Wirkstoffkandidaten durch Quantifizierung der Infektionsprävalenz und -intensität über verschiedene Wirtsspezies hinweg.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die Standardisierung nachgeschalteter Assays unter Verwendung von durchsichtigen und gefärbten Präparaten vor.
- Operativer Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit durch standardisierte Protokolle zur Organwäsche, Siebung und mikroskopischen Untersuchung.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Substanzen durch quantifizierbare Helminthenzahlen pro Organ und Wirt.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die Identifizierung von Helminthenarten mit der Organ-Tropismus des Wirts verknüpft wird.
- Operativer Wert: Bietet durch die morphometrische Analyse artenspezifischer Strukturen eine übergreifende Einordnung von translationalen Biomarkern.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt die präklinische Kontinuität durch Dokumentation der Infektionsdynamik in Wirbeltiermodellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zur präklinischen Validierung, indem sie quantifizierbare parasitologische Daten für Go/No-Go-Entscheidungen erzeugt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch organspezifische nekropsiebasierte Untersuchungen und Parasitenisolation.
- Screening: Gewährleistet Einsatzbereitschaft von Assays durch standardisierte Siebung über 106 μm und Stereomikroskopie für eine konsistente Gewinnung von Helminthen.
- Analytik: Ermöglicht vergleichende Analysen anhand dokumentierter Parasitentypen, Organlokalisationen und Intensitätsparameter pro Wirt.
- Translationale Forschung: Schafft Anschlussfähigkeit an präklinische Studien durch Artenidentifizierung, die zur Bewertung der Modellrelevanz beiträgt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Methode in Wirbeltiersystemen einschließlich Säugetiere, Vögel, Reptilien und Amphibien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch artgenaue Identifizierung von Helminthen.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch festgelegte Abläufe bei der Untersuchung und Konservierung von Organen.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unklarheiten in Parasit-Wirt-Studien.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung basierend auf quantifizierten Daten zur Helminthenvielfalt und -intensität.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Sektion von Wirbeltieren und der Erkennung von Organen.
- Setzt Stereomikroskopie und Lichtmikroskopie mit Durchsichtigmachung und Färbemöglichkeiten voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams bei der Organwäsche, Siebung und Konservierung.
- Beinhaltet Anpassungen an verschiedene Wirbeltaxa und Parasitenmorphologien.
- Praktische Einschränkung: Die taxonomische Identifizierung auf Artenebene ist zeitaufwändig und erfordert möglicherweise die Konsultation von Experten oder eine DNA-Analyse.
