Name: Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Protokoll zur retinalen Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie. Diese Methode ermöglicht die präzise Darstellung synaptischer Proteine in Mäuseretina mit erhaltener Gewebeintegrität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NIH-Stipendium R01-EY020535 (B.T.S), die International Retinal Research Foundation und die Karl Kirchgessner Foundation (B.T.S).

Bei allen experimentellen Verfahren wurden die Tiere gemäß den Vorschriften in der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung und in Übereinstimmung mit den vom Weill Cornell Medical College genehmigten Protokollen behandelt. Die Tiere wurden durch Kohlendioxid und anschließende Gebärmutterhalsluxation eingeschläfert.
1. Dissektion der Wholemount-Netzhaut
<ol>
	<li>Nachdem die Maus eingeschläfert wurde, enukleieren Sie ihre Augen und legen Sie sie in sauerstoffhaltige, HEPES-gepufferte Ringer-Lösung (Tabelle 1).</li>
	<li>Entfernen Sie die Hornhaut, indem Sie mit einer kleinen Schere in einem kreisförmigen Weg entlang der Ora serrata schneiden und das Auge mit einer Pinzette am Limbus halten. Ziehe die Linse mit einer Pinzette heraus.</li>
	<li>Entfernen Sie so viel Glaskörper wie möglich mit einer Pinzette mit abgestumpftem Rand. Dieser Schritt ist wichtig für Bolusinjektionen und elektrophysiologische Aufzeichnungen; Es ist nicht notwendig, wenn nur Immunhistochemie durchgeführt wird.</li>
	<li>Löse die Netzhaut von der Augenmuschel, indem du die Pinzette zwischen der Netzhaut und der Augenmuschel positionierst und die Pinzette langsam um den Umfang bewegst. Stabilisieren Sie die Augenmuschel, indem Sie die Sklera mit einer zweiten Pinzette festhalten. Schneiden Sie den Sehnerv an der Stelle zwischen Netzhaut und Augenmuschel durch, um die Trennung der Netzhaut von der Augenmuschel zu erleichtern.</li>
	<li>Die Netzhaut kann in Stücke (z.B. Viertel) zerlegt oder als Ganzes verwendet werden. Um in Stücke zu schneiden, verwenden Sie eine Schere, um Schnitte von der Netzhautperipherie bis hinunter zum Sehnerv zu machen. Um die gesamte Netzhaut zu nutzen, können Sie alternativ Schnitte von der Peripherie auf halbem Weg zum Sehnerv vornehmen. Die Einschnitte helfen dabei, eine flache Vorbereitung zu machen.</li>
</ol>
2. Montage auf hydrophilisiertem PTFE-Membraneinsatz
<ol>
	<li>Bereiten Sie die Membran wie unten beschrieben vor. Wenn physiologische Aufzeichnungen oder Farbstoffinjektionsexperimente durchgeführt werden, kürzen Sie den Halter entweder mit einer Drehmaschine oder einer Handsäge so, dass der verbleibende Ring eine Höhe von 1 mm hat 
	Hinweis: Die Einsätze der Kulturplatte können entweder unverändert oder modifiziert sein (Abbildung 1A). Die Wahl der Konfiguration wird durch den Zweck des Experiments bestimmt. Für die Immunfärbung eignet sich ein unmodifizierter Einsatz.</li>
	<li>Polieren Sie raue Oberflächen mit feinem Schleifpapier (Körnung 300 oder höher) ab.</li>
	<li>(Optional) Entfernen Sie die Füße unter dem Ring mit einer Schere.</li>
	<li>Um Schmutz zu entfernen, spülen oder beschallen Sie die Membran 2-3 Minuten lang in destilliertem Wasser.</li>
	<li>Montieren Sie das Gewebe auf der Membran (Abbildung 1A). Legen Sie das Gewebe mit etwas Lösung und einer Kunststoff-Transferpipette auf die Membran. Schneiden Sie bei Bedarf die schmale Spitze der Pipette ab, um zu vermeiden, dass die Gewebeprobe während des Transfers an der Pipette kleben bleibt.</li>
	<li>Befestigen Sie die Netzhaut mit den Ganglienzellen (GCs) nach oben: Entfernen Sie die Lösung auf der Membran nach und nach, während Sie die Netzhaut spreizen und die Falten mit einer Pinzette entfalten.</li>
	<li>Positionieren Sie auf der gegenüberliegenden Seite der Membran eine leere Spritze (1 ml) direkt unter dem Gewebe. Üben Sie einen Sog aus, indem Sie den Kolben auf ein Volumen von 0,2-0,3 ml zurückziehen. Vergrößern Sie die Saugfläche, indem Sie die Haltespitze der Spritze vor der Verwendung abschneiden. Das Gewebe benötigt keine weitere Behandlung der Adhäsion, da es physisch in die Membran eingebunden ist.</li>
</ol>
3. Bolus-Injektion von Isolektin Alexa 488
<ol>
	<li>Bereiten Sie Patch-Pipetten und Färbelösung vor. Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Borosilikat-Kapillarglas mit einem flammenden/braunen Abzieher mit einem Widerstand von ~1 MΩ. Brechen Sie vorsichtig die Spitze der Pipette.</li>
	<li>Stellen Sie eine Färbelösung her, indem Sie 0,3 μl Isolektin Alexa 488 Stammlösung zu 10 μl der in Schritt 1.2 beschriebenen HEPES-gepufferten Ringer-Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe zur Injektion in das Patch-Clamp-Setup (Abbildung 1C). Die Membran mit dem anhaftenden Gewebe wird in die Aufnahmekammer gegeben, die mit erwärmter (37 °C) und sauerstoffhaltiger HEPES-gepufferter Ringer-Lösung durchblutet ist.</li>
	<li>Platzieren Sie die farbstoffhaltige Pipette gegen die innere Grenzmembran (ILM, Abbildung 2A). Schieben Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator weiter gegen das ILM, bis es in dieses eindringt. Injizieren Sie die Färbelösung mit einem Druck von 10-20 psi für 1 Sekunde mit einem Picospritzer. Eine oder mehrere Stellen können für die Injektion vorgesehen sein (Abbildung 2B). Wenn kein Picospritzer zur Verfügung steht, kann eine 10-ml-Spritze verwendet werden, um einen positiven Luftdruck für die Injektion abzugeben.</li>
	<li>Inkubieren Sie das injizierte Gewebe für 10 Minuten. Während der Inkubation kann das injizierte Gewebe unter Epifluoreszenzbeleuchtung betrachtet werden.</li>
	<li>Nach der Markierung kann das Präparat zur Bildgebung an ein Mikroskop gebracht werden. Übertragen Sie den Einsatz in eine Kulturschale mit Glasboden und legen Sie ihn mit der Netzhaut nach unten (Abbildung 1C).</li>
	<li>Fügen Sie einen Tropfen HEPES-Lösung hinzu, um die Probe feucht zu halten.</li>
	<li>Legen Sie 2-3 Flecken Vakuumfett um den Umfang des Kunststoffrings, um den Einsatz fest am Boden der Kulturschale zu befestigen.</li>
	<li>Bringen Sie die Schüssel auf den Mikroskoptisch.</li>
</ol>
4. Paraformaldehyd- und Carbodiimid-Fixierung
<ol>
	<li>Fixieren Sie die Probe, indem Sie den Einsatz für 15 Minuten in das Fixiermittel überführen. Je nach Anwendung können längere oder kürzere Fixierzeiten verwendet werden. Beide Fixiermittel können effektiv verwendet werden, um GFP, Isolektin oder fluoreszierende Alexa-Hydrazide zu fixieren (z. B. zum Befüllen der Zellen in Patch-Clamp-Aufnahmen). 
	Hinweis: Zur Fixierung können entweder 4%ige Carbodiimid- oder 4%ige Paraformaldehydlösungen verwendet werden. Um die Adhärenz zu erhalten, sollte die Fixierung erfolgen, nachdem das Gewebe bereits an der Membran befestigt wurde. Das Gewebe kann sofort nach der Montage oder nach physiologischer Aufzeichnung und/oder Bolusinjektion fixiert werden.</li>
	<li>Spülen Sie das Tuch 30 Minuten lang mit Phosphatpuffer (PB) aus. Danach kann das Gewebe entweder als Ganzbau (Schritt 5) bearbeitet oder in vertikale Schnitte geschnitten und anschließend verarbeitet werden (Schritte 6 und 7).</li>
</ol>
5. Immunfärbung von retinalen Wholemounts
<ol>
	<li>In einer 24-Well-Schale (Abbildung 1D) werden Netzhautstücke auf der Membran 1 Stunde lang in einer Färbelösung blockiert.</li>
	<li>Maus-Anti-PSD-95-Primärantikörper 1:300 in der Färbelösung verdünnen und 48 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln auftragen. ~100-150 μl Antikörperlösung in jede Vertiefung mit dem Gewebe geben. Um ein Austrocknen zu verhindern, füllen Sie ungenutzte Brunnen mit destilliertem Wasser.</li>
	<li>20 min in PB spülen, 3x.</li>
	<li>Inkubieren Sie 24 Stunden lang in einem Esels-Anti-Maus-Antikörper Alexa 568, der 1:500 in der Färbelösung gelöst ist.</li>
	<li>20 min in PB spülen, 3x.</li>
	<li>Legen Sie den Einsatz mit dem gefärbten Gewebe in eine mit PB-Lösung gefüllte Standard-Petrischale von 3 cm. Schneide mit einer kleinen Schere den Teil der Membran, der die Netzhaut enthält, aus dem Ring heraus.</li>
	<li>Übertragen Sie die Netzhaut auf der Membran auf einen Slide Retina nach oben. PB entfernen, Einhängemedium hinzufügen. Legen Sie kleine Stücke eines zerbrochenen Deckglases zwischen den Objektträger und die Deckglasbrille, um ein starkes Quetschen und eine Beschädigung der Netzhaut zu vermeiden. Deckglas aufsetzen.</li>
	<li>Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Bewahren Sie Dias im Dunkeln im Kühlschrank auf.</li>
</ol>
6. Vertikales Schneiden von membrangelagertem Gewebe
<ol>
	<li>Nach der Fixierung tauchen Sie das Gewebe auf der Membran 30 min, 1 h bzw. über Nacht in die Saccharosegradientenlösungen von 10 %, 20 % und 30 % Saccharose ein. Der Übernachtschritt wird bei 4 °C im Kühlschrank durchgeführt, alle anderen Schritte bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Schere die Membran mit dem Taschentuch vom Kunststoff-Einlegering.</li>
	<li>Legen Sie die abgeschnittene Membran mit der Netzhaut nach oben auf Parafilm und entfernen Sie so viel Lösung wie möglich mit Kimwipes.</li>
	<li>Geben Sie den Parafilm mit dem Gewebe in die Kryostatkammer und fügen Sie einen Tropfen OCT-Medium hinzu. Verwenden Sie das Schnellgefriergerät, um das Einfrieren zu beschleunigen.</li>
	<li>Nehmen Sie die gefrorene Probe ab und drehen Sie sie um.</li>
	<li>Überschüssiges gefrorenes OCT abschneiden. Lassen Sie an drei Seiten etwa 2 mm um die Probe herum und lassen Sie 5-6 mm von der Seite entfernt, die am Halter befestigt wird.</li>
	<li>Die freiliegende Netzhautseite (Membranseite) mit einem Tropfen OCT abdecken. Lassen Sie den Befestigungsbereich frei.</li>
	<li>Frieren Sie die Membran mit Netzhautgewebe ein. Nun ist die Probe bereit, um sie auf einen Schneidhalter zu legen.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen OCT auf einen kalten Haltering. Geben Sie die gefrorene Probe sofort in den Tropfen.</li>
	<li>Schneiden Sie Abschnitte mit einer Dicke von 10-20 μm und stellen Sie die Kryostatentemperatur auf -19 °C ein. Verwenden Sie warme (Raumtemperatur) Polysin-Adhäsionsobjektträger. Lassen Sie die Objektträger mit den befestigten Abschnitten für ~2-3 min (41 °C) im Dunkeln auf einer Heizplattform, um eine feste Haftung der Abschnitte zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in eine Aufbewahrungsbox und bewahren Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C auf.</li>
</ol>
7. Immunfärbung von Netzhautschnitten
<ol>
	<li>Nehmen Sie die Dias mit den Abschnitten aus dem Gefrierschrank. Lassen Sie sie 1 Minute bei Raumtemperatur stehen, um das Kondensat zu entfernen.</li>
	<li>Umschließen Sie die Abschnitte mit einem Flüssigkeitsblocker, um eine Barriere für die weitere Inkubation zu schaffen.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in die Inkubationsbox. Decken Sie den Boden der Schachtel mit Wasser ab, um eine Verdunstung der Antikörperlösung zu verhindern.</li>
	<li>5 Min. mit PB spülen.</li>
	<li>Bereiten Sie die gleichen Färbelösungen vor und befolgen Sie die Schritte wie in Schritt 5. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgt über Nacht und mit dem sekundären 1 Stunde. Verwenden Sie keine Glasscherben zwischen Deckglas und Objektträger.</li>
</ol>

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+immunoreactive+axons+in+the+macaque+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Histamine immunoreactive axons in the macaque retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).</li>
<li>Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+the+postsynaptic+density+protein+PSD-95+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina.</a> J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hohe Biokompatibilität und Transparenz der hydrophilisierten PTFE-Membran in Lösungen ist bei der Arbeit mit lebendem Gewebe von Vorteil. Dieses Präparat wurde in früheren Arbeiten erfolgreich für Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Lichtantworten8-10 eingesetzt. Hier zeigen wir, wie dieser Ansatz für die strukturelle Analyse der Wholemount-Netzhaut übernommen werden kann.
Die Bolusladetechnik kann effektiv zur Markierung von lebendem Gewebe eingesetzt werden. Diese Technik wird durc...

Die Durchführung von Immunhistochemie in empfindlichem, intaktem Gewebe birgt das Risiko einer Beschädigung während der Handhabung und des Transfers. Dies kann entweder in Hirnschnitten oder anderen dünnen Geweben, wie z. B. degenerierter Netzhaut, auftreten. Darüber hinaus gibt es bestimmte Methoden der Gewebefixierung, die für die Immunfärbung neuronaler Strukturen vorteilhaft sein können, aber zu einer beeinträchtigten strukturellen Stabilität führen, was ihre Verwendung ausschließt. Ein besonderes Beispiel hierfür ist die Carbodiimid-basierte Fixierung, die für die Färbung der Rezeptoren und Hormone1-7 überlegen ist, aber aufgrund der Instabilität des fixierten Gewebes häufig vermieden wird.
Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine hydrophilisierte PTFE-Membran verwendet, um empfindliches Gewebe, entweder fixiert oder unfixiert, für eine Vielzahl von Färbetechniken strukturell zu stützen. Die Stützmembran ermöglicht die Manipulation von empfindlichem Gewebe vor und nach der Fixierung, wodurch mehrere Verarbeitungsschritte möglich sind und gleichzeitig das Risiko einer Gewebeschädigung minimiert wird. Insgesamt bietet diese einfache Methode zur Erhaltung der Gewebeintegrität die Möglichkeit, Techniken anzuwenden, die sonst vermieden werden könnten. Daher könnte dieser Ansatz auch erfolgreich für die Präparation einer Vielzahl von Geweben eingesetzt werden, wie z. B. Gehirnschnitte, die nach dem Schneiden brüchig werden.

<table><tbody><tr><td>Millicell Zellkultureinsatz, 12 mm, hydrophiles PTFE (Biopore), 0,4 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze, 1 ml</td><td>Beckton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>Dissektion</td></tr><tr><td>Pinzette, Dumont #55, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dissektion</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop System</td><td>Nikon</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarglas</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulturschalen mit Glasboden</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten mit Graduierung</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell-Platten, 24-Well-Beckton</td><td>Dickinson</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas, #1</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>Polysin-Adhäsionsobjektträger</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>63412-01</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Globe</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 71312</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT mittel</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm Laborfilm</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Hochvakuumfett</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-PSD95</td><td>Millipore</td><td>MABN68</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Isolectin Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Chemicon</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341738</td><td></td></tr><tr><td>Carbodiimid</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

optimiertes protokoll für die retinale wholemount-vorbereitung für bildgebung und immunhistochemie

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Die Arbeit mit empfindlichem Gewebe kann ein erschwerender Faktor bei der Durchführung immunhistochemischer Untersuchungen sein. Hier stellen wir eine Methode vor, die eine ringgestützte hydrophilisierte PTFE-Membran verwendet, um sowohl lebendes als auch fixiertes Gewebe während der immunhistochemischen Verarbeitung strukturell zu unterstützen, was die Verwendung einer Vielzahl von Protokollen ermöglicht, die andernfalls das Gewebe schädigen würden. Zunächst wird dies mit der Bolusbeladung von fluoreszierenden Markern in lebendes Netzhautgewebe demonstriert. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Visualisierung der Zielstrukturen, während die Membranstütze die Gewebeintegrität während der Injektion aufrechterhält und eine einfache Übertragung des Präparats für die weitere Bildgebung oder Verarbeitung ermöglicht.
Zweitens wird ein Verfahren zur Antikörperfärbung in Gewebe beschrieben, das mit Carbodiimid fixiert ist. Obwohl die Paraformaldehyd-Fixierung häufiger vorkommt, bietet die Carbodiimid-Fixierung ein überlegenes Substrat für die Visualisierung synaptischer Proteine. Eine Einschränkung von Carbodiimid besteht darin, dass das resultierende fixierte Gewebe relativ zerbrechlich ist; Dies wird jedoch durch den Einsatz der Stützmembran überwunden. Zur Demonstration dieser Techniken wird Netzhautgewebe verwendet, aber sie können auch auf jedes empfindliche Gewebe angewendet werden.

Hier werden zwei repräsentative Experimente gezeigt, die von der Verwendung einer hydrophilisierten PTFE-Membran zur Unterstützung der Netzhautpräparation während der Färbeprozeduren profitieren. Das erste Experiment veranschaulicht die Methode zur schnellen und einfachen Charakterisierung der retinalen Gefäßversorgung, einem komplexen Netzwerk aus Blutgefäßen, das sich über mehrere Netzhautschichten erstreckt (Abbildung 2). Dieser Ansatz kombiniert eine Bolus-Injektion von Isolectin mit einer Tauchmarki...

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Dieses Verfahren verwendet Mausretinagewebe, um zu demonstrieren, wie empfindliches Nervengewebe stabilisiert wird, um die strukturelle Integrität zu bewahren. Führen Sie während mehrerer Schritte der immunhistochemischen Färbung zunächst eine Enukleation des Auges durch, entfernen Sie die Hornhaut und lösen Sie die Netzhaut von der Sklera ab. Machen Sie Einschnitte in die retinale Augenschale, um das Gewebe zu glätten.Dann befestigen Sie die Netzhaut mithilfe eines Saugtransfers ohne direkte Manipulation an einer mit einem Ring verstärkten Membran, um die Integrität des Gewebes zu bewahren. Überführen Sie anschließend den Ring in eine Mehrfach-Well-Platte zur Färbung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Technik effektiv an lebendem Gewebe angewendet werden kann und im Vergleich zu bestehenden Methoden der Handhabung von dissektierter Netzhaut ein überlegenes Substrat für die Abbildung synaptischer Proteine bereitstellt.Mithilfe dieser Techniken ist die Übertragung empfindlichen Gewebes mit minimaler mechanischer Manipulation möglich. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit von Verzerrungen und Schäden. Auf die Idee kamen wir erstmals, als wir Ableitungen von flach montiertem Gewebe bei einem RD1-Mausmodell einer Netzhautdegeneration benötigten, dessen Netzhaut aufgrund umfassenden Zellverlusts, verursacht durch die Mutation Chief, äußerst dünn und fragil ist.Ein Postdoktorand in unserem Labor wird mich bei der Demonstration des Verfahrens unterstützen. Zunächst enukleieren Sie die Augen einer anesthetisierten Maus und überführen die Augen in eine mit Sauerstoff gesättigte, gepufferte Ringer-Lösung. Um die Hornhaut zu entfernen, halten Sie das Auge am Limbus mit einer Pinzette fest und schneiden dann entlang der Ora serrata einen kreisförmigen Schnitt.Ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette für Bolusinjektionen und elektrophysiologische Ableitungen heraus. Verwenden Sie eine Pinzette mit abgerundeter Kante, um so viel Glaskörper wie möglich zu entfernen. Stabilisieren Sie nun die Augenschale, indem Sie die Sklera fest mit der Pinzette halten.Platzieren Sie einen zweiten Satz Pinzetten zwischen der Netzhaut und der Augenschale. Bewegen Sie die Pinzetten langsam um den Umfang herum. Durchtrennen Sie den Sehnerv zwischen der Netzhaut und der Augenschale und entfernen Sie die Augenschale mit der Schere.Erstellen Sie Einschnitte von der Netzhautperipherie bis hin zum Sehnerv. Alternativ, um die gesamte Netzhaut zu verwenden, führen Sie Einschnitte von der Peripherie bis zur halben Strecke zum Sehnerv durch, um den Halter zu verkürzen. Entfernen Sie den überschüssigen Teil mit einer Drehmaschine.Dann glätten Sie raue Oberflächen mit feinem Schleifpapier. Entfernen Sie die Füße von der Unterseite des Ringes. Schneiden Sie die schmale Spitze einer Plastikpipette ab.Überführen Sie das Gewebe anschließend mit etwas Lösung auf die Membran. Entfernen Sie nach und nach die Lösung, während Sie die Netzhaut ausbreiten und das Gewebe entfalten. Befestigen Sie die Netzhaut nun mit den Ganglienzellen nach oben auf der Membran.Schneiden Sie die Haltespitze einer Ein-Milliliter-Spritze ab und positionieren Sie sie direkt unter dem Gewebe. Ziehen Sie den Kolben auf ein Volumen von etwa 0,3 Milliliter zurück, um das Gewebe physikalisch in der Membran einzufangen. Ziehen Sie einige Borosilikat-Kapillarpipetten mit einem Widerstand von ungefähr einem Mega.Dann brechen Sie vorsichtig die Spitze jeder Patch-Pipette. Fügen Sie anschließend 0,3 Mikroliter der selektinreichen Stammlösung zu 10 Mikrolitern der HEPES-pufferten Ringer-Lösung hinzu. Platzieren Sie nun die Membran in die Aufnahmekammer, die mit warmer, mit Sauerstoff angereicherter HEPES-puffertener Ringer-Lösung perfundiert wird.Positionieren Sie die Pipette mit Farbstoff unter Verwendung eines Mikromanipulators an der inneren Begrenzungsmembran. Führen Sie die Pipette weiter vor, um die innere Begrenzungsmembran zu durchdringen. Injizieren Sie dann die Färbungslösung an einer oder mehreren gezielten Stellen.Lassen Sie nun 10 Minuten zur Erholung des Gewebes nach der Injektion verstreichen, während Sie es unter Epifluoreszenz-Beleuchtung beobachten. Falls gewünscht, überführen Sie den Insert in eine Kulturschale mit Glasboden, wobei Sie ihn mit der Retinaseite nach unten platzieren. Geben Sie einen Tropfen Heap-Lösung hinzu, um das Präparat feucht zu halten.Platzieren Sie außerdem drei Tropfen Vakuumfett rund um den Rand des Kunststoffrings, um den Insert fest an der Kulturschale zu befestigen. Überführen Sie die Schale nach der Fixierung auf den Mikroskopständer und tauchen Sie die Membran in die Saccharose-Gradientenlösungen ein. Entfernen Sie die Membran aus dem Kunststoff-Insertring.Entfernen Sie so viel Lösung wie möglich mit Kim-Tüchern und legen Sie es mit der Netzhaut nach oben auf den Param. Übertragen Sie den Paraform mit dem Gewebe in die Kryostatkammer und geben Sie einen Tropfen OCT-Medium hinzu. Verwenden Sie die Schnellgefriervorrichtung, um das Einfrieren zu beschleunigen.Lösen Sie die gefrorene Probe und drehen Sie sie um. Schneiden Sie nun das überschüssige gefrorene OCT ab. Lassen Sie auf drei Seiten etwa zwei Millimeter um die Probe herum stehen und Millimeter von der Seite, die am Halter befestigt wird.Bedecken Sie die freiliegende Netzhautseite mit einem Tropfen OCT, wobei der befestigte Bereich frei bleibt. Gefrieren Sie die Membran, die das Netzhautgewebe enthält. Geben Sie einen Tropfen OCT auf einen kalten Haltering. Bringen Sie die gefrorene Probe sofort in den Tropfen ein. Schneiden Sie 10 bis 20 µm dicke Schnitte bei minus 19 Grad Celsius und platzieren Sie sie auf warmen Polylysin-Haftobjektträgern. Legen Sie die Objektträger mit den angebrachten Schnitten zwei bis drei Minuten im Dunkeln auf eine Heizplattform mit 41 Grad Celsius.Dann lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius. Dieses Experiment veranschaulicht eine schnelle und einfache Charakterisierung der Netzhautgefäße als komplexes Netzwerk von Blutgefäßen, das sich über mehrere Netzhautschichten erstreckt. Durch die Kombination einer Bolus-Injektion von Iso-Selectin mit der Sulfa-Rhodamin-Tauchmarkierung können lebendes Gewebe nahezu unmittelbar in der Netzhaut visualisiert und abgebildet werden, wobei die Blutgefäße von der oberflächlichen bis zur tiefen Schicht markiert werden können.Im Gegensatz zu relativ gut diffusiblen Substanzen dringt SRH-Selectin nicht gut durch die innere Begrenzungsmembran. Die Fixierung mit Carbimid bietet mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen Fixierung mit Parafomaldehyd bei der Markierung synaptischer Proteine. Beispielsweise zeigte nach einer kurzen Fixierungszeit mit Carbimid die immunfluoreszenzchemische Färbung für das synaptische Markerprotein PSD-95 in der IPL ein helles, punktförmiges Erscheinungsbild, das mit der Unterscheidung einzelner Synapsen übereinstimmt.Im Gegensatz dazu ist bei Verwendung eines herkömmlichen Paraformaldehyd-Fixativs die Identifizierung der synaptischen Bestandteile weniger deutlich. Ähnliche Ergebnisse wurden in Kryostatschnitten der Retina erzielt. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein empfindliches Gewebe auf dieser Membran montiert und wie man eine histochenische Färbung auf die Präparation anwendet.Es dauert 15 Minuten, bis Sie die Netzhaut am Filter befestigt haben.

optimized-protocol-for-retinal-wholemount-preparation-for-imaging

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Optimiertes Protokoll für Retina-Ganzpräparate zur Bildgebung und Immunhistochemie

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

Dieser Bericht beschreibt umfassende Methoden zur Vorbereitung von gefrorenen Mausnetzteilen für die Immunhistochemie (IHC).  Die beschriebenen Methoden umfassen die Zerlegung des okularen posterioren Bechers, die Paraformaldehydfixierung, die Einbettung in die Medien der optimalen Schnitttemperatur (OCT) und die Gewebeorientierung, die Schnitt- und Immunfärbung.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

Methanol kann als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung verwendet werden, was für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen nützlich ist.

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Vorbereitung von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie, wobei der Schwerpunkt auf den strukturellen Merkmalen retinaler Photorezeptorterminalien liegt.

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll bietet ein optimiertes und aufwändiges Präparationsverfahren für retinale Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie. Es eignet sich für Anwendungen, die die Analyse von Synapsen in reifen retinalen Organoiden beinhalten.

Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Isolierung der Netzhaut der gesamten Maus und zur Durchführung einer Immunfärbung zur Markierung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs). Dem Prozess folgt die Bildgebung und automatische Zählung von RGCs mit KI-basierter Software, die eine einfache, schnelle und genaue Methode zur Quantifizierung von RGCs in der gesamten Netzhaut der Maus bietet.

Immunfärbung und automatische Zählung von retinalen Ganglienzellen der Maus

Dieses Protokoll kombiniert optisches Clearing und Immunmarkierung für die konfokale Bildgebung des gesamten Volumens von Netzhautorganoiden in der gesamten Halterung. Es bewahrt die 3D-Struktur und ermöglicht eine detaillierte Visualisierung wichtiger neuronaler Signalwege und verbessert die Untersuchung der Netzhautreifung, der räumlichen Organisation und ihrer potenziellen Anwendungen in der Krankheitsmodellierung und personalisierten Medizin.

Visualisierung von retinalen Organoiden mit zellulärer Auflösung

Lernen Sie ein optimiertes Protokoll zur retinalen Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie. Diese Methode ermöglicht die präzise Darstellung synaptischer Proteine in Mäuseretina mit erhaltener Gewebeintegrität.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Weitere Videos entdecken