Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in Streptococcus pneumoniae Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Fluoreszenzfarbstoffe zu verwenden, um Veränderungen der Membrandynamik und der intrazellulären Ionenkonzentrationen in einem bakteriellen System zu überwachen. Dies wird erreicht, indem Bakterien während ihrer Wachstumsphase zunächst mit dem interessierenden Fluor inkubiert werden, bis es sich über ihre Membranen ausballibriert hat. Anschließend werden die Bakterien mit dem Mittel der Wahl behandelt und ihre Fluoreszenz überwacht.

Die Ergebnisse können Veränderungen der Membrandepolarisation, der Membranintegrität und der intrazellulären Ionenkonzentrationen basierend auf den beobachteten Änderungen der Fluoreszenz der Indikatorfarbstoffe zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen elektrophysiologischen Techniken wie dem Patch-Clamping, das in eukaryotischen Systemen verwendet wird, besteht darin, dass Änderungen der Membrandynamik und der intrazellulären Ionenkonzentrationen in Bakterien nun mittels Fluoreszenz überwacht werden können. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es einige Anstrengungen erfordert, die Farbstoffkonzentrationen zu optimieren.

Belastungsbedingungen und Nachweiseinstellungen Beginnen Sie mit Bakterienzellen. Das Pellet, das gerade in Waschlösung pelletiert wurde, wird zunächst in mindestens einem Milliliter PBS für 100 Millionen KBE pro Milliliter resuspendiert, was für fünf Proben ausreicht. Übertragen Sie einen Milliliter der gewaschenen Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 25 Mikroliter eines einmolaren Filters hinzu.

Mit einer sterilisierten Glukose-Stammlösung werden die Zellen dann 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Heizblock inkubiert. Die zugesetzte Glukose kann je nach Experiment variieren. Fügen Sie nach 15 Minuten fünf Mikroliter des 50-mikromolaren Absterbens und 10 Mikroliter PI-Lösung hinzu.

Mischen Sie die Zellen gründlich, indem Sie sie mehrmals auf und ab pipettieren. Teilen Sie dann diese Zellsuspension in fünf Probenvertiefungen einer durchsichtigen 96-Well-Platte auf. Legen Sie die Platte in ein Vorwarmplatten-Reader-Set für die Erkennung von Dieback-NP ein.

Überwachen Sie nun das Absterbengleichgewicht über den Zellmembranen, indem Sie über einen Zeitraum von 30 bis 40 Minuten einmal pro Minute Messungen durchführen, bis sich die Messwerte auf dem Wert vor der Behandlung stabilisiert haben. Werfen Sie dann die Platte aus und fügen Sie das Versuchsmittel Ihrer Wahl hinzu. Setzen Sie die Platte sofort wieder in das Lesegerät ein und überwachen Sie das Absterben und die PI-Fluoreszenz für die gewünschte Zeit.

Wenn Sie den Ladepuffer für dieses Verfahren vorbereiten, achten Sie darauf, ihn kurz zu wirbeln, bevor Sie PBS und Probenecid hinzufügen. Nachdem Sie diese Lösungen hinzugefügt haben, wirbeln Sie es erneut vor und wickeln Sie es in Folie zu einem Milliliter von zwei x Zellsuspension. Fügen Sie einen Milliliter von zwei x Ladepuffern hinzu.

Das reicht für 10 Proben. Inkubieren Sie die Mischung 75 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad, geschützt vor Licht. Die Konzentration des Farbstoffs und die Inkubationszeit müssen möglicherweise angepasst werden, um den Assay und das Fluoreszenzdetektionsniveau zu optimieren, abhängig von der spezifischen Bakterienspezies und anderen Variablen des experimentellen Systems.

Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation bei jeder Wäsche dreimal. Pelletieren Sie die Zellen bei 2.400 G für 10 Minuten und resuspendieren Sie sie in zwei Millilitern PBS, die ein x Pronic enthalten. Nach den drei Wäschen inkubieren Sie die Zellen weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Dies ermöglicht es Östro in den Bakterien, die Estergruppen des Farbstoffs zu hydrolysieren, wodurch der Farbstoff in der Zelle aktiv wird. Nach dem Pellet entfernen die Zellen die Schlinge und reaktivieren sie in zwei Millilitern PBS, die ein x Probenecid enthalten. Bei Bedarf kann nun Glukose wieder hinzugefügt werden, um die Bakterien wieder mit Energie zu versorgen. Laden Sie 200 Mikroliter der Zellen in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte für jede Probe und laden Sie die Platte in einer Probe in ein Vorwärmgerät.

Nun, zuerst legen Sie einen Basiswert bei den richtigen Wellenlängen und mit einer Rate von einem Messwert pro Sekunde für eine Minute fest. Entfernen Sie dann die Platte und fügen Sie etwa fünf Mikroliter der Behandlung Ihrer Wahl hinzu. Dazu.

Nun, pipettieren Sie schnell ein paar Mal auf und ab, um die Behandlung einzumischen, und geben Sie die Platte sofort wieder in das Lesegerät zurück. Fahren Sie mit den Messungen für die gewünschte Zeit fort. Um die Daten zu analysieren, berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenzwerte für jeden Zeitpunkt, indem Sie den Wert dividieren, eins durch den Wert zwei, und stellen Sie die Verhältniswerte in einem Diagramm dar.

Erstellen Sie zur Vorbereitung eine Reihe von fünf oder sechs Puffern mit hohem Kaliumgehalt mit pH-Werten von 6,5 bis 8,0. Wie im vorherigen Verfahren verwenden Sie einen Vortex, um die beiden x Ladepuffer aus einer Kulturwäsche in der Mitte der logarithmischen Phase vorzubereiten und die Zellen zu konzentrieren. Ersetzen Sie dann das SNAT durch zwei Milliliter BS, um eine Vier-Zellen-Suspension herzustellen.

Kombinieren Sie einen Milliliter der vier x Zellsuspension mit einem Milliliter der zwei x Ladepuffer. Inkubieren Sie nun die Zellen in einem 30 Grad Celsius warmen Wasserbad für 40 Minuten. Schützen Sie es vor Licht.

Waschen Sie nun die Zellen dreimal. Pelletieren Sie die Zellen wie zuvor gezeigt. Fügen Sie vier Milliliter PBS mit zwei x Prop Benin und einem Millimolar Glukose hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation nach den drei Wäschen.

Inkubieren Sie die Zellen weitere fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Um den Hintergrundfluoreszenzfilter zu bestimmen, sterilisieren Sie etwa 500 Mikroliter der energetisierten Bakteriensuspension, um die Bakterien zu entfernen. Übertragen Sie dann 200 Mikroliter des Filtrats auf eine 96-Well-Platte und messen Sie eine Minute lang die Absorption aus dieser Vertiefung.

Um eine In-vivo-Kalibrierungskurve zu erhalten, drehen Sie 500 Mikroliter ALI-Watt der geladenen und unter Spannung stehenden Zellen herunter und reaktivieren Sie sie. Suspendieren Sie sie in einer Reihe von Puffern mit hohem Kaliumgehalt mit unterschiedlichem pH-Wert zu jeder Probe und fügen Sie 20 Mikromolar Risin hinzu. Dadurch wird der intrazelluläre pH-Wert der Zellen mit dem pH-Wert des umgebenden Puffers gleichgesetzt.

Dann inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Proben nach der Inkubation auf die 96-Well-Platte im Plattenreader. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Probe für einige Minuten, um für jede Probe einen Studienwert zu erstellen. Brunnen.

Um diese Daten zu analysieren, subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenzwerte, und berechnen Sie dann das Verhältnis der Fluoreszenzwerte, indem Sie den Wert dividieren. Zeichnen Sie die Verhältniswerte für jeden pH-Puffer nacheinander auf, um die Kalibrierkurve zur Messung von Änderungen des intrazellulären pH-Werts zu erstellen. Laden Sie 200 Mikroliter Proben der unter Spannung stehenden Zellen in eine Platte und messen Sie die Fluoreszenz alle fünf Sekunden für fünf Minuten.

Geben Sie gleichzeitig 10 mikromolare CCCP zu einer Probe, während Sie die interessierenden Wirkstoffe zu den anderen Proben hinzufügen. Die CCCP ist eine zeitlich ausgerichtete Positivkontrolle zur Senkung des intrazellulären pH-Werts. Setzen Sie die Platte sofort wieder in das Lesegerät ein und messen Sie die Fluoreszenz 10 Minuten lang alle fünf Sekunden.

Als zusätzliche Kontrolle werden allen Proben 20 Mikromolaren NI Garrison zugesetzt, um den pH-Wert der Bakterien für weitere fünf Minuten mit dem des Puffers auszugleichen. Bei der Erforschung der Membranpolarität müssen die Bakterien etwa 40 Minuten lang mit Absterben inkubiert werden, damit sich der Farbstoff über der Membran ausgleichen kann. Dies wird durch die stetige Abnahme der Fluoreszenz angezeigt, die sich abflacht.

PI erfordert keine Äquilibrierung, ist aber zusammen mit dem Absterben hilfreich für die Überwachung des Membranbruchs. Gleichzeitig mit der Polarität, Depolarisation und Ruptur der Bakterien wird durch einen Anstieg der Fluoreszenzintensität beider Farbstoffe für weniger als 2:00 Uhr das Verhältnis zweier Fluoreszenzsignale berechnet und eine Zunahme oder Abnahme dieses Verhältnisses entspricht dem intrazellulären Calcium. Für PBFI am wird intrazelluläres Kalium anhand von Fluoreszenzverhältnissen gemessen.

Intrazellulärer Wasserstoff wird anhand des Fluoreszenzverhältnisses B-C-E-C-F am gemessen. Bei Zugabe des Calcium-Ionos fließt Vier-Ionen-Mycin-Calcium in die Zelle, was zu einer Erhöhung des Fluoreszenzverhältnisses führt. Die Zugabe von Valmy hat den gegenteiligen Effekt, dass Kalium aus der Zelle fließt, was sich in einer Abnahme des Fluoreszenzverhältnisses zeigt.

B-C-E-C-F ermöglicht die Messung des intrazellulären pH-Werts; erste Kalibrierungskurven werden in verschiedenen Puffern mit bekanntem pH-Wert erstellt. Eine Abnahme des Fluoreszenzverhältnisses des Farbstoffs entspricht einer Abnahme des pH-Werts. Dies ist bei der Addition des Protons der Kraft CCCP, der schwarzen Linie, und nach der Hinzufügung eines Protonen-Triebkraftdissipators der blauen Linie zu sehen.

Der zweite Pfeil zeigt die Zugabe von Nissin, das die intrazellulären und extrazellulären Wasserstoffkonzentrationen ausgleicht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Membrandepolarisation, die Membranintegrität und die intrazellulären Ionenkonzentrationen in Bakterienzellen misst. Sie sollten auch in der Lage sein, dieses Protokoll als Ausgangspunkt zu verwenden, um andere Eigenschaften und Bakterienzellen zu untersuchen.