Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Bei diesem Verfahren wird Netzhautgewebe der Maus verwendet, um zu demonstrieren, wie empfindliches Nervengewebe stabilisiert werden kann, um die strukturelle Integrität zu erhalten. In mehreren Schritten der immunhistochemischen Färbung wird zunächst das Auge entkernt, die Hornhaut entfernt und die Netzhaut von der Sklera getrennt. Machen Sie Schnitte in die Augenmuschel der Netzhaut, um das Gewebe abzuflachen.

Befestigen Sie dann die Netzhaut mit einem Saugtransfer ohne direkte Manipulation an einer ringverstärkten Membran, um die Integrität des Gewebes zu erhalten. Übertragen Sie nun den Ring zum Färben auf eine Multi-Well-Platte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Technik effektiv in lebendem Gewebe eingesetzt werden kann und ein überlegenes Substrat für die Bildgebung von synaptischen Proteinen im Vergleich zu bestehenden Metallen für den Umgang mit präparierter Netzhaut darstellt.

Diese Techniken ermöglichen den Transfer von empfindlichem Gewebe mit minimaler physischer Manipulation. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit von Verformungen und Beschädigungen. Wir hatten diese Idee zum ersten Mal, als wir eine Maus, ein Modell der Netzhautdegeneration, aus flach montiertem Gewebe in RD aufnehmen mussten, und diese Mausnetzhaut ist aufgrund des umfangreichen Zellverlusts, der durch die Mutation Chief verursacht wurde, extrem dünn und zerbrechlich.

Ein Postdoc in unserem Labor wird mir das Verfahren gemeinsam mit mir demonstrieren. Zuerst keimen Sie die Augen einer anästhesierten Maus und übertragen Sie die Augen in eine mit sauerstoffhaltigen Haufen gepufferte Ringerlösung. Um die Hornhaut zu entfernen, halten Sie das Auge mit einer Pinzette an den Limbus und schneiden Sie dann einen kreisförmigen Weg entlang der Ora serrata.

Ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette für Bolusinjektionen und elektrophysiologische Aufzeichnungen heraus. Verwenden Sie eine Pinzette mit gemischten Kanten, um so viel Glaskörper wie möglich zu entfernen. Stabilisieren Sie nun die Augenmuschel, indem Sie die Sklera mit einer Pinzette festhalten.

Positionieren Sie eine zweite Pinzette zwischen der Netzhaut und der Augenmuschel. Bewegen Sie die Pinzette langsam um den Umfang. Durchtrennen Sie den Sehnerv zwischen Netzhaut und Augenmuschel und entfernen Sie die Augenmuschel mit einer Schere.

Machen Sie Schnitte von der retinalen Peripherie bis hinunter zum Sehnerv. Um die gesamte Netzhaut zu verwenden, können Sie alternativ Schnitte von der Peripherie auf halbem Weg zum Sehnerv vornehmen, um den Halter zu verkürzen. Entfernen Sie den überschüssigen Teil mit einer Drehmaschine.

Anschließend polieren Sie raue Oberflächen mit feinem Schleifpapier ab. Entferne die Füße unter dem Ring. Schneide die schmale Spitze einer Plastikpipette ab.

Übertragen Sie dann das Gewebe mit etwas Lösung auf die Membran. Entfernen Sie die Lösung nach und nach, während Sie die Netzhaut spreizen, und entfalten Sie das Gewebe. Befestigen Sie nun die Netzhaut mit den Ganglienzellen nach oben an der Membran.

Schneiden Sie die Haltespitze einer Ein-Milliliter-Spritze ab und positionieren Sie sie direkt unter dem Gewebe. Ziehen Sie den Kolben auf ein Volumen von etwa 0,3 Millilitern zurück, um das Gewebe physisch in die Membran einzubinden. Ziehen Sie einige Boro-Silikat-Kapillarpipetten mit einem Widerstand von etwa einem Mega.

Brechen Sie dann vorsichtig die Spitze jeder Patch-Pipette. Fügen Sie als nächstes 0,3 Mikroliter is selectin Stock Stain-Lösung zu 10 Mikrolitern der gepufferten Klingellösung hinzu. Legen Sie nun die Membran in die Aufnahmekammer, die mit warmer, sauerstoffhaltiger Heaps und gepufferter Ringerlösung durchblutet ist.

Positionieren Sie die farbstoffhaltige Pipette mit einem Mikrom-Manipulator gegen die innere Grenzmembran. Schieben Sie die Pipette weiter vor, um die innere Grenzmembran zu durchdringen. Injizieren Sie dann die Färbelösung in die einzelne oder mehrere Zielstellen.

Lassen Sie nun 10 Minuten zu, bis sich das Gewebe von der Injektion erholt hat, während es unter Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung betrachtet wird. Falls gewünscht, geben Sie den Einsatz in eine Kulturschale mit Glasboden und legen Sie ihn mit der Netzhautseite nach unten. Fügen Sie einen Tropfen Haufenlösung hinzu, um die Probe feucht zu halten.

Platzieren Sie außerdem drei Flecken Vakuumfett um den Umfang des Kunststoffrings, um den Einsatz fest an der Kulturschale zu befestigen. Übertragen Sie die Schale nach der Fixierung auf den Mikroskoptisch und tauchen Sie die Membran in die Saccharose-Gradientenlösungen. Schneiden Sie die Membran aus dem Kunststoff-Einsatzring heraus.

Entfernen Sie so viel Lösung wie möglich mit Kim-Tüchern und legen Sie sie mit der Netzhaut nach oben auf den Param. Übertragen Sie das Paraform mit dem Gewebe in die Kryostatkammer und fügen Sie einen Tropfen OCT-Medium hinzu. Verwenden Sie das Schnellgefriergerät, um das Einfrieren zu beschleunigen.

Nehmen Sie die gefrorene Probe ab und drehen Sie sie um. Schneiden Sie nun das überschüssige gefrorene OCT ab. Lassen Sie etwa zwei Millimeter um die Probe herum an drei Seiten und Millimeter von der Seite, die an der Halterung befestigt wird.

Bedecken Sie die freiliegende Netzhautseite mit einem Tropfen OCT, wobei der anhaftende Bereich frei bleibt. Frieren Sie die Membran ein, die das Netzhautgewebe enthält. Geben Sie einen Tropfen OCT auf einen kalten Haltering.

Geben Sie die gefrorene Probe sofort in den Tropfen. Schneiden Sie 10 bis 20 Mikrometer große Abschnitte bei minus 19 Grad Celsius und positionieren Sie sie auf warmen Polylysin-Adhäsionsobjektträgern. Legen Sie die Dias mit den daran befestigten Abschnitten für zwei bis drei Minuten im Dunkeln auf eine 41 Grad Celsius heiße Heizplattform.

Anschließend lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius. Dieses Experiment veranschaulicht eine schnelle und einfache Charakterisierung des retinalen Gefäßsystems als ein ausgeklügeltes Netzwerk von Blutgefäßen, das sich über mehrere Netzhautschichten erstreckt. Durch die Kombination einer Bolusbeladung mit Iso-Selektin und Sulfa-Panmin-Immersionsmarkierung kann lebendes Gewebe nahezu sofort in der Netzhaut sichtbar gemacht und gescannt werden, Blutgefäße können von der oberflächlichen bis zur tiefen Schicht markiert werden.

Im Gegensatz zu relativ gut diffusionsfähigem SRH ist Selektin nicht gut über die innere Grenzmembran dringend. Es gibt mehrere Vorteile der Fixierung mit Carbimid gegenüber der herkömmlichen Fixierung mit para-Formaldehyd bei der Markierung synaptischer Proteine, beispielsweise nach einer kurzen Periode der Fixierung mit Carbimid-Immunfluoreszenzfärbung für den synaptischen Marker. PSD 95 in der IPL hatte ein helles, punktförmiges Aussehen, das mit der Unterscheidung der einzelnen Synapsen übereinstimmte.

Im Gegensatz dazu ist bei der Verwendung von herkömmlichem Paraformaldehyd-Fixiermittel die Identifizierung der synaptischen Komponenten weniger eindeutig. Ähnliche Ergebnisse wurden in den Schnitten der retinalen Kryostaten erzielt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein empfindliches Gewebe auf diese Membran montiert und wie man die chemische Zytofärbung auf das Präparat eines Masters anwendet.

Es dauert 15 Minuten, bis Sie die Netzhaut am Filter befestigt haben.