Langzeitchronik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine anhaltende, langfristige chronische Infektion der Atemwege mit Pseudomonas aerogen bei Mäusen zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der ausgewählte Pseudomonas-aerogen-Bakterienstamm kultiviert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Bakterien durch Mischen mit Agar und Mineralöl bei 50 Grad Celsius in kleine Agarperlen einzubetten und anschließend das Gemisch bei vier Grad Celsius unter langsamer, kontinuierlicher Rührung abzukühlen.

Anschließend wird das Mineralöl durch mehrfaches Waschen mit PBS entfernt, und ein Aliquot der Agarperlen wird homogenisiert und auf Agarplatten ausgestrichen. Um den bakteriellen Gehalt zu bestimmen, erfolgt im letzten Schritt die Injektion einiger Mikroliter der Agarperlensuspension in die Trachea von Mäusen, um eine chronische Pseudomonas-aeruginosa-Lungeninfektion zu etablieren. Abschließend können Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit und Lungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion gewonnen und auf Agarplatten ausgestrichen werden, um den Prozentsatz der chronisch infizierten Mäuse sowie die bakterielle Belastung in den Atemwegen überlebender Tiere nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Agarperlen-Methode gegenüber bestehenden Verfahren liegt darin, dass sie eine stabile, langanhaltende chronische Infektion bei einem hohen Prozentsatz der Mäuse ermöglicht und somit eine konstante bakterielle Besiedlungsdichte über einen Zeitraum von bis zu einem Monat gewährleistet.

Die AGA-Bit-Methoden schaffen in der Mauslunge die mikroaeroben Bedingungen, die ein Wachstum der Bakterien in Form von Mikrokolonien ermöglichen. Ähnlich wie das Wachstum im Schleim von Patienten mit zystischer Fibrose können diese Methoden Forschern dabei helfen, zentrale Fragen zur Pathogenese der zystischen Fibrose und anderer Atemwegserkrankungen zu beantworten sowie neuartige Therapien gegen chronische Pseudomonas-aeruginosa-Lungeninfektionen zu testen. Die Methoden können auch verwendet werden, um eine chronische Infektion mit anderen Pathogenen herbeizuführen, einschließlich Burkholderia-Xenovorans- oder Staphylococcus-aureus-Koinfektionen. Koexistenz- oder Wettbewerbsversuche mit verschiedenen Pathogenen sind ebenfalls möglich. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt entweder durch Pheno, einen Postdoktoranden, und Camil Riva, einen Doktoranden in meinem Labor. Drei Tage vor der Infektion der Maus impfen Sie einen vollständigen Abstrich von Pseudomonas aeruginosa aus der Kulturstammprobe bei minus 80 Grad Celsius auf eine Trypticase-Soja-Agarplatte und inkubieren diese über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag. Eine einzelne Kolonie in fünf Milliliter Trypson-Soja-Brühe ansäen und über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator mit 200 U/min inkubieren. Am folgenden Morgen ein kleines Aliquot der bakteriellen Übernachtkultur im Verhältnis 1 zu 50 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnen. Anschließend die optische Dichte bei 600 Nanometern messen.

Als Nächstes verdünnen Sie die Übernachtkultur der Bakterien, indem Sie zwei OD der Bakteriensuspension in ein neues Reagenzglas geben, das 20 Milliliter frisches TSB enthält, und diese bei 37 Grad Celsius für etwa drei bis vier Stunden in einem schüttelnden Inkubator bei 200 U/min in die exponentielle Wachstumsphase inkubieren, bis insgesamt 10 bis 50 OD erreicht sind. Sobald Pseudomonas aeruginosa die exponentielle Wachstumsphase erreicht hat, sammeln Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 2.700 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen den Überstand. Danach.

Suspendieren Sie das bakterielle Pellet in einem Milliliter steriler PBS und wirbeln Sie gründlich, um es vollständig zu resuspendieren. Anschließend mischen Sie ein Milliliter der bakteriellen Suspension mit neun Millilitern flüssigem TSA, das zuvor auf 50 Grad Celsius vorgeglichen wurde. Geben Sie diese Mischung zu dem auf 50 Grad Celsius vorgewärmten schweren Mineralöl hinzu.

Rühren Sie unverzüglich sechs Minuten bei Raumtemperatur. Die Rührung muss einen sichtbaren Wirbel in dem Öl erzeugen. Danach kühlen Sie das Gemisch auf vier Grad Celsius und rühren 35 Minuten lang mit der minimalen Geschwindigkeit.

Anschließend weitere 20 Minuten auf Eis ruhen lassen. Danach die Agarperlen in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführen und 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit 2.700 × g zentrifugieren.

Entfernen Sie das Mineralöl genau und waschen Sie das Pellet der Agar-Beads mit sterilem PBS. Wiederholen Sie den Vorgang sechs Mal nach drei Waschschritten. Die Beads können nach der letzten Wäsche durch Schwerkraft anstelle der Zentrifugation pelletiert werden.

Suspendieren Sie die Agarperlen aseptisch in 20 bis 30 Milliliter PBS und homogenisieren Sie 0,5 Milliliter der Perlen. Verdünnen Sie anschließend 100 Mikroliter der homogenisierten Perlen in 900 Mikroliter steriler PBS und führen Sie eine serielle Verdünnung der Perlen sechsmal bis zum Verdünnungsschritt 10 hoch minus 6 im Verhältnis 1 zu 10 durch.

Anschießend serielle Verdünnungen auf TSA-Platten einschließlich unverdünnter Probe auftragen. Probe bis zu einer Verdünnung von 10 hoch minus 6 ausplattieren und die Platten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Den Durchmesser der Perlen mithilfe eines invertierten Lichtmikroskops in mehreren Gesichtsfeldern messen.

Der Beaddurchmesser muss vor der Maus-Belastung zwischen 100 und 200 Mikrometern liegen. Zählen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten auf den TSA-Platten, um die Anzahl der CFU pro Milliliter in der Agar-Bead-Suspension zu bestimmen. Anschließend passen Sie das Volumen der Agar-Beads an, um eine optimale Konzentration von zwei bis vier mal 10 hoch 7 CFU pro Milliliter zu erreichen, was einem optimalen Inokulum von ein bis zwei mal 10 hoch 6 in 50 Mikrolitern entspricht.

Legen Sie eine sechs bis acht Wochen alte männliche Maus, die zuvor mit Ketamin und Xylazin anästhesiert wurde, in Rückenlage auf eine Heizplatte und desinfizieren Sie ihr Fell mit 70 %igem Ethanol. Exponieren Sie die Luftröhre durch einen vertikalen Schnitt in der Haut. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Muskeln, die die Luftröhre bedecken, zu trennen.

Entnehmen Sie anschließend bis zu 50 Mikroliter der Agarperlen-Suspension mit einer Ein-Milliliter-Spritze. Danach wird die Trachea mit einem Katheter intubiert und die Ein-Milliliter-Spritze mit der Agarperlen-Suspension an den Katheter angeschlossen. Drücken Sie vorsichtig den Spritzenkolben, um die Perlen in die Lunge einzubringen.

Dann schließen Sie die Inzision mit Nahtclips. In diesem Schritt bringen Sie die euthanasierte Maus in Rückenlage und desinfizieren ihr Fell mit 70 % Ethanol.

Exponieren Sie anschließend die Luftröhre und den Brustkorb durch einen vertikalen Schnitt in der Haut. Danach freilegen Sie die Lungen, indem Sie das Zwerchfell durchtrennen. Führen Sie mittels einer Pinzette einen Faden unter die Luftröhre ein und intubieren Sie die Luftröhre mit einem Katheter.

Ziehen Sie dann die beiden Enden des Nahtfadens, um den Katheter an die Trachea zu befestigen, und nicht den Faden um die Trachea. Nehmen Sie nun ein Milliliter des Zellkulturmediums mit einer Ein-Milliliter-Spritze auf und befestigen Sie diese am Katheter. Drücken Sie den Kolben der Spritze, um die Lunge zu spülen, sammeln Sie die Flüssigkeit unmittelbar danach wieder auf und lagern Sie sie in einem 15-Milliliter-Röhrchen.

Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal mit insgesamt drei Milliliter Medium und lagern Sie die Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit anschließend auf Eis zur Sammlung und Analyse der Lungen. Entfernen Sie die Lungen aus der Maus und spülen Sie sie mit steriler PBS ab.

Dann die Lappen voneinander trennen. Geben Sie sie in ein Rundbodengefäß mit zwei Milliliter steriler PBS und lagern Sie sie auf Eis. Die Lungen aseptisch homogenisieren und seriell verdünnen.

Verdünnen Sie das Homogenat im Verhältnis 1:10 in PBS. Anschließend werden serielle Verdünnungen, einschließlich der undiluierten Probe, auf TSA-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nehmen Sie die BAL-Flüssigkeit vom Eis und verdünnen Sie sie unter einem umgekehrten lichtoptischen Mikroskop mit Türk-Lösung im Verhältnis 1:2.

Zählen Sie die Gesamtanzahl der Zellen in einer Burker-Zählkammer für die Differenzialzellzählung. Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit bei 330 ×g für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Danach verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter in Zellkulturmedium, das 10 % fetalen Kälberserum enthält. Platzieren Sie die Objektträger und Filter in den entsprechenden Schlitzen des Cytospins, wobei die Papierfilter zur Mitte hin ausgerichtet sind.

Pipettieren Sie 150 Mikroliter jeder Probe in die entsprechenden Vertiefungen der Cytosin- und Zentrifusionsplatte, und zentrifugieren Sie diese mit 300 × g für fünf Minuten. Anschließend sollte ein Zellpräparat beobachtet werden; nach Färbung kann eine differenzielle Zellzählung am Mikroskop durchgeführt werden. Diese Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf einer chronischen Pseudomonas-aerogen-Infektion mit dem Referenzstamm PA O1 und RP 73.

Klinischer Stamm für jeden Zeitpunkt. Die Histogramme zeigen den durch Bakteriämie verursachten prozentualen Anteil an Verstorbenen in Rot und Überlebenden in Grau bzw. den prozentualen Anteil der Tiere, die die Infektion eliminiert haben, in Weiß und jene, bei denen sich eine chronische Infektion etabliert hat, in Grün. Der klinische Stamm Pseudomonas aerogen RP 73 ist im Vergleich zum Labortyp PA oh one effizienter darin, eine chronische Infektion zu etablieren.

Überlebende Mäuse wurden zu den angegebenen Zeitpunkten euthanasiert und die Lungen entnommen, homogenisiert und auf TSA-Platten kultiviert, um die bakterielle Belastung zu bestimmen. Die Wachstumskurven der Stämme P oh one und RP 73 in den Lungen von Mäusen zeigen, dass die Menge an Bakterien drei Tage nach der Infektion für P oh one im Vergleich zu RP 73 höher ist. Ab dem siebten Tag, wenn die chronische Infektion etabliert ist, stabilisiert sich die bakterielle Belastung für beide Stämme zwischen 10⁴ und 10⁵ KBE pro Lunge. Nach sieben Tagen chronischer Infektion mit dem klinischen Stamm RP 73 wurde die Rekrutierung entzündlicher Zellen in der Bronchoalveolären Lavage (BAL)-Flüssigkeit evaluiert.

Die Anzahl der Gesamtleukozyten ist bei mit RP 73 infizierten Mäusen im Vergleich zu nicht infizierten Mäusen erheblich höher. Die am stärksten vertretenen Zellen sind Neutrophile, was auf eine beträchtliche Reaktion des angeborenen Immunsystems auf eine chronische Infektion hinweist. In dem Kasten unten zeigen Pfeile Neutrophile und eine Makrophage, wie sie auf einem Objektträger nach Zytospin zu sehen sind.

Hier sind Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen an histologischen Schnitten von Mauselungen sieben Tage nach einer chronischen Infektion mit rp. 73 klinischen Stämmen dargestellt. Mit Pfeilen markierte Beads können im Bronchiallumen sowie mikrokolonien bakterieller Zellen beobachtet werden. In den infizierten Bereichen zeichnen sich die Bronchien und das pulmonale Parenchym durch eine massive Rekrutierung entzündlicher Zellen aus.

Während die Atemwege einer nicht infizierten Maus frei von entzündlichen Zellen waren, sind der Durchmesser und die Endkonzentration der BES sehr wichtige Details. Um ein gutes Ergebnis zu erzielen, ist es wichtig zu beachten, dass die Größe durch die Abkühlgeschwindigkeit während der Abkühlphase beeinflusst wird und dass die anfängliche Menge an Bakterien die endgültige Verdünnung der Kügelchen beeinflussen kann. Außerdem wird durch die Auswahl eines geeigneten Pseudomonas-Stamms, der eine geringe Letalität bei Mäusen und einen hohen Prozentsatz an chronischer Infektion verursacht, die Anzahl verwendeter Mäuse minimiert.

Nach der Infektion von Mäusen wird die Bakterienanzahl bestimmt. Zusätzlich können die entzündliche Reaktion in Form von Gesamt- und Differenzialzellzählung, die VIR-Spiegel in der Bronchialflüssigkeit, die Zytokanalyse, der Meloper oxidase-Assay sowie die histologische Analyse durchgeführt werden, um die Reaktion auf die bakterielle Infektion zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass beim Arbeiten mit opportunistischen Pathogenen wie Pseudomonas stets Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen, beispielsweise das Tragen von Handschuhen, das Handhaben der Bakterien in einem Sicherheitswerkbank, sowie die Anwendung steriler Techniken.

Die Entwicklung geeigneter Tiermodelle ermöglichte die präklinische Prüfung neuartiger antibakterieller und entzündungshemmender Moleküle. Dies ist ein wichtiger Schritt für zukünftige therapeutische Maßnahmen bei Lungeninfektionen bei Patienten mit Mukoviszidose oder anderen Atemwegserkrankungen.