Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, fluoreszierende Farbstoffe zu nutzen, um Veränderungen in der Membrandynamik und in den intrazellulären Ionenkonzentrationen in einem bakteriellen System zu überwachen. Dies wird erreicht, indem Bakterien zunächst während ihrer Wachstumsphase mit dem gewünschten Fluorophor inkubiert werden, bis sich dieses über ihre Membranen hinweg ausgeglichen hat. Anschließend werden die Bakterien mit dem gewählten Wirkstoff behandelt und ihre Fluoreszenz wird beobachtet.

Die Ergebnisse können Änderungen in der Membrandepolarisation, der Membranintegrität und den intrazellulären Ionenkonzentrationen widerspiegeln, basierend auf den beobachteten Veränderungen der Fluoreszenz der Indikatorfarbstoffe. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber herkömmlichen elektrophysiologischen Techniken wie der Patch-Clamp-Methode, die in eukaryotischen Systemen verwendet wird, besteht darin, dass nun Veränderungen in der Membrandynamik und den intrazellulären Ionenkonzentrationen mittels Fluoreszenz in Bakterien verfolgt werden können. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da ein gewisser Aufwand erforderlich ist, um die Farbstoffkonzentrationen zu optimieren.

Ladebedingungen und Detektionseinstellungen Beginnen Sie mit bakteriellen Zellen. Zuerst den Pellet in einer Waschlösung resuspendieren, indem der Pellet in mindestens einem Milliliter PBS für 100 Millionen CFU pro Milliliter aufgenommen wird, was für fünf Proben ausreicht. Übertragen Sie ein Milliliter der gewaschenen Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 25 Mikroliter einer einmolarigen Filterlösung hinzu.

Sterilisierte Stammlösung von Glukose zugeben und die Zellen anschließend 15 Minuten lang in einem Heizblock bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die zugesetzte Glukosemenge kann je nach Experiment variieren. Nach 15 Minuten fünf Mikroliter der 50 Mikromolar-Lösung von Dieback und 10 Mikroliter PI-Lösung hinzufügen.

Mischen Sie die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich. Anschließend verteilen Sie diese Zellsuspension auf fünf Probenmulden einer klaren 96-Loch-Platte. Führen Sie die Platte einem vorgewärmten Plattenreader zu, der für die Detektion von dieback NP eingestellt ist.

Überwachen Sie nun die Einstellung des Dieback-Ausgleichs über die Zellmembranen, indem Sie einmal pro Minute über einen Zeitraum von 30 bis 40 Minuten Messungen durchführen, bis die Werte sich auf ihren Vorbehandlungswert stabilisiert haben. Danach entnehmen Sie die Platte und geben das gewünschte experimentelle Agens hinzu. Setzen Sie die Platte unverzüglich in das Messgerät zurück und setzen Sie die Überwachung von Dieback und PI-Fluoreszenz über den gewünschten Zeitraum fort.

Beim Vorbereiten des Lade-Puffers für dieses Verfahren unbedingt kurz vortexen, bevor PBS und Probenecid hinzugefügt werden. Nach Zugabe dieser Lösungen erneut vortexen und mit Aluminiumfolie abdecken, um einen Milliliter zweifacher Zellsuspension zu erhalten. Einen Milliliter zweifachen Lade-Puffer hinzufügen.

Das reicht für 10 Proben. Inkubieren Sie die Mischung 75 Minuten lang in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius, wobei sie während aller dieser Assays vor Licht geschützt sein muss. Die Konzentration des Farbstoffs und die Inkubationszeit müssen möglicherweise angepasst werden, um den Assay und die Baseline-Fluoreszenzdetektionsebene zu optimieren, abhängig von der spezifischen Bakterienart und anderen experimentellen Systemvariablen.

Nach der Inkubation die Zellen dreimal jeweils mit einer Waschung waschen. Die Zellen bei 2.400 Gs 10 Minuten lang pelletieren und in zwei Milliliter PBS, das ein x Pronic enthält, resuspendieren. Nach den drei Waschungen die Zellen weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Dadurch kann das Estro innerhalb der Bakterien die Estergruppen des Farbstoffs hydrolysieren, wodurch der Farbstoff in der Zelle aktiviert wird. Als Nächstes pelletieren Sie die Zellen, entfernen das Überstand und resuspendieren sie in zwei Millilitern PBS, das ein Mal Probenecid enthält. Falls erforderlich, kann nun Glukose hinzugefügt werden, um die Bakterien wieder zu aktivieren. Geben Sie 200 Mikroliter der Zellen pro Probe in ein Loch einer 96-Loch-Platte und laden Sie die Platte in einen vorgewärmten Reader, eine Probe nach der anderen.

Zunächst zunächst eine Messung als Basislinie bei den richtigen Wellenlängen und mit einer Messung pro Sekunde über eine Minute aufnehmen. Danach die Platte entfernen und etwa fünf Mikroliter der gewählten Behandlung hinzufügen. Dazu.

Pipettieren Sie die Behandlungslösung mehrmals schnell auf und ab, um sie gut zu vermischen, und stellen Sie die Platte unverzüglich in das Messgerät zurück. Führen Sie die Messungen über den gewünschten Zeitraum fort. Zur Datenanalyse berechnen Sie für jeden Zeitpunkt das Verhältnis der Fluoreszenzwerte, indem Sie Wert eins durch Wert zwei dividieren, und tragen Sie die berechneten Verhältniswerte in ein Diagramm ein.

Zur Vorbereitung stellen Sie eine Reihe von fünf oder sechs Pufferlösungen mit hohem Kaliumgehalt her, deren pH-Werte zwischen 6,5 und 8,0 liegen. Wie im vorherigen Verfahren verwenden Sie einen Vortex, um den 2x-Lade-Puffer aus einer mittleren Log-Phase-Kultur zu gewinnen, waschen die Zellen und konzentrieren sie. Ersetzen Sie dann das SNAT durch zwei Milliliter BS, um eine 4x-Zellsuspension herzustellen.

Vermischen Sie ein Milliliter der 4x-Zellsuspension mit einem Milliliter des 2x-Ladebuffers. Inkubieren Sie die Zellen nun 40 Minuten lang in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius. Schützen Sie die Probe vor Licht.

Waschen Sie die Zellen nun dreimal. Pelletieren Sie die Zellen wie zuvor gezeigt. Geben Sie vier Milliliter PBS mit zwei x Prop Benin und einem Millimolar Glucose zurück, und wiederholen Sie die Zentrifugation nach den drei Waschschritten.

Inkubieren Sie die Zellen weitere fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Um den Hintergrundfluoreszenzfilter zu bestimmen, sterilisieren Sie etwa 500 Mikroliter der angereicherten Bakteriensuspension, um die Bakterien zu entfernen. Anschließend überführen Sie 200 Mikroliter des Filtrats in eine 96-Well-Platte und messen eine Minute lang die Absorption aus diesem Well.

Um eine In-vivo-Kalibrierungskurve zu erhalten, zentrifugieren Sie 500 Mikroliter ALI-Watt der beladenen und aktivierten Zellen und resuspendieren Sie sie. Suspendieren Sie sie in einer Reihe von Pufferlösungen mit hohem Kaliumgehalt und unterschiedlichem pH-Wert. Geben Sie zu jeder Probe 20 Mikromolar Risin hinzu. Dadurch stellt sich der intrazelluläre pH-Wert der Zellen auf den pH-Wert des umgebenden Puffers ein.

Anschließend die Proben fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Proben in die 96-Loch-Platte im Plattenreader überführen. Die Fluoreszenz jeder Probe mehrere Minuten lang messen, um eine Referenzmessung für jedes Loch zu erhalten.

Um diese Daten zu analysieren, subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenzwerte und berechnen anschließend das Verhältnis der Fluoreszenzwerte, indem Sie Wert eins durch Wert zwei teilen. Tragen Sie die Verhältniswerte für jeden pH-Puffer auf, um die Kalibrierungskurve zu erstellen, mit der Änderungen des intrazellulären pH-Werts gemessen werden können. Geben Sie 200 Mikroliter-Proben der energisierten Zellen in eine Platte und messen Sie die Fluoreszenz alle fünf Sekunden über einen Zeitraum von fünf Minuten.

Geben Sie gleichzeitig 10 µM CCCP zu einer Probe hinzu, während Sie die Substanzen der Untersuchung zu den anderen Proben hinzufügen. CCCP dient als zeitlich synchronisierter positiver Kontrollansatz zur Absenkung des intrazellulären pH-Werts. Stellen Sie die Platte unverzüglich auf das Messgerät zurück und setzen Sie die Fluoreszenzmessung im Abstand von fünf Sekunden über einen Zeitraum von 10 Minuten fort.

Als zusätzliche Kontrolle 20 µmol NI-Garrison zu allen Proben hinzufügen, um den pH-Wert der Bakterien mit dem des Puffers über weitere fünf Minuten auszugleichen. Bei der Untersuchung der Membranpolarität müssen die Bakterien etwa 40 Minuten mit Dieback inkubiert werden, damit sich der Farbstoff über die Membran verteilen kann. Dies zeigt sich durch einen stetigen Rückgang der Fluoreszenz, der schließlich ein Niveau erreicht.

PI erfordert keine Equilibrierung, ist aber zusammen mit Dieback hilfreich zur Überwachung des Membranbruchs. Gleichzeitig mit der Polarität weisen Depolarisation und Bruch der Bakterien auf einen Anstieg der Fluoreszenzintensität beider Farbstoffe hin; für weniger als 2:00 Uhr wird das Verhältnis der beiden Fluoreszenzsignale berechnet, und eine Zunahme oder Abnahme dieses Verhältnisses entspricht dem intrazellulären Kalzium. Für PBFI wird intrazelluläres Kalium durch Fluoreszenzverhältnisse gemessen.

Der intrazelluläre Wasserstoff wird mithilfe der Fluoreszenzverhältnisse von B-C-E-C-F am gemessen. Nach Zugabe des Calcium-Ionophors Ionomycin strömt Calcium in die Zelle, was eine Erhöhung des Fluoreszenzverhältnisses bewirkt. Die Zugabe von Valinomycin hat den gegenteiligen Effekt, wodurch Kalium aus der Zelle austritt, was durch eine Abnahme des Fluoreszenzverhältnisses angezeigt wird.

B-C-E-C-F ermöglicht die Messung des intrazellulären pH-Werts, wobei zunächst Kalibrierungskurven in verschiedenen Puffern mit bekanntem pH-Wert erstellt werden. Eine Abnahme des Fluoreszenzverhältnisses des Farbstoffs entspricht einer Abnahme des pH-Werts. Dies ist bei Zugabe von Protonen durch CCCP, die schwarze Linie, und nach Zugabe eines Protonen-Treibkraft-Dissipators die blaue Linie zu erkennen.

Der zweite Pfeil zeigt die Zugabe von Nissin, die die intrazellulären und extrazellulären Wasserstoffkonzentrationen ausgleicht. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Membran-Depolarisation, die Membranintegrität und die intrazellulären Ionenkonzentrationen in bakteriellen Zellen misst. Sie sollten außerdem in der Lage sein, dieses Protokoll als Ausgangspunkt zu verwenden, um andere Eigenschaften und bakterielle Zellen zu untersuchen.