Name: Die Xenopus Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Lernen Sie die Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik mit Fluorometrie zur Aufzeichnung von Ionenströmen in Xenopus-Eizellen. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Untersuchungen mit hoher zeitlicher Auflösung.

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Alle Mitglieder der Washington University in St. Louis Herz Molecular Engineering Lab. Ein Burroughs Willkommen Fund Career Award in der Scientific Schnittstelle - 1010299 (JS).

<ol><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li>
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<li>Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+the+activation+and+inactivation+kinetics+of+HERG+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiolt%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).</li>
<li>Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+active+calcium+channel+beta%281b%29+-subunit+by+size-exclusion+chromatography+and+its+role+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function.</a> J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).</li>
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<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
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<li>Susan, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCha%2C+A+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 296, Academic Press. 566-578 (1998).</li>
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<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
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<li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na%2B%2Fglucose+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li>
<li>Pantazis, A., Olcese, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPantazis%2C+A+%22Cut-Open+Oocyte+Voltage-Clamp+Technique.+In%3A+Roberts+G.+%28Ed.%29+Encyclopedia+of+Biophysics%3A+SpringerReference%22">Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference</a>. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die aufgeschnittenen Eizelle Vaseline Spaltspannung Clamp-Technik ermöglicht eine schnelle Auflösung der Daten, geringes Rauschen, mehr Kontrolle über interne und externe Lösung Lösung Zusammensetzung und stabile Aufnahmen über längere Protokolle 19. Diese Vorteile setzen diese Technik abgesehen von der Standard-Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-und Patch-Clamp-Technik. Obwohl spezielle Ausrüstung erforderlich ist, und das Protokoll ist relativ schwierig, treten sehr wenige Probleme, sobald das System optimiert w...

Specialized Spannungsklemmtechniken erlauben die Aufzeichnung von Ionenströmen bei kontrollierten Membranpotentialen. Weit verbreitet Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) und Patch-Clamp-Techniken liefern zuverlässige Informationen über die elektrophysiologischen Eigenschaften vieler Ionenkanäle. Jedoch haben beide Verfahren Nachteile, die den Erwerb von zuverlässigen Daten für schnellen spannungsabhängigen Natriumkanäle und andere schnell aktivierenden Kanäle in den Membranen, wie sie von Xenopus Oozyten zu verhindern. Die Bezanilla und Stefani Laboratorien entwickelt folglich die aufgeschnittenen Spalt Vaseline Voltage-Clamp Technik (COVG) für Oozyten 2. Die Technik wurde häufig angewendet, um aufzuzeichnen, Na +, K + und Ca 2 +-Kanäle 3-8. COVG während der Aufzeichnung wird ein heterologes Protein-exprimierenden Oozyten Membran in drei Bereiche unterteilt. Die Ionenstrom-Daten von dem oberen Bereich der Eizelle als die aufgezeichneteBad um den oberen Bereich auf einen Befehl Potential, das leicht und schnell geändert werden kann, eingespannt ist. Der mittlere Bereich schützt gegen Leckströme, indem sie auf dem gleichen Potential wie der Kopfbereich 9 eingespannt. Der Bodenbereich ist, wo Eizelle Öffnung (aufgeschnittenem) durch die Verwendung eines Saponin-Lösung oder einer Kanüle erfolgt. Chemische oder manuelles Öffnen der Membran im Bodenbereich ermöglicht die Steuerung der internen Potential, das an Masse geklemmt ist, und damit ist das Zellinnere angrenzend an die untere Kammer Lösung. Perfusion von Lösungen in die untere Kammer können die Eigenschaften der inneren Umgebung anzupassen, während Lösungsaustausch in der oberen Kammer verändert die äußere Umgebung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Eizellen Cut-Voltage-Clamp Öffnen Bad Setup-Übersicht. (A) TopSicht auf den drei Bädern voneinander getrennt. Die Abmessungen der Kammern für COVG sind in der Figur angezeigt. (B) Seitenansicht des Bäder-Setup in Testposition. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . Die Vorteile der Technik COVG sind niedrige Stromrauschen (1 nA bei 3 kHz), Steuerung der Ionenzusammensetzung der externen Medien, die Fähigkeit, die internen Medien, schnelle Zeitauflösung (20-100 Mikrosekunden-Zeitkonstante des Zerfalls des modulieren Kapazität transient), und stabile Aufnahmen für mehrere Stunden 9. Die Nachteile sind, dass es erfordert spezielle Ausrüstung und es ist schwieriger durchzuführen, verglichen mit zwei Elektroden-Spannungsklemm (TEVC) 10. Während die COVG Ansatz erfordert hoch spezialisierte Ausrüstung und komplizierte Verfahrenselemente, ist es für den Erwerb von wertvollen erlauben könnenkönnen elektrophysiologische Daten. Diese Daten, wie Anschnittströme mit schneller Kinetik und Schwanzströme 4, ohne einige der Fragen, mit anderen Klemmspannung Protokolle einschließlich Kanal heruntergekommenen verbunden aufgezeichnet werden. Kleinere Änderungen an der COVG Setup kann für den Einsatz von Temperaturregler und Spannungsklemme Fluorometrie (VCF) zu ermöglichen. Die Einbeziehung der Voltage-Clamp-Fluorometrie Elemente innerhalb der COVG Montage kann die Datenausgabe zu erhöhen durch die Übertragung die Möglichkeit, Protein Konformationsänderungen zu überwachen, während gleichzeitig Aufnahme von Strom 13.11.

<table><tbody><tr><td>Externe Lösung</td><td>Marke</td><td>Katalognummer</td> <td>[Endgültig], Gewicht oder Volumen</td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glukamin (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>MES Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>Calciumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabel (pH bis 7,4)</td></tr><tr><td>Interne Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glukamin (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Forschung Produkte International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabel (pH bis 7,4)</td></tr><tr><td>Depolarisationslösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>110mM</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>1,5mM</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Caisson</td><td>C021</td><td>0,8 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Pipettenlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr><td>Saponin Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0,125 g</td></tr><tr><td>Intern Lösung</td><td>Siehe oben</td><td></td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Agarbrückenlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-Glucamin (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>100 ml 1 M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>H75030</td><td>1,2 g</td></tr><tr><td>MES-Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabel (pH bis 7,4)</td></tr><tr><td>Granulierter Agar</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>A20250</td><td>3%</td></tr><tr><td>NMDG Lagerlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMDG, HEPES, MES Hydratlösung</td><td>siehe oben</td><td></td><td>40ml</td></tr><tr><td>Wasser</td><td></td><td></td><td>60ml</td></tr><tr><td>Name des Materials / der Ausrüstung</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>Hochleistungs-Eizellklemme</td><td>Dagan</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem</td><td>Axon CNS</td><td>&nbsp; Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>Rack-Netzfilter</td><td>APC &nbsp;</td><td>G5</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler für Heiz-/Kühlbad</td><td>Dagan</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC Vibration Control TableTop Platform</td><td>TMC</td><td>64 SERIES</td><td></td></tr><tr><td>TMC Vibration Control Air Table</td><td>TMC</td><td><a name="REICHWEITE! C10">20 Serie&nbsp; </A></td><td></td></tr><tr><td>V1/I Elektroden-Datensammler</td><td>Dagan</td><td>Teil von CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10L Mikromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>Bad/Schutz (I/V) Kopftisch (mit entsprechenden Anschlüssen)</td><td>Dagan</td><td>Teil von CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Omano</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Control Bath</td><td>Custom oder Dagan Custom oder Dagan</td><td>Custom oder HE-204C</td><td>Kundenspezifische Kammer aus Materialien von Cool Polymers (D-Serie). Dagan bietet auch eine vorfeabrierte Stufe (HE-204C).</td></tr><tr><td>Custom AgCl Pellet Container</td><td>Custom</td><td>Custom</td><td>Custom bearbeitete</td></tr><tr><td>Ag/AgCl Elektrode, Pellet, 2,0 mm</td><td>Warner</td><td>E-206</td><td></td></tr><tr><td>Externes Eizellenbad</td><td>Custom oder Dagan</td><td>Custom oder CC-1-T-LB</td><td>Custom bearbeitet oder gekauft von Dagan</td></tr><tr><td>Internes Eizellbad</td><td>Custom oder Dagan</td><td>Custom oder CC-TG-ND</td><td>Custom bearbeitet oder gekauft von Dagan</td></tr><tr><td>Kapillaren für Agarbrücken und gezogene Elektroden</td><td>Warner</td><td>G150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Drehbare Halterungen für das Mikroskop, den Mikromanipulator und das Bad</td><td>Siskiyou</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>Regular Bleach</td><td>Clorox</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis Eizellen</td><td>Nasco</td><td>LM535M (geschlechtsreife Frauen)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ Externe Lösung</td><td>Siehe Lösungsblatt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 Na+ Interne Lösung</td><td>Siehe Lösungsblatt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M KCL</td><td>Siehe Lösungsblatt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG Speicherlösung</td><td>Siehe Lösungsblatt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Transferpipetten</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>Modifizierter KCl-Elektrodeninjektor</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Spritzenspitze aus Kunststoff geschmolzen, um die Injektion der Lösung in Elektroden zu ermöglichen. Alternativ kann ein Microfil von WPI erworben werden.</td></tr><tr><td>Microvaccum</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Pinzette</td><td>VWR</td><td>63040-458</td><td></td></tr><tr><td>Werkzeuge zur Handhabung von Eizellen (Pipettenpumpe)</td><td>VWR</td><td>53502-222</td><td></td></tr><tr><td>Deionisierte Wasserspritzflasche</td><td>VWR</td><td>16649-911</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline Vaseline Jelly</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zusätzliche Materialien, die für VCF-Aufnahmen benötigt werden:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VCF-Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW NIR-Objektiv</td><td>Nikon</td><td>N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y Translator-System für aufrechte Mikroskope mit festem Tisch</td><td>Sutter Instruments</td><td>MT500-586</td><td></td></tr><tr><td>Externes VCF-Eizellenbad</td><td>Custom</td><td></td><td>Individuell gefertigt. Die Kammermaße betragen 2,7 x 1,9 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Intern VCF Eizellenbad</td><td>Custom</td><td></td><td>Custom gefertigt. Die Kammermaße betragen 1,6 x 1,6 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Modifiziertes Temperaturregelbad Kundenspezifische</td><td></td><td></td><td>Kammer aus Materialien von Cool Polymers (D-Serie). Die Kammerabmessungen des modifizierten Temperaturreglerbades betragen 2,7 x 1,9 x 0,3 cm für die horizontale Kammer und 1 x 2,5 x 0,5 cm für die vertikale Kammer.</td></tr></tbody></table>

die<em&gt; xenopus</em&gt; eizelle cut-open vaseline gap voltage-clamp-technik mit fluorometrie

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

Die aufgeschnittenen Oozyte Vaseline Spalt (COVG) Voltage-Clamp Technik erlaubt die Analyse der elektrophysiologischen und kinetischen Eigenschaften von heterologen lonenkanäle in Oozyten. Aufnahmen aus der aufgeschnittenen Setup sind besonders nützlich für die Lösung geringer Größe Gating Strömungen, schnelle Ionenstrom-Aktivierung und Deaktivierung. Die Hauptvorteile gegenüber der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC)-Technik sind eine erhöhte Klemmgeschwindigkeit, verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis, und die Fähigkeit, die intrazelluläre und extrazelluläre Milieu modulieren. Hier verwenden wir die menschlichen kardialen Natriumkanals (HNA V 1.5), ausgedrückt in Xenopus-Oozyten, die aufgeschnittenen und Setup-Protokoll sowie Änderungen, die erforderlich sind, um Spannungsklemme Fluorometrie Fähigkeit hinzufügen demonstrieren. Die Eigenschaften der schnellen Aktivierung von Ionenkanälen, wie z. B. 1,5 V HNA, nicht vollständig in der Nähe von Raumtemperatur gelöst werden mit TEVC in which die Gesamtheit der Eizelle Membran eingespannt ist, wodurch Spannungssteuerung schwierig. In der aufgeschnittenen Technik, Isolierung von nur einem kleinen Teil der Zellmembran ermöglicht jedoch für den Schnellspann erforderlich, genau zu erfassen, während verhindert schnelle Kinetik Kanal Auslauf mit Patch-Clamp-Techniken verbunden sind. In Verbindung mit der COVG Technik Ionenkanal Kinetik und elektrophysiologischen Eigenschaften können durch Verwendung von Spannungsklemm Fluorometrie, wo Proteinbewegung wird über Cystein Konjugation von extrazellulär aufgebracht Fluorophore, Insertion von genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen oder den Einbau von unnatürlichen Aminosäuren getestet werden verfolgt in der Region von Interesse 1. Diese zusätzliche Daten liefert kinetische Informationen über spannungsabhängige Konformationsänderungen des Proteins über Veränderungen in der Mikroumgebung des fluoreszierenden Moleküls.

Figur 4 zeigt die Veränderung der Durchlässigkeit der Eizelle als Saponin-Lösung wird auf den Bodenabschnitt der Eizelle aufgebracht. Fig. 5 zeigt die Geschwindigkeit der intrazellulären Lösungsaustausch durch Diffusion folgenden Saponin Permeabilisierung. 20-40 Minuten sind erforderlich, um zu einem steady-state 2,18 kommen. 6A zeigen Spuren von der Aufnahmeprotokoll erzeugt. Die Figur zeigt, Ionenströme (nach P/-8 Lecksubtraktio...

Die aufgeschnittenen Vaseline Lücke Ansatz werden geringe Geräuschaufnahmen von ionischen und Anschnittströme von spannungsabhängigen Ionenkanälen in Xenopus-Oozyten mit hoher Auflösung von schnellen Kanal Kinetik ausgedrückt zu erhalten. Mit geringen Modifikationen können Spannungsklemm Fluorometrie an den aufgeschnittenen Oozyte Protokoll gekoppelt werden.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Aufnahmen von Ionenströmen und Gating-Strömen spannungsabhängiger Ionenkanäle, die in Zap-Zellen exprimiert sind, mit geringem Rauschen und hoher zeitlicher Auflösung schneller Kanalkinetik zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst die mRNA des aufgezeichneten ionischen Kanals in die Froschoocyten injiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Agarbrücken herzustellen, indem man die Kapillarrohre formt und diese anschließend mit einer Agar-Lösung, die Salz enthält, füllt.Anschließend wird die geöffnete Versuchsanordnung für die Experimentierung vorbereitet, indem alle Komponenten, einschließlich der UO-Stelle und der Agarbrücken, an ihren vorgesehenen Positionen platziert werden. Der letzte Schritt besteht darin, die Mikroelektrode in die UO-Stelle einzuführen, um Spannungs-Klemm-Messungen zu ermöglichen. Schließlich dient das Aufzeichnungsprotokoll dazu, ionische Ströme von Ionenkanälen in der Oozytenmembran darzustellen.Der Hauptvorteil der geöffneten Voltage-Clamp-Technik besteht darin, dass sie stabile, geräuscharme Aufnahmen einer sehr großen Anzahl von Ionenkanälen ermöglicht. Außerdem erlaubt sie eine schnelle Auflösung der Kanalkinetik. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da einige Schritte – wie die Platzierung der O-Stelle, der oberen Kammer und der Agarbrücken – schwierig zu erlernen sind.Bei diesem Verfahren mindestens sechs Agarbrücken herstellen, indem man ein Ende eines Borosilikat-Kapillarrohrs in einer mittleren Flamme erhitzt. Dies für jede einzelne Kapillare durchführen. Dabei sicherstellen, dass das Ende des Kapillarrohrs im oberen Bereich der blauen Flamme liegt.Nachdem sich das Kapillarrohr erhitzt hat, verwenden Sie die Pinzette, um eine 90-Grad-Biegung vorzunehmen. Die Biegestelle sollte eine gleichmäßige Krümmung aufweisen und keinen abrupten Knick besitzen, da dies den Innendurchmesser des Glases erheblich verringern könnte, was das Befüllen erschwert und den Widerstand der Brücke erhöht. Erhitzen Sie anschließend das Kapillarrohr etwa 25 Millimeter vom nicht gebogenen Ende entfernt.Erzeugen Sie an dieser Stelle eine zweite 90-Grad-Biegung in dieselbe Richtung wie die erste Biegung. Nachdem die Kapillarröhrchen abgekühlt sind, verwenden Sie einen Diamantschneider, um die Schenkel der Brücke auf etwa fünf Millimeter zu kürzen. Danach setzen Sie Platindrähte in die Kapillarröhrchen der drei stromführenden Brücken ein.Schneiden Sie überschüssigen Platindraht ab, sodass außerhalb des Röhrchens kein Draht mehr herausragt. Schieben Sie den Platindraht mit einem feinen Werkzeug weiter in das Kapillarröhrchen, sodass der Draht an beiden Enden des Kapillarröhrchens um einen Millimeter kürzer als das Glas ist. Fügen Sie anschließend die Kapillarbrücken einzeln einer vorbereiteten Agar-Lösung hinzu, wobei die Enden nach oben zeigen.Sobald keine Luftblasen oder -taschen mehr in den Brücken vorhanden sind, entnehmen Sie die Brücken aus der Agar-Lösung und legen Sie sie auf ein Papierhandtuch zum Trocknen. Alternativ füllen Sie die Brücken, indem Sie die Agar-Lösung mit einer Spritze, die an eine kleine Pipettenspitze angeschlossen ist, hindurchdrücken. Danach bereiten Sie die offene Apparatur unter einem Stereomikroskop vor, indem Sie mit einem sehr feinen Gegenstand eine kleine Menge Vaseline auf den Rand des Lochs auf der Oberseite der mittleren Kammer und der Unterseite der oberen Kammer auftragen.Danach dreimolare Kaliumchloridlösung in die Manifold-Nuten mit Silber-Silberchlorid-Pellets geben. In diesem Schritt die obere Kammer ohne UO-Stelle einbauen. Die obere Kammer seitlich verschieben, sodass sich die Öffnungen der beiden Kammern nicht überlappen.Füllen Sie dann alle Kammern mit der externen Lösung und platzieren Sie alle Brücken in ihren jeweiligen Kammern. Danach vergewissern Sie sich, dass der externe Befehl und beide Klemmen ausgeschaltet sind. Überprüfen Sie die Stromanzeige am Verstärker und stellen Sie mit einem kleinen Schraubendreher den P-Regler auf der Rückseite der Bad-Guard-Kopfstufe auf Nullstrom ein.Schalten Sie anschließend den Bad-Guard-Schalter am Verstärker auf „aktiv“. Stellen Sie dann mit einem kleinen Schraubendreher den GS-Offset an der Bad-Guard-Vorstufe so ein, dass der Strom null beträgt. Wiederholen Sie diesen Vorgang abwechselnd im aktiven und passiven Modus, bis beide Werte nahezu null liegen. Entfernen Sie danach die Agarbrückenenden und die obere Kammer.Übertragen Sie eine UO-Stelle mit einer Pipettierpumpe in die mittlere Badekammer und stellen Sie sicher, dass die UO-Stelle über der Öffnung in der Mitte des Bades positioniert ist. Entfernen Sie anschließend überschüssige äußere Lösung aus dem unteren Bad mit einer Pipettierpumpe, um eine Abdichtung zwischen der UO-Stelle und der Oberfläche des Bades zu erzeugen. Platzieren Sie nun die obere Badekammer über der UO-Stelle, sodass die Öffnung in der Kammer mittig über der UO-Stelle liegt.Drücken Sie mit Daumen, Mittelfinger und einer Pinzette langsam auf die Kammer nach unten, bis sie fest gegen das Oozyt gedrückt ist, um nur einen kleinen Teil der Membran durch das Loch der oberen Badlösung ausgesetzt zu halten. Danach füllen Sie die obere und untere Badlösung so weit auf, dass sie fast voll sind. Setzen Sie anschließend die freien Enden der Agarbrücken in die äußere Lösung jedes Bades ein. Achten Sie darauf, dass jede Brücke an der korrekten Position in ihrem Bad liegt.Starten Sie ein Testprotokoll in der Aufnahmesoftware und überprüfen Sie, ob die vertikale Abweichung des horizontalen Abschnitts zwischen den beiden Spitzen des Testimpulses kleiner oder gleich 100 Nanoampere ist. Falls die vertikale Abweichung des horizontalen Abschnitts wie dargestellt mehr als 100 Nanoampere beträgt, erhöhen Sie die Dichtigkeit der oberen Kammer am Cyte. Schalten Sie anschließend den Bad-Guard-Schalter am Verstärker auf „aktiv“.Als Nächstes entfernen Sie die äußere Lösung im unteren Bad und ersetzen sie durch Saponinlösung. Nachdem die Saponinlösung hinzugefügt wurde, beobachten Sie den sich wiederholenden Testimpuls auf dem Computermonitor. Wenn das Maximum des Testprotokolls abnimmt oder verschwindet, deutet dies darauf hin, dass sich eine Blase darunter befindet.Die Zelle hat in diesem Fall die Saponin-Lösung vollständig ersetzt. Mit neuer Saponin-Lösung ist die Zelle permeabilisiert. Wenn die Abnahme des Stromspikes im Testprotokoll abnimmt.Entfernen Sie nach dem Herausnehmen der Zelle die Saponin-Lösung und füllen Sie das Bad mit intrazellulärer Lösung auf. Stoppen Sie anschließend das Testprotokoll. Überprüfen Sie danach, ob ein möglicher Kontakt zwischen den Lösungen in verschiedenen Bädern besteht, und kristallisieren Sie Kaliumchlorid zwischen den Vertiefungen des Verteilers aus, da dies Kurzschlüsse und unregelmäßiges Verhalten verursachen kann.Befindet sich Lösung, verbinden Sie die beiden Bäder, um die überschüssigen Lösungen abzusaugen. Bei kristallisiertem Kaliumchlorid verwenden Sie die Sprühflasche, um das kristallisierte Kaliumchlorid abzuwaschen, und saugen anschließend das verbleibende Wasser ab.Verwenden Sie dann eine modifizierte Spritze, um dreifach molares Kaliumchlorid in eine Mikroelektrode zu injizieren. Schlagen Sie mehrmals leicht gegen die Mikroelektrode. Befestigen Sie nun die mit Kaliumchlorid gefüllte Elektrode am Arm des Mikromanipulators, indem Sie das Drahtfilament in das offene Ende der Mikroelektrode einführen.Stecken Sie das Ende der Mikroelektrode in den Filamenthalter und stellen Sie sicher, dass die Elektrode nicht locker sitzt. Danach ziehen Sie die Elektrodenhalterung fest. Schwenken Sie anschließend den Mikromanipulatorarm über die Zellbäder und ziehen Sie die Klemmen fest, um weitere Bewegungen des Arms zu verhindern.Senken Sie die Elektrode so weit ab, bis die Elektrodenspitze die Flüssigkeitsoberfläche im Bad gerade berührt. Drücken Sie die V-eins-Taste am Zytospannungs-Klemmverstärker und stellen Sie dann den V-eins-Offset-Regler so ein, dass die V-eins-Spannung auf null reduziert wird. Führen Sie dieselbe Einstellung für V zwei durch.Die Potentialdifferenz V eins minus V zwei sollte auf dem Spannungsclamp-Display null Millivolt anzeigen. Danach senken Sie die Elektrode weiter ab, bis sie sich der sichtbaren Patches der UO-Stelle im oberen Bad nähert, während Sie durch das Mikroskop schauen. Sobald sich die Mikroelektrode der UO-Stelle sehr nähert, beobachten Sie die Anzeige von V eins minus V zwei, um zu erkennen, wann die Elektrode in die UOC-Stelle eindringt.Die Spannung V eins minus V zwei wird negativ, wenn die Mikroelektrode in die Zelle eindringt. Öffnen Sie zu diesem Zeitpunkt das Datensammlungsprotokoll in der Aufnahmesoftware. Schalten Sie den Klemmschalter am Spannungsclamp-Verstärker von Uoc auf die Position „Ein“.Anschließend passen Sie das Potential an, indem Sie den am I-Kopf-Stage befindlichen Regler justieren, um es dem Befehlssignal anzupassen. Danach beginnen Sie mit der Aufnahme der Ströme, indem Sie das Protokoll zur Datenaufnahme starten. Hier sind die ausgewählten Testimpuls-Spuren.Während der Oozytenpermeabilisierung zeigt die Zunahme der Zeitkonstante des Abklingens in den Spuren eine Erhöhung der Oozytenpermeabilität an. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse von Wildtyp-Natriumkanälen aus der Cut-open-Voltage-Clamp-Methode. Hier sind die Aufzeichnungen der Ströme bei unterschiedlichen Spannungsreizen dargestellt.Die hier gezeigte Strom-Spannungs-Kurve stellt die Spannungsabhängigkeit des Spitzenstroms dar. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig, darauf zu achten, die Spannungsfixierung abzuschalten, bevor Sie die Zelle betreten, und die Spannungsfixierung abzuschalten, bevor Sie die Zelle verlassen. Andernfalls kann dies zu Schäden an den Agri-Brücken führen, die dann wahrscheinlich ersetzt werden müssen.

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Forschung

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Biologie

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