VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte

Das übergeordnete Ziel ist es, die Methodik zu demonstrieren, die virusinduziertes Gen-Silencing zur Identifizierung von Genen verwendet, die an der Resistenz von Nichtwirten beteiligt sind, um VIGs der endogenen Pflanze zu erreichen. Zielgen inokulieren nicotiana hamama Pflanzen mit Tabakrassel Virus Feigen Konstrukt, die ein Fragment des Zielgens tragen, bereiten und impfen die Nicht-Wirte Krankheitserregerkulturen, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, auf das Gen stummgeschaltete Pflanzenblätter. Beurteilen Sie als Nächstes die grün fluoreszierenden Kolonien von Nichtwirtserregern unter UV-Licht im Dunkeln.

Um genstummgeschaltete Pflanzen zu identifizieren, die die Resistenz gegen Nichtwirte beeinträchtigen, identifizieren Sie das Zielgen durch Sequenzierung des Inserts im Virusvektor. Insgesamt ermöglicht diese Methodik des VIX-vermittelten genetischen Forward-Screenings den Forschern, Gene leicht zu identifizieren, die an der Resistenz von Pflanzen gegen bakterielle Krankheitserreger beteiligt sind. In kurzer Zeit erkannten wir, dass die Bedeutung der Kombination von virusinduziertem Gen-Silencing die Vorwärtsgenetik mit GFP-UV-exprimierenden Krankheitserregern vermittelt, um die für die Nicht-ST-Resistenz verantwortlichen Gene zu identifizieren.

Als wir zuvor ein langwieriges genetisches Vorwärtsscreening durchführten, indem wir auf hyperreaktionsinduzierten Zelltod und krankheitsinduzierten Zelltod untersuchten. Also lassen nicotiana Ben Samen auf einer erdlosen Blumenerde die Samen in einer Wachstumskammer keimen. Nach drei Wochen verpflanzen Sie die Sämlinge in einzelne Töpfe und lassen sie mindestens zwei bis drei Tage im Gewächshaus wachsen, bevor das Tabakrasselvirus einsetzt.

Vektorinokulation mit Feigen taut die gefrorenen Stängel des Agrobakteriums, die die cDNA-Klone enthalten, allmählich auf. Intv zwei Vektoren impfen unter sterilen Bedingungen die einzelnen Agrobakterienkulturen auf Luria. Berti Agro Platten inkubieren die Platten bei 28 Grad Celsius für bis zu zwei Tage.

Züchten Sie vier replizierte Kolonien für jeden Klon, so dass ein adäquates Agrobacterium-Inokulum für die Inokulation von zwei Pflanzen zur Verfügung steht. TRV one in Luria berti flüssiges Medium impfen. Ernten Sie die über Nacht gezüchteten Kulturen durch Zentrifugation, resuspendieren Sie die Bakterien in der Inokulation, puffern Sie sie und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei 50 U/min.

Nach der Ernte der Zellen durch Zentrifugation, messen Sie die optische Dichte und Reanimation, suspendieren Sie die Bakterienpellets in fünf Millimolaren MES-Puffer mit einem pH-Wert von 5,5. Als nächstes inokulieren Sie die T RV eine Bakterienkultur mit OD 600 von 0,3 in die Axi-Seite von drei bis vier Nicotiana Hamama-Blättern mit einer nadellosen Spritze an der Stelle der T RV one Inokulation. Die Blätter mit dem Inokulum der jeweiligen T RV zwei Völker mit einem Zahnstocher zwei Wochen lang einstechen. Halten Sie die Pflanzen bei niedrigen Temperaturen und mit angemessener Düngung, da ein kräftiges Wachstum für ein effizientes Gen-Silencing bei Schweinen wichtig ist.

Als Beispiel wird in diesem Experiment die Pseudomonas senge PV Tomate T one verwendet. Krankheitserreger sollten ein Plasmid tragen, das G-F-P-U-V exprimieren kann, wachsen die PGE-Stämme in Königen flüssig sein, Medium ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter. Rifampicin 50 Mikrogramm pro Milliliter kann Mycin bei 28 Grad Celsius für 12 Stunden behandeln.

Ernten Sie die Bakterienkulturen durch Zentrifugation und bestätigen Sie dann das Vorhandensein von grüner Fluoreszenz mit einer langwelligen UV-Lampe im Dunkeln. Nach zwei Wäschen in sterilem Wasser reanimieren, die Zellen auf die gewünschte Konzentration an sterilem Wasser suspendieren und OD 600 einstellen. Anschließend impfen Sie die jeweiligen Erreger auf die axiale Seite des Ziels.

Genstummgeschaltete Blätter Kreise von etwa 1,5 Zentimeter Durchmesser, falls erforderlich. Gleichzeitiges Testen mehrerer Nicht-Wirts-Krankheitserreger auf ihr Wachstum im Zielgen, stummgeschaltete Pflanzen enthalten auch eine Vektorkontrolle zur Betrachtung. Implantieren Sie ein Bakterienwachstum zwischen zwei und fünf Tagen.

Setzen Sie die inokulierten Blätter im Dunkeln einem langwelligen UV-Licht aus. Achten Sie darauf, Haut- und Augenschutz zu tragen. Überwachen Sie die Bakterienkolonien als grün fluoreszierende Flecken auf der axialen Seite des Blattes im Hintergrund der von der Blattoberfläche emittierten roten Fluoreszenz.

Überprüfen Sie die grüne Fluoreszenz, die vom Wirtserreger emittiert wird, der als Positivkontrolle fungiert. Beobachten Sie das Wachstum des Erregers täglich von zwei bis fünf Tagen nach der Inokulation. Erstellen Sie eine Liste der Klone, die durch das Stummschalten zum Wachstum eines oder mehrerer Krankheitserreger geführt haben, die keine Wirte sind.

So entfernen Sie die falsch positiven Ergebnisse aus dem ersten Bildschirm. Wiederholen Sie die VIGs für ausgewählte Klone und testen Sie erneut die Reaktion von genstummgeschalteten Pflanzen auf nicht kostenlose Krankheitserreger. Verwenden Sie die Kolonie-PCR auf dem ausgewählten Klon, um das Insert mit dem A TTB und einem TB mit zwei Primern im T RV mit zwei Vektoren oder Primern zu amplifizieren, die die Klonierungsstelle ausblenden.

Führen Sie das PCR-Produkt auf einem aros Gel aus und überprüfen Sie die Amplifikation der einzelnen Bande. Sequenzieren Sie dann das pflanzliche Gen-Insert im T RV Zwei-Vektor entweder mit den A TTB-Primern oder mit Primern, die die Klonierungsstelle flankieren. Führen Sie die Explosion anhand der Sequenz durch und identifizieren Sie die Gendetails.

Ein verallgemeinertes Protokoll zum Stummschalten einer großen Anzahl von Genen unter Verwendung von Feigen auf Basis des Tabakrasselvirus in Nikotiana. Hamana ist in diesem Flussdiagramm dargestellt. Einige der genstummgeschalteten Pflanzen zeigten verschiedene phänotypische Veränderungen, darunter verkümmertes Wachstum, Vergilbung und Photobleich-Phänotypen.

Diese Daten zeigen die grüne Fluoreszenz von Krankheitserregern, die vor der Inokulation der Pflanzen im Dunkeln UV-Licht ausgesetzt waren, und ihre Wachstumsimplantate drei Tage nach der Inokulation des gleichen Blattes, das unter weißem Licht ausgesetzt war, als Kontrolle. Dieses Experiment verfolgt das Wachstum von G-F-P-U-V-exprimierenden Bakterien in Plana. Drei Nicht-Gastgeber.

Krankheitserreger wurden verwendet, um den Prozess der Identifizierung der genstummgeschalteten Pflanze, die anfällig für Nichtwirtskrankheitserreger ist, in den Wildtyp-Nicht-Nicotiana-Hamama-Pflanzen mit Immunität zu demonstrieren. Diese Krankheitserreger wuchsen nicht. Mindestens zwei Nichtwirtserreger wuchsen jedoch auf NB sgt.Ein

Gen brachte die Blätter zum Schweigen. Quantitative Daten zum Bakterienwachstum zeigen den Prozess der Identifizierung von genstummgeschalteten Pflanzen, die für Nicht-ST-Resistenz beeinträchtigt sind. Mit diesem durch Feigen vermittelten Vorwärtsgenetik-Ansatz haben wir über einen Zeitraum von etwa eineinhalb Jahren etwa 5.000 Gene in Nicotiana hamana zum Schweigen gebracht und Pflanzen identifiziert, die die Nicht-ST-Resistenz beeinträchtigen.

Als Beispiel wird hier das Wachstum von Nichtwirtskrankheitserregern in zwei genstummgeschalteten Pflanzen gezeigt, die in diesem Screening identifiziert wurden. Wir hoffen, vermittelt zu haben, wie man virusinduziertes Gen-Silencing für Hunderte von Genen durchführt und dann die zum Schweigen gebrachten Pflanzen bewertet, indem wir das Wachstum von unkostenfreien Krankheitserregern in Plana beobachten, um nicht-kostenbezogene Resistenzen zu sezieren. Durch die Verwendung dieses virusinduzierten Gens und des Silencing-vermittelten Protokolls kann man in der Lage sein, Hunderte von Genen in einem Zeitraum von etwa zwei bis drei Wochen zum Schweigen zu bringen und dann das Wachstum von nicht pferdepathogenen Krankheitserregern, die mit GFP UV markiert wurden, in etwa zwei bis drei Stunden pro Tag zu beurteilen, und zwar über einen Zeitraum von etwa zwei bis fünf Tagen.