Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, reine Kulturen von endothelialen Zellen aus embryonalen Viergehirnen zu gewinnen, um die zerebrale Angiogenese und neurovaskuläre Wechselwirkungen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Rinde entfernt und das Cephalon aus embryonalen Gehirnen isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, durch Dissoziation, Filtration und Verdauung des gewonnenen Gewebes eine Einzelzell-Suspension herzustellen.

Der dritte Schritt besteht darin, die Zellen magnetisch mit CD31-Mikroperlen zu markieren. Die abschließenden Schritte sind die Reinigung der mit CD31 markierten Zellen durch magnetische Trennung und anschließendes Kultivieren. Letztendlich werden reine Populationen paraventrikulärer endothelialer Zellen für weitere Untersuchungen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Angiogenese-Assays erzeugt.

Diese Methode wird Studien zugutekommen, die sich auf zelluläre und molekulare Mechanismen konzentrieren. Für Gehirnansis kann sie als Werkzeug zur Aufklärung von präventrikulären endothelialen Zellinteraktionen und der Kommunikation mit neuronalen Zelltypen dienen. Außerdem bietet sie ein erhebliches Potenzial für therapeutische Ansis-Missionen.

Die Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um einige der technischen Schwierigkeiten zu beseitigen, die mit der Isolierung und Kultivierung reiner Populationen von endothelialen Zellen aus embryonalen Gehirnen verbunden sind. Legen Sie für dieses Protokoll die Köpfe von E15-Nachkommen aus CD1-Mäusen in eiskaltem PBS unter einem Stereomikroskop bereit. Entfernen Sie die Gehirne mit feiner Mikroschere und feinen Pinzetten.

Eine gute Dissektion ist entscheidend und erfordert Übung sowie einwandfreie Instrumente. Verwenden Sie danach die Pinzette, um das Gehirn festzuhalten, und die Feinschere, um die Häutchenmembran abzulösen. Dieser Schritt ist der anspruchsvollste des gesamten Verfahrens, doch die erforderlichen Fähigkeiten werden sich mit der Übung entwickeln.

Entfernen Sie anschließend das Mesencephalon und das Metacephalon. Isolieren Sie das Cephalon. Überführen Sie es dann frei von der Häutemembran in eine 35 Millimeter große Kulturschale mit zwei Milliliter PBS auf Eis.

Sammeln Sie alle Krallen in einer einzigen Schale. Zerkleinern Sie die Krallen mit einem Skalpell in Fragmente von ein bis zwei Millimetern. Sammeln Sie das Gewebe in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das zwei Milliliter komplettes DMEM enthält.

Lösen Sie das Gewebe vorsichtig aber gründlich durch Pipettieren mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf, bis die Klumpen verschwunden sind und eine milchige Suspension erhalten wird. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 800 bis 1000 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie bei Raumtemperatur vorsichtig den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Sie den Pellet.

Suspendieren Sie das Gaumendach in DMEM mit DS eins. Dissociieren Sie die Zellen anschließend erneut durch vorsichtiges Schütteln und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Suspendieren Sie dann das Pellet in erwärmtem vollständigem DMEM.

Filtern Sie die suspendierten Zellen durch ein 70-Mikron-Nylon-Mesh und sammeln Sie die auf dem Mesh zurückgehaltenen Zellanteile, die anschließend in zwei Milliliter DMEM mit Kollagenase und Dis Bays weiterverdaut werden. Warten Sie einige Minuten und waschen Sie dann das Gewebe. Drei bis zur Verwendung durch Zentrifugation und Resuspendierung des Pellets in DMEM mit DS einem Pool, die gewaschene Sammlung mit dem auf Eis gehaltenen Filtrat.

Waschen Sie die Zellen anschließend mit vollständigem DMEM unter Verwendung der Zentrifugation und Resuspension. Bestimmen Sie nun die Zellzahl mit einem Hämozytometer und fahren Sie mit der magnetischen Markierung fort. Die Volumina in diesem Protokoll sind geeignet für bis zu 10 Millionen Zellen. Für höhere Zellzahlen einfach proportional vergrößern.

Zentrifugieren Sie die Zellsuspension zunächst bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, aspirieren Sie das Überstandsvolumen vollständig ab und geben Sie 90 Mikroliter gekühlten Reinigungspuffer zum Zellpellet hinzu, gefolgt von 10 Mikrolitern CD31-konjugierten Mikroperlen. Verrühren Sie die Zellen gründlich mit einer 200-Mikroliter-Pipette und inkubieren Sie die Suspension 15 Minuten lang im Kühlschrank, jedoch nicht länger, damit die Markierung spezifisch bleibt. Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter gekühlten Reinigungspuffer hinzufügen und bei 300 G für 10 Minuten zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern gekühltem Reinigungspuffer. Bringen Sie nun eine MS-Säule in das Magnetfeld des Max-Separators ein. Spülen Sie danach die Säule mit 500 Mikrolitern Reinigungspuffer bei Raumtemperatur.

Tragen Sie dann die Zellsuspension auf die Säule auf. Diese hält bis zu 20 Millionen Zellen. Sammeln Sie den Durchfluss, der die unmarkierten Zellen enthält, und entsorgen Sie ihn.

Spülen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikrolitern Puffer zur Reinigung. Stellen Sie immer sicher, dass das Säulengefäß leer ist, bevor Sie weitere Pufferportionen zur Reinigung hinzufügen. Entfernen Sie die Säule nun vom Max-Separator und stellen Sie sie auf ein 15-Milliliter-Gefäß.

Geben Sie ein Milliliter Puffer für die Reinigung auf die Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen unverzüglich aus, indem Sie den beigefügten Kolben fest in die Säulenschicht hineindrücken. Die ausgespülten Zellen auf eine 35-Millimeter-Kulturschale, die vorab mit Kollagen Typ I beschichtet wurde.

Züchten Sie die Zellen nun mit ECCM in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Erneuern Sie das Medium alle vier Tage. Beobachten Sie die Zellen täglich im Kulturgefäß unter dem Mikroskop.

Die phänotypische Charakterisierung periventrikulärer endothelialer Zellen oder PVE-CS-Veränderungen von Tag eins bis Tag 12, sichtbar durch Phasenkontrast-Lichtmikroskopie. Die Zellen, die sich am ersten Tag an der Petrischale anheften, zeigen zwischen fünf und acht Tagen eine für die Zellteilung charakteristische Morphologie. Die PVE-CS wechseln von einer gepflasterten zu einer spindelförmigen Morphologie, die typisch für endotheliale Zellen ist und ihrem Zustand in vivo ähnlicher ist.

Bis zum Tag 12 erreicht die PVEC-Kultur Vollkonfluenz. Die p vs können nach der Unterkultur leicht zur Vergrößerung der Kolonie weiterkultiviert werden.

Die Reinheit der Endothelzellkulturen wurde anhand der folgenden Endothelzellmarker zu 100 % bestimmt: ISO-Selektin vor von-Willebrand-Faktor, CD31, PE-CAM-1 und VE-Cadherin. Hochvergrößerte Aufnahmen von PV-Zellen, die aus CD1-Embryonen sowie aus Tie2-GFP-Embryonen gewonnen wurden, deren Endothelzellen GFP exprimierten, wurden mit ISO-Lektin markiert. Diese zeigten die typischen kieselsteinartigen und spindelförmigen Morphologien sowie polygonale Formen mit schlanken Fortsätzen in einigen kollagenbeschichteten Kulturgefäßen. In Abwesenheit von Matrigel bildeten die PV-Zellen Gittermuster aus, die dem charakteristischen Merkmal des in-vivo-periventrikulären vaskulären Netzwerks ähneln.

Dies spiegelt das hohe angiogene Potenzial der pve. Cs wider. Ein Angiogenese-Assay wurde durchgeführt, bei dem 20.000 PVE CS in mit Matrix-Gel beschichtete Kulturschalen gegeben wurden. Diese PV Cs zeigten innerhalb von 18 Stunden eine starke Röhrenbildung.

Langzeitstudien an pve-CS-Zellen, einschließlich Migration, Motilität, Morphologie, Zellfunktionsassays sowie In-vivo-Experimente, sind möglich, indem PV-Zellen, die aus CD-eins-Embryonen isoliert wurden, mit Qdot-Nanokristallen markiert werden. Diese Nanokristalle liefern eine intensive, stabile Fluoreszenz in das Zytoplasma lebender Zellen.

Pve EECS können mit Zelltracern wie Cell Light Plasmamembran-RFP und MAM 2.0 für eine klare Visualisierung der Zellmorphologie in Live-Cell-Imaging-Experimenten transfiziert werden. Pve CS wurden in mehreren Medien kultiviert, und die Zellmorphologie wurde mittels Phasenkontrastmikroskopie und ISO-Selektin vor der Färbung verglichen.

Während PV-ZS, die in ECCM gezüchtet wurden, eine spindelförmige Morphologie aufwiesen und bis zum Tag 12 konfluent waren, zeigten pve-ZS, die in Wachstumsmedium für endotheliale Rattenhirnzellen gezüchtet wurden, eine stark gestreckte Morphologie und waren erst bis zum Tag 20 konfluent. Dagegen wiesen PV-ZS, die in D-M-E-M-F 12. Medium kultiviert wurden, lediglich eine flache und polygonale Morphologie ohne Spindelbildung auf, wuchsen sehr schnell und waren bereits am vierten Tag konfluent.

PVE-Zellen wurden bis zu drei Passagen in ECCM kultiviert, ohne Phänotyp und Funktion zu verlieren. Daher ist ECCM das bevorzugte Medium für die Kultur von PVECs. Wenn man es einmal beherrscht, kann dieser Schritt innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden, sofern er ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Die Kultur periventrikulärer Endothelzellen zusammen mit neuronalen Vorläuferzellen dürfte die Neurogenese und neuronale Migration vermutlich weitaus stärker anregen als Endothelzellen aus dem adulten Gehirn oder anderen Quellen. Sie könnten daher wertvoll sein, um die Wiederherstellung neurologischer Funktionen in zahlreichen unterschiedlichen Szenarien zu unterstützen.