Name: Langzeitchronik Pseudomonas aeruginosa Airway-Infektion bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Agar-Beads-Methode zur Erzeugung chronischer Pseudomonas aeruginosa-Lungeninfektionen bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht stabile bakterielle Lasten über einen Monat für Infektionsforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Research in Bragonzi Labor wurde von der italienischen Cystic Fibrosis Foundation (CFaCore) und der EU-F7-2009-223670 finanziert. Ein Teil dieser Arbeit wurde in Alembic, einem fortgeschrittenen Mikroskopie Labor durchgeführt, Histopathologie und Maus wurde in der Abteilung für Pathologische Anatomie (San Raffaele Scientific Institute) durchgeführt.

1. Vorbereiten Bakterien für chronische Infektion (drei und zwei Tage vor der Challenge-Maus) <ol><li> Wählen Sie die entsprechende P. aeruginosa-Stamm getestet werden. </li><li> Impfen eine Öse P. aeruginosa von einer -80 ° C lager Kultur zu einer Trypticase Soy Agar (TSA) Platte und bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen zu 5 ml Trypticasesojabrühe (TSB) in einem 15 ml-Snap-Röhrchen und bei 37 ° C über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 200 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 2. Einbetten Bakterien in Agar-Perlen für chronische Infektion (einen Tag vor der Infektion) <ol><li> Einen kleinen Aliquot der bakteriellen Übernachtkultur, verdünnt 1:50 phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Messen der optischen Dichte (OD) bei 600 nm auf. </li><li> Verdünnt das Nacht-Bakterienkultur durch Zugabe von 2 OD in einer neuen Rast Röhrchen mit 20 ml frischem TSB. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für ca. 3 -4 h auf Phase in einem Schüttelinkubator bei 200 UpM einloggen, bis insgesamt 10-15 OD erreicht wird. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten die TSA, TSB mit 1,5% Agar, Autoklaven und ins Gleichgewicht bei 50 ° C in einem Wasserbad. Ins Gleichgewicht 150 ml preautoclaved schweres Mineralöl in einem Erlenmeyerkolben bei 50 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Nachdem P. aeruginosa erreicht die Log-Phase, sammeln die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 2.700 g für 15 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 ml steriler PBS und gründlich vortexen, um das Pellet vollständig zu suspendieren. </li><li> Mischen 1 ml Bakteriensuspension mit 9 ml flüssiger TSA bei 50 º C voräquilibriert </li><li> Fügen Sie die 10 ml TSA-P. aeruginosa Mischung auf schweres Mineralöl (bei ​​50 ° C vorgewärmt) und sofort rühren für 6 min bei Raumtemperatur. Die Bewegung muss einen sichtbaren Wirbel in der Öl zu produzieren. </li><li> Die Mischung wurde auf 4 ° C, Rühren bei minimalen spEED für 35 min (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie das Agar-Perlen-Öl-Gemisch in Eis für weitere 20 min. </li><li> Übertragen Sie die Agar-Perlen in 50 ml Falcon-Röhrchen und-Zentrifuge bei 2700 g für 15 min bei 4 ° C </li><li> Genau zu entfernen Mineralöl und Waschen mit sterilem PBS sechsmal, wie in Schritt 2.11 beschrieben. Nach drei Waschschritten, können die Kügelchen durch Schwerkraft statt der Verwendung der Zentrifuge pelletiert werden. Nach dem letzten Wasch, resuspendieren Agar-Perlen in 20-30 ml PBS. </li><li> Einen aliquoten der Perlen (ca. 0,5 ml) und aseptisch homogenisieren. </li><li> Nehmen Sie 100 ul der homogenisierten Perlen und in 900 ul sterilem PBS verdünnen. Serienmäßig 1:10 verdünnen auf 10 -6. </li><li> Plattenverdünnungs auf TSA-Platten, einschließlich unverdünnten Probe auf 10 -6 und Inkubation Platten bei 37 ° C </li><li> Messen Sie den Kugeldurchmesser mit einem inversen Lichtmikroskop in mehreren Bereichen. Der Kugeldurchmesser muss zwischen 100-200 um sein ( <strong&gt; Abbildung 1). </li><li> Bewahren Sie die Perlen über Nacht bei 4 ° C </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Übersicht der Agar Perlen Vorbereitung und Maus-Infektion. P. aeruginosa-Zellen werden in 1 ml PBS resuspendiert und zu 9 ml Flüssigkeit TSA (50 ° C). Diese Mischung wird auf 150 ml schweres Mineralöl bei 50 ° C in einen Kolben gegeben und bei hoher Geschwindigkeit für 6 min bei Raumtemperatur gerührt. Wenn der Kolben wird auf 4 ° C mit einer langsamen Rühren für 35 min abgekühlt, verfestigt sich das Agar Schaffung Perlen, und in der Mischung vorhandenen Bakterien werden in den Agar-Kügelchen eingebettet. Detail einer Agar Wulst enthält Bakterienzellen (A) gezeigt. Nach Entfernen des Mineralöls mit mehrmaligem Waschen mit sterilem PBS, bereit f die Agar-Kügelchen-Suspensionoder Impfung in den Lungen von Mäusen eine intratracheale Injektion (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . 3. Mäuse Herausforderung mit Agar-Perlen Ethikerklärung: Dieses Protokoll und Experimentieren an die Richtlinien von der Tierpflege und-Ethik-Kommission von San Raffaele Scientific Institute. <ol><li> Die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (CFU) auf die TSA-Platten, die Anzahl der CFU / ml in dem Agar-Kügelchen-Suspension zu bestimmen. Verdünnen Sie die Agar-Perlen mit sterilem PBS auf 2-4 x 10 7 CFU / ml, um eine optimale Inokulum von 1-2 x 10 6 in 50 ul erreichen. </li><li> Betäuben C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 Wochen alt) männliche Mäuse mit Ketamin (50 mg / ml) und Xylazin (5 mg / ml) in 0,9% NaCl zu einem Volumen von 0,002 ml / g Körpergewicht verabreicht intraperitoneale Injektion. HINWEIS: Anästhesie wird als ADEQUate, wenn das Tier bleibt immer noch ruhig, reagiert nicht auf äußere Reize, und eine konstant Herz-und Atemfrequenz. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage. Desinfizieren Sie den Mantel der Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Setzen Sie die Luftröhre durch einen vertikalen Schnitt der Haut und Intubation der Luftröhre mit einer sterilen, flexible 22 G 0,9 mm x 25 mm IV-Katheter, halten die Aufmerksamkeit auf das Stilett entfernen während der Bewegung nach unten in die Luftröhre. Legen Sie den Katheter nicht zu tief in die Luftröhre. Stopp vor dem Erreichen der carina (Bifurkation). </li><li> Nehmen Sie sofort ein Volumen von 50 ul Agar-Bead-Suspension mit einer 1-ml-Spritze und befestigen es an dem Katheter. Schieben Sie den Kolben der Spritze, so dass die Perlen in die Lunge implantiert werden. Schließen Sie den Schnitt mit Wundklammern. </li><li> Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen, bis ganz wach. </li></ol> 4. Mäuse Bewertung <ol><li> Beachten Sie die Mäuse täglich auf klinische Zeichen einschließlich der Fellqualität, Körperhaltung,Gehfähigkeit und Flüssigkeitsstatus. Überwachung der täglichen Körpergewicht. Mäuse, die ≥ 20% des Körpergewichts verlieren, müssen eingeschläfert werden. </li><li> Folgen Sie Punkt 5 für die Sammlung der bronchoalveolären Lavage (BAL) und 6 oder 7 Punkte für die Sammlung der Lunge und der Analyse der Gesamt CFU, histologische Analyse, entzündliche Reaktion im Bereich der Gesamt-und Differential-Zellzahl in der BAL, Zytokin-Analyse und Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität. </li></ol> 5. BAL Fluid-Sammlung und Analyse <ol><li> Euthanize die Mäuse durch CO 2-Inhalation. </li><li> Platzieren Sie die Maus in der Rückenlage. Desinfizieren Sie den Mantel der Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Aussetzen sowie die Trachea Brustkorbs durch einen vertikalen Schnitt der Haut. Expose der Lunge durch Schneiden der Membran. </li><li> Setzen Sie einen Faden unter der Luftröhre mit einer Pinzette und Intubation der Luftröhre mit einer sterilen, flexible 22 g 0,9 mm x 25 mm IV-Katheter. Ziehen Sie die beiden Enden des Fadens Thread, um die ca. bindentheter zu der Trachea und verknoten den Faden um die Luftröhre. </li><li> Nehmen Sie ein Volumen von 1 ml RPMI 1640 mit einer 1-ml-Spritze und befestigen es an dem Katheter. Drücken Sie den Kolben der Spritze, um die Lungen zu waschen und sofort wieder die Flüssigkeit, Speichern in einer 15 ml Tube. HINWEIS: Wenn Zytokine analysiert werden sollen, fügen Sie Protease-Inhibitoren zu RPMI 1640. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal mit insgesamt 3 ml RPMI. Von nun an, speichern Sie die BAL-Flüssigkeit auf Eis. Zum für die Sammlung und Analyse von Lungen Schritt 6 weiter. HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass nicht alle der Flüssigkeit abgerufen werden (2,8 ml Maximum). </li><li> Zur Quantifizierung der in der BAL-Flüssigkeit Bakterien, probieren Sie eine kleine Teilmenge (300 ul) seriell verdünnt 1:10 in sterilem PBS, Platte auf TSA-Platten und Inkubation bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Graf gesamten Zellen mit einem inversen Lichtmikroskop Verdünnung einen aliquoten Teil der BAL-Flüssigkeit 1:2 mit Tuerk Lösung in einer Burker Zellzahl Kammer. </li><li> Zentrifugieren Sie die remaining BAL-Flüssigkeit bei 330 × g für 8 min bei 4 ° C. Mit der Überstand für ELISA Zytokin-Analyse, Lagerung bei -80 ° C. Folgen Sie den Schritten von 5,10 bis 5,13 für Differential-Zellzahl von Zytospin. </li><li> Wenn die Pellets ist rot, lysieren die Erythrozyten Resuspendieren des Pellets in 250 bis 300 ul von RBC Lyse-Puffer 1:10 verdünnt in ultra-reinem destilliertem Wasser für 3 min. Neutralisiert mit 2 ml PBS und Zentrifugation bei 330 g für 8 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in RPMI 10% fetales Rinderserum (FBS). Verwenden ein Volumen, das 1 x 10 6 Zellen / ml, bezogen auf die Gesamtzellzahl zur Verfügung stellt. </li><li> Zeigen Mikroskop-Objektträger und Filter in entsprechende Schlitze in der Zytospin Karton mit den Filter vor der Mitte des Zytospin. Pipettieren Sie 150 ul jeder Probe in die entsprechenden Wells der Zytospin und in einer Zentrifuge Zytozentrifuge bei 300 g für 5 min. </li><li> Stain Dias von Romanowsky Färbung mit einem kommerziellen Kit nach der masteller Anweisungen und 12, wie zuvor beschrieben. Folgen Sie den Schritten von 5,14 bis 5,17 für die MPO-Aktivität Analyse. </li><li> Zentrifugieren des verbleibenden Volumens der BAL bei 380 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Pellet in 250 ul 0,5% Hexadecyltrimethylammoniumchlorid in ultra-reinem destilliertem Wasser, um die Zellen zu lysieren. Die Suspension kann bei -20 ° C für mehrere Tage vor dem Test eingefroren. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C lagern und den Überstand zu MPO-Assay in 96-Well-Platten durchzuführen, indem die Probe in Doppelbestimmung in jedes Loch und, wenn nötig, auch die richtige Verdünnungen der Probe. </li><li> In den jeder Probe in die Vertiefungen ein gleiches Volumen von 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat für Peroxidase. Die Reaktion kann im Dunkeln für mindestens 5 Minuten dauern, und, bis keine weitere Entwicklung in der Farbe. </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 2 MH 2 SO 4 and messen die OD bei 450 nm auf. Der OD-Wert wird direkt proportional zur Peroxidase-Aktivität. </li></ol> 6. Messung der bakterielle Belastung in Lungen-und Zytokin-Analyse <ol><li> Unmittelbar nach der BAL-Flüssigkeit Sammlung, Verbrauch Lungen von der Maus, spülen Sie sie in sterilem PBS, separate Lappen, legte sie in einem Rundrohr mit 2 ml sterilem PBS und Lagerung auf Eis. HINWEIS: Wenn Cytokine untersucht werden sollen, hinzuzufügen Proteaseinhibitoren PBS zu den Rohren. </li><li> Aseptisch homogenisiert Lunge, nehmen Sie eine kleine Teilmenge (300 ul) aus dem Homogenat, seriell verdünnt 1:10 in PBS, Platte auf TSA-Platten und bei 37 ° C über Nacht. Bitte beachten Sie, dass die Gesamtatemwege bakterielle Belastung wird die Summe der KBE in BAL und Lunge sein. </li><li> Zentrifugieren des verbleibenden Homogenat bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Nehmen Sie den Überstand für ELISA Zytokin-Analyse und bei -80 ° C </li></ol> 7. Die histologische Untersuchung &lt;ol&gt; <li> Führen Sie die histologische Analyse nur auf die Lunge, in der BAL-Flüssigkeit wurde nicht gesammelt wurden, an Lungenkrebs zu Aspekt und Eigenschaften zu bewahren. </li><li> Euthanize der Maus durch CO 2-Inhalation. </li><li> Expose der Brustkorb durch einen vertikalen Schnitt der Haut, die Lunge aussetzen, indem das Zwerchfell. </li><li> Verbrauch Lunge, spülen Sie sie in PBS, trennen Sie die Lappen, legte sie in ein Röhrchen mit 5-10 ml 10% neutral gepuffertem Formalin (4% Formaldehyd) und bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li><li> Einbettung in Paraffin Lunge, Verwendung von Standardverfahren. </li><li> Cut 5 um dicke Schnitte mit einem Mikrotom. </li><li> Stain Folien mit Hämatoxylin und Eosin und decken die Objektträger mit einem Deckglas, nach Standardverfahren. </li><li> Untersuchen Sie gleitet mit einem inversen Mikroskop-Hell und Bilder zu erwerben, indem Sie das Mikroskop mit einer Kamera. </li></ol>

<ol><li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li>
<li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li>
<li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li>
<li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li>
<li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li>
<li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li>
<li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKukavica-Ibrulj%2C+I+%22Methods+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+Humana+Press%22">Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press</a>. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).</li>
<li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.</li>
<li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.</li>
<li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells%2C+their+cytokines+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence.%5BTitle%5D)+AND+%22AJRCCM%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.</a> AJRCCM. In press, (2009).</li>
<li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, Forthcoming.</li>
<li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog.%22%5BJournal%5D)">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die kritischen Schritte in der P. aeruginosa-Perlen Vorbereitung und Maus Herausforderung sind nachstehend angegeben. Die P. aeruginosa Stamm für Mäuse verwendet Herausforderung ist kritisch. Sterblichkeit, chronische Infektion oder Freiraum kann, abhängig von der Bakterienstamm für die Herausforderung unterscheiden. Die P. aeruginosa RP73 klinischen Stamm wurde über die PAO1 Referenzlaborstamm bevorzugt, da es zu einer vergleichsweise niedrigeren Sterblichkeit, me...

Cystische Fibrose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch Mutationen in der Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR)-Gen verursacht. Dieses Gen kodiert für ein Chlorid-Kanal auf der Membran der meisten Epithelzellen exprimiert. Bronchiektasen, Schleim-Plugging und Parenchymdestruktion hauptsächlich verursacht durch Pseudomonas aeruginosa-Infektionen zunehmend zu schweren Lungenerkrankungen und Sterblichkeit in den meisten CF-Patienten ein zu führen. Understanding CF Pathogenese und Weiterentwicklung neuer Therapien stützen sich auf Tiermodell mit charakteristischen Merkmalen des CF. Mehrere Mäuse, die genetisch für das CFTR-Gen modifiziert wird, erzeugt worden sind, aber Einschränkungen in der Fähigkeit dieser Spezies CF artige Lungenerkrankungen und mehrere andere Organ Anomalien bei CF-Patienten gesehen rekapitulieren wurden weitgehend dokumentiert 2. Entwicklung der Infektion ist eine der großen Herausforderungen in der CF-Tiermodell. Die Literatur clfrühen legt nahe, dass eine chronische Infektion, die länger als einen Monat kann nur erreicht werden, wenn Mäuse mit Bakterien in einem Immobilisierungsmittel eingebettet, wie Agar, Agarose, Alginat oder Algen 3-5 geimpft werden. Diese Immobilisierungsmittel bieten die mikroaerobe / anaeroben Bedingungen, die Bakterien in der Form von Mikrokolonien ähnlich dem Wachstum in den Schleim von CF-Patienten 6 zu halten, zu erlauben. Dieses Modell der chronischen Infektion führt zur Persistenz der Bakterien in den Lungen verursacht Atemwegsentzündung und Schäden 7. Abhängig von der verwendeten Methode, der Bakterienstamm und die Dosis in die Lunge eingeimpft, der Prozentsatz der chronischen infizierten Mäusen und die Keimbelastung in der Lunge zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen erheblich abweichen. Insbesondere die größte Herausforderung für die langfristige chronische Infektion bleibt die geringe Keimbelastung von P. aeruginosa und der geringe Anteil der infizierten Mäuse Wochen nach dem Challenge, was that Bakterienzellen werden nach und nach durch den Host gelöscht. Durch die Auswahl der P. aeruginosa RP73 klinischen Belastung aus einer Sammlung von CF-Isolate 8 wir niedrige Sterblichkeit, mehr schwere Läsionen und hoher Prozentsatz der chronischen Infektion erfolgreich erhalten mit einer stabilen Bakterienbelastung bis zu einem Monat in C57Bl/6NCrl Mäusen. Dieses Papier beschreibt die Methode für die Einbettung von P. aeruginosa in den Agar-Perlen, wir haben Mäusen durch Intratrachealbiopersistenztest infiziert, die bakterielle Belastung gemessen und Zytokine in Lunge, gesammelt BAL und histologische Untersuchung durchgeführt. Insgesamt wird dieses Protokoll Forscher bei der Behandlung grundlegend wichtige Fragen zur Pathogenese 8,9 und Prüfung neuer Therapien gegen P. unterstützen aeruginosa chronische Infektion 10,11.

<table><tbody><tr><td>Bacto Tryptische Sojabrühe</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granuliert</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>Schweres Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-Ketaminhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Xylazinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze 25 g 5/8 in&nbsp; 0,5 mm x 16 mm</td><td>PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>Katheter 22 G 0,9 mm x 25 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette - 0,5 mm Spitzen Curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Schere, Iris, 11 cm, gerade</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Nahtclips</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Naht thread</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor</td> cocktail <td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 Burker Einwegkammer</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk Lösung</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ Zytotrichter</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky Färbeset</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecyltrimethylammoniumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-EIA/RIA-Platte</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral gepuffertes Formalin</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hämatoxylin non Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosin plus alkoholische Lösung</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Schüttelinkubator</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präzisionswaage</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>Zytozentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Low Cost Heizkissen</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisationssonde</td><td>Ystral</td><td>2366925(klein)</td><td></td></tr><tr><td>Inverses optisches Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>Kamera (Mikroskop)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Drehbar Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

langzeitchronik<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; airway-infektion bei mäusen

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Ein Maus-Modell der chronischen Atemwegsinfektion ist ein Schlüsselfaktor bei zystischer Fibrose (CF)-Forschung, obwohl es eine Reihe von Bedenken in Bezug auf das Modell selbst. Frühen Phasen der Entzündung und Infektion wurden weitgehend mit Hilfe der Pseudomonas aeruginosa-Agar-Perlen Maus-Modell untersucht, während nur wenige Berichte über die langfristige chronische Infektion in vivo konzentriert. Die größte Herausforderung für langfristige chronische Infektion bleibt die geringe Keimbelastung von P. aeruginosa und der geringe Anteil der infizierten Mäuse Wochen nach der Herausforderung, die anzeigt, dass Bakterienzellen werden nach und nach durch den Host gelöscht. Dieser Beitrag stellt eine effiziente Methode zur Gewinnung von langfristigen chronischen Infektion bei Mäusen. Dieses Verfahren basiert auf der Einbettung des P. basierend aeruginosa klinischen Stämmen in den Agar-Perlen in vitro, gefolgt von Intratrachealbiopersistenztest in C57Bl/6NCrl Mäusen. Bilaterale Lungenentzündung ist mit meh verbundenBundes messbare Lese-outs einschließlich Gewichtsverlust, Sterblichkeit, chronische Infektion und entzündliche Reaktion. Die P. aeruginosa RP73 klinischen Stamm wurde über die PAO1 Referenzlaborstamm bevorzugt, da es zu einer vergleichsweise niedrigeren Sterblichkeit, mehr schwere Läsionen und höher chronischen Infektion. P. aeruginosa Besiedlung kann in der Lunge mehr als drei Monate andauern. Murine Lungenpathologie ähnelt dem von CF-Patienten mit fortgeschrittener chronischer Lungenerkrankung. Dieses Mausmodell meisten imitiert den Verlauf der Krankheit beim Menschen und kann sowohl für Studien über die Pathogenese und für die Bewertung neuer Therapien verwendet werden.

Wenn das Protokoll richtig gemacht wird, wird die P. aeruginosa Agar-Perlen zwischen 100-200 um zu messen und kann mit einem invertierten Lichtmikroskop durch Pipettieren ein kleines Volumen des Agar-Kügelchen-Suspension auf einen Objektträger beobachtet werden. Einzelnen bakteriellen Zellen sichtbar sind in den Agar-Perlen, wie im Detail in Fig. 1 gezeigt. Die Wahl von P. im Agar-Kügelchen Herstellung verwendet aeruginosa Stamm ist kritisch. <stro...

Wir beschreiben die Agar-Perlen Methode, um anhaltende langfristige chronische Pseudomonas aeruginosa-Infektion der Atemwege im Mausmodell zu etablieren.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine anhaltende, langfristige chronische Infektion der Atemwege mit Pseudomonas aerogen bei Mäusen zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der ausgewählte Pseudomonas-aerogen-Bakterienstamm kultiviert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Bakterien durch Mischen mit Agar und Mineralöl bei 50 Grad Celsius in kleine Agarperlen einzubetten und anschließend das Gemisch bei vier Grad Celsius unter langsamer, kontinuierlicher Rührung abzukühlen.Anschließend wird das Mineralöl durch mehrfaches Waschen mit PBS entfernt, und ein Aliquot der Agarperlen wird homogenisiert und auf Agarplatten ausgestrichen. Um den bakteriellen Gehalt zu bestimmen, erfolgt im letzten Schritt die Injektion einiger Mikroliter der Agarperlensuspension in die Trachea von Mäusen, um eine chronische Pseudomonas-aeruginosa-Lungeninfektion zu etablieren. Abschließend können Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit und Lungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion gewonnen und auf Agarplatten ausgestrichen werden, um den Prozentsatz der chronisch infizierten Mäuse sowie die bakterielle Belastung in den Atemwegen überlebender Tiere nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Agarperlen-Methode gegenüber bestehenden Verfahren liegt darin, dass sie eine stabile, langanhaltende chronische Infektion bei einem hohen Prozentsatz der Mäuse ermöglicht und somit eine konstante bakterielle Besiedlungsdichte über einen Zeitraum von bis zu einem Monat gewährleistet.Die AGA-Bit-Methoden schaffen in der Mauslunge die mikroaeroben Bedingungen, die ein Wachstum der Bakterien in Form von Mikrokolonien ermöglichen. Ähnlich wie das Wachstum im Schleim von Patienten mit zystischer Fibrose können diese Methoden Forschern dabei helfen, zentrale Fragen zur Pathogenese der zystischen Fibrose und anderer Atemwegserkrankungen zu beantworten sowie neuartige Therapien gegen chronische Pseudomonas-aeruginosa-Lungeninfektionen zu testen. Die Methoden können auch verwendet werden, um eine chronische Infektion mit anderen Pathogenen herbeizuführen, einschließlich Burkholderia-Xenovorans- oder Staphylococcus-aureus-Koinfektionen. Koexistenz- oder Wettbewerbsversuche mit verschiedenen Pathogenen sind ebenfalls möglich. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt entweder durch Pheno, einen Postdoktoranden, und Camil Riva, einen Doktoranden in meinem Labor. Drei Tage vor der Infektion der Maus impfen Sie einen vollständigen Abstrich von Pseudomonas aeruginosa aus der Kulturstammprobe bei minus 80 Grad Celsius auf eine Trypticase-Soja-Agarplatte und inkubieren diese über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag. Eine einzelne Kolonie in fünf Milliliter Trypson-Soja-Brühe ansäen und über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator mit 200 U/min inkubieren. Am folgenden Morgen ein kleines Aliquot der bakteriellen Übernachtkultur im Verhältnis 1 zu 50 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnen. Anschließend die optische Dichte bei 600 Nanometern messen.Als Nächstes verdünnen Sie die Übernachtkultur der Bakterien, indem Sie zwei OD der Bakteriensuspension in ein neues Reagenzglas geben, das 20 Milliliter frisches TSB enthält, und diese bei 37 Grad Celsius für etwa drei bis vier Stunden in einem schüttelnden Inkubator bei 200 U/min in die exponentielle Wachstumsphase inkubieren, bis insgesamt 10 bis 50 OD erreicht sind. Sobald Pseudomonas aeruginosa die exponentielle Wachstumsphase erreicht hat, sammeln Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 2.700 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen den Überstand. Danach.Suspendieren Sie das bakterielle Pellet in einem Milliliter steriler PBS und wirbeln Sie gründlich, um es vollständig zu resuspendieren. Anschließend mischen Sie ein Milliliter der bakteriellen Suspension mit neun Millilitern flüssigem TSA, das zuvor auf 50 Grad Celsius vorgeglichen wurde. Geben Sie diese Mischung zu dem auf 50 Grad Celsius vorgewärmten schweren Mineralöl hinzu.Rühren Sie unverzüglich sechs Minuten bei Raumtemperatur. Die Rührung muss einen sichtbaren Wirbel in dem Öl erzeugen. Danach kühlen Sie das Gemisch auf vier Grad Celsius und rühren 35 Minuten lang mit der minimalen Geschwindigkeit. Anschließend weitere 20 Minuten auf Eis ruhen lassen. Danach die Agarperlen in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführen und 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit 2.700 × g zentrifugieren.Entfernen Sie das Mineralöl genau und waschen Sie das Pellet der Agar-Beads mit sterilem PBS. Wiederholen Sie den Vorgang sechs Mal nach drei Waschschritten. Die Beads können nach der letzten Wäsche durch Schwerkraft anstelle der Zentrifugation pelletiert werden.Suspendieren Sie die Agarperlen aseptisch in 20 bis 30 Milliliter PBS und homogenisieren Sie 0,5 Milliliter der Perlen. Verdünnen Sie anschließend 100 Mikroliter der homogenisierten Perlen in 900 Mikroliter steriler PBS und führen Sie eine serielle Verdünnung der Perlen sechsmal bis zum Verdünnungsschritt 10 hoch minus 6 im Verhältnis 1 zu 10 durch.Anschießend serielle Verdünnungen auf TSA-Platten einschließlich unverdünnter Probe auftragen. Probe bis zu einer Verdünnung von 10 hoch minus 6 ausplattieren und die Platten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Den Durchmesser der Perlen mithilfe eines invertierten Lichtmikroskops in mehreren Gesichtsfeldern messen.Der Beaddurchmesser muss vor der Maus-Belastung zwischen 100 und 200 Mikrometern liegen. Zählen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten auf den TSA-Platten, um die Anzahl der CFU pro Milliliter in der Agar-Bead-Suspension zu bestimmen. Anschließend passen Sie das Volumen der Agar-Beads an, um eine optimale Konzentration von zwei bis vier mal 10 hoch 7 CFU pro Milliliter zu erreichen, was einem optimalen Inokulum von ein bis zwei mal 10 hoch 6 in 50 Mikrolitern entspricht.Legen Sie eine sechs bis acht Wochen alte männliche Maus, die zuvor mit Ketamin und Xylazin anästhesiert wurde, in Rückenlage auf eine Heizplatte und desinfizieren Sie ihr Fell mit 70 %igem Ethanol. Exponieren Sie die Luftröhre durch einen vertikalen Schnitt in der Haut. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Muskeln, die die Luftröhre bedecken, zu trennen.Entnehmen Sie anschließend bis zu 50 Mikroliter der Agarperlen-Suspension mit einer Ein-Milliliter-Spritze. Danach wird die Trachea mit einem Katheter intubiert und die Ein-Milliliter-Spritze mit der Agarperlen-Suspension an den Katheter angeschlossen. Drücken Sie vorsichtig den Spritzenkolben, um die Perlen in die Lunge einzubringen.Dann schließen Sie die Inzision mit Nahtclips. In diesem Schritt bringen Sie die euthanasierte Maus in Rückenlage und desinfizieren ihr Fell mit 70 % Ethanol.Exponieren Sie anschließend die Luftröhre und den Brustkorb durch einen vertikalen Schnitt in der Haut. Danach freilegen Sie die Lungen, indem Sie das Zwerchfell durchtrennen. Führen Sie mittels einer Pinzette einen Faden unter die Luftröhre ein und intubieren Sie die Luftröhre mit einem Katheter.Ziehen Sie dann die beiden Enden des Nahtfadens, um den Katheter an die Trachea zu befestigen, und nicht den Faden um die Trachea. Nehmen Sie nun ein Milliliter des Zellkulturmediums mit einer Ein-Milliliter-Spritze auf und befestigen Sie diese am Katheter. Drücken Sie den Kolben der Spritze, um die Lunge zu spülen, sammeln Sie die Flüssigkeit unmittelbar danach wieder auf und lagern Sie sie in einem 15-Milliliter-Röhrchen.Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal mit insgesamt drei Milliliter Medium und lagern Sie die Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit anschließend auf Eis zur Sammlung und Analyse der Lungen. Entfernen Sie die Lungen aus der Maus und spülen Sie sie mit steriler PBS ab.Dann die Lappen voneinander trennen. Geben Sie sie in ein Rundbodengefäß mit zwei Milliliter steriler PBS und lagern Sie sie auf Eis. Die Lungen aseptisch homogenisieren und seriell verdünnen.Verdünnen Sie das Homogenat im Verhältnis 1:10 in PBS. Anschließend werden serielle Verdünnungen, einschließlich der undiluierten Probe, auf TSA-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nehmen Sie die BAL-Flüssigkeit vom Eis und verdünnen Sie sie unter einem umgekehrten lichtoptischen Mikroskop mit Türk-Lösung im Verhältnis 1:2.Zählen Sie die Gesamtanzahl der Zellen in einer Burker-Zählkammer für die Differenzialzellzählung. Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit bei 330 ×g für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Danach verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter in Zellkulturmedium, das 10 % fetalen Kälberserum enthält. Platzieren Sie die Objektträger und Filter in den entsprechenden Schlitzen des Cytospins, wobei die Papierfilter zur Mitte hin ausgerichtet sind.Pipettieren Sie 150 Mikroliter jeder Probe in die entsprechenden Vertiefungen der Cytosin- und Zentrifusionsplatte, und zentrifugieren Sie diese mit 300 × g für fünf Minuten. Anschließend sollte ein Zellpräparat beobachtet werden; nach Färbung kann eine differenzielle Zellzählung am Mikroskop durchgeführt werden. Diese Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf einer chronischen Pseudomonas-aerogen-Infektion mit dem Referenzstamm PA O1 und RP 73.Klinischer Stamm für jeden Zeitpunkt. Die Histogramme zeigen den durch Bakteriämie verursachten prozentualen Anteil an Verstorbenen in Rot und Überlebenden in Grau bzw. den prozentualen Anteil der Tiere, die die Infektion eliminiert haben, in Weiß und jene, bei denen sich eine chronische Infektion etabliert hat, in Grün. Der klinische Stamm Pseudomonas aerogen RP 73 ist im Vergleich zum Labortyp PA oh one effizienter darin, eine chronische Infektion zu etablieren.Überlebende Mäuse wurden zu den angegebenen Zeitpunkten euthanasiert und die Lungen entnommen, homogenisiert und auf TSA-Platten kultiviert, um die bakterielle Belastung zu bestimmen. Die Wachstumskurven der Stämme P oh one und RP 73 in den Lungen von Mäusen zeigen, dass die Menge an Bakterien drei Tage nach der Infektion für P oh one im Vergleich zu RP 73 höher ist. Ab dem siebten Tag, wenn die chronische Infektion etabliert ist, stabilisiert sich die bakterielle Belastung für beide Stämme zwischen 10⁴ und 10⁵ KBE pro Lunge. Nach sieben Tagen chronischer Infektion mit dem klinischen Stamm RP 73 wurde die Rekrutierung entzündlicher Zellen in der Bronchoalveolären Lavage (BAL)-Flüssigkeit evaluiert.Die Anzahl der Gesamtleukozyten ist bei mit RP 73 infizierten Mäusen im Vergleich zu nicht infizierten Mäusen erheblich höher. Die am stärksten vertretenen Zellen sind Neutrophile, was auf eine beträchtliche Reaktion des angeborenen Immunsystems auf eine chronische Infektion hinweist. In dem Kasten unten zeigen Pfeile Neutrophile und eine Makrophage, wie sie auf einem Objektträger nach Zytospin zu sehen sind.Hier sind H&auml;matoxylin- und Eosin-F&auml;rbungen an histologischen Schnitten von Mauselungen sieben Tage nach einer chronischen Infektion mit rp. 73 klinischen St&auml;mmen dargestellt. Mit Pfeilen markierte Beads k&ouml;nnen im Bronchiallumen sowie mikrokolonien bakterieller Zellen beobachtet werden. In den infizierten Bereichen zeichnen sich die Bronchien und das pulmonale Parenchym durch eine massive Rekrutierung entz&uuml;ndlicher Zellen aus.Während die Atemwege einer nicht infizierten Maus frei von entzündlichen Zellen waren, sind der Durchmesser und die Endkonzentration der BES sehr wichtige Details. Um ein gutes Ergebnis zu erzielen, ist es wichtig zu beachten, dass die Größe durch die Abkühlgeschwindigkeit während der Abkühlphase beeinflusst wird und dass die anfängliche Menge an Bakterien die endgültige Verdünnung der Kügelchen beeinflussen kann. Außerdem wird durch die Auswahl eines geeigneten Pseudomonas-Stamms, der eine geringe Letalität bei Mäusen und einen hohen Prozentsatz an chronischer Infektion verursacht, die Anzahl verwendeter Mäuse minimiert.Nach der Infektion von Mäusen wird die Bakterienanzahl bestimmt. Zusätzlich können die entzündliche Reaktion in Form von Gesamt- und Differenzialzellzählung, die VIR-Spiegel in der Bronchialflüssigkeit, die Zytokanalyse, der Meloper oxidase-Assay sowie die histologische Analyse durchgeführt werden, um die Reaktion auf die bakterielle Infektion zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass beim Arbeiten mit opportunistischen Pathogenen wie Pseudomonas stets Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen, beispielsweise das Tragen von Handschuhen, das Handhaben der Bakterien in einem Sicherheitswerkbank, sowie die Anwendung steriler Techniken.Die Entwicklung geeigneter Tiermodelle ermöglichte die präklinische Prüfung neuartiger antibakterieller und entzündungshemmender Moleküle. Dies ist ein wichtiger Schritt für zukünftige therapeutische Maßnahmen bei Lungeninfektionen bei Patienten mit Mukoviszidose oder anderen Atemwegserkrankungen.

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: de Vries, C. R., et.al. Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die verzögerte Impfung von leuchtender Pseudomonas aeruginosa in eine Maus, die zwei vollwertige Dorsalhautwunden trägt, die von einem transparenten Filmverband abgedeckt sind. Dies erleichtert die Bildung von Biofilmen und die Entstehung chronischer Infektionen. Regelmäßige Biolumineszenzüberwachung ermöglicht die Quantifizierung der...

Entwicklung eines Mausmodells der chronischen Pseudomonas aeruginosa-Hautwundinfektion 

Wir haben ein Modell für Lungenverletzungen von Mäusen durch intratracheale Injektion des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa entwickelt. Dieses Modell ahmt Lungenschäden bei Lungenentzündungen nach und ist klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

Das Ziel dieses Protokolls ist es, automatisierte Methoden zur Quantifizierung chronischer Lungenpathologien in einem Mausmodell der COPD bereitzustellen. Das Protokoll umfasst die Exposition von Mäusen gegenüber Zigarettenrauch (CS), die Messung der Lungenfunktion, das Aufblasen der Lunge und die Verwendung morphometrischer Methoden zur Messung von Emphysem und Umbau kleiner Atemwege bei Mäusen.

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Verschiedene Verfahren wurden für die Modellierung von bakterieller Pneumonie bei Mäusen in der Literatur beschrieben. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive, kostengünstige, schnelle Methode zur Lungenentzündung durch Aspiration induzierenden (dh Inhalation) eines bakteriellen Inokulums in den Oropharynx pipettiert. Downstream Methoden zur Beurteilung der Lungen angeborenen Immunantwort sind auch detailliert.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Diese Studie beschreibt die erfolgreiche Generierung von ein neues Tiermodell für die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), indem man immer wieder Mäuse, um hohe Konzentrationen von Ozon.

Generation von eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung-Modell bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung

Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Wir beschreiben ein verzögertes Impfprotokoll zur Erzeugung chronischer Wundinfektionen bei immunkompetenten Mäusen.

Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion

Dieses Manuskript beschreibt die Etablierung eines infektiösen Modells der Lungenentzündung bei Mäusen und die entsprechende Charakterisierung der Verletzungsauflösung sowie Methoden zur Züchtung von Bakterien und zur intratrachealen Instillation. Ein neuartiger Ansatz mit Hilfe der hochdimensionalen Durchflusszytometrie zur Bewertung der Immunlandschaft wird ebenfalls beschrieben.

Experimentelles Modell zur Evaluierung des Abklingens von Lungenentzündungen

Mäuse sind im Allgemeinen resistent gegen Infektionen mit Mycobacterium abscessus, was die Entdeckung und Entwicklung dringend benötigter Antibiotika gegen Lungeninfektionen erschwert. Hier beschreiben wir eine Methode der Inokulumvorbereitung und intratrachealen Infektion, die bei immunkompetenten Mäusen nachweislich eine anhaltende Infektion auslöst.

Vorbereitung von in Agarperlen eingebettetem Mycobacterium abscessus zur intratrachealen Inokulation immunkompetenter Mäuse

Erfahren Sie die Agar-Beads-Methode zur Erzeugung chronischer Pseudomonas aeruginosa-Lungeninfektionen bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht stabile bakterielle Lasten über einen Monat für Infektionsforschung.

Langzeitchronik

Weitere Videos entdecken