Automatisierte, Quantitative Kognition / Verhalten Screening der Mäuse: Für Genetik, Pharmakologie, Animal Cognition und Undergraduate-Unterricht

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, genetisch und pharmakologisch manipulierte Mäuse auf Fehlfunktionen und grundlegende Mechanismen der Kognition zu untersuchen. Dies wird durch psychophysische Messungen physiologisch bedeutsamer quantitativer Eigenschaften in einem vollautomatischen 24/7-Verhaltensphänotypisierungssystem mit hohem Durchsatz erreicht. Der nächste Schritt besteht darin, die eingehenden Daten quasi in Echtzeit zu analysieren und grafisch darzustellen, was eine automatisierte Echtzeitsteuerung des Testens auf Maus-für-Maus-Basis ermöglicht.

Anschließend werden die Rohdaten, der Testprotokollcode und alle Zwischenstatistiken in einer einzigen Datenstruktur archiviert. Um die Daten öffentlich zugänglich zu machen und weitere Analysen anzuregen, zeigen die Ergebnisse stammspezifische Veränderungen in der temporalen Dampffraktion basierend auf der Schaltaufgabe. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z.B. dem Wasserlabyrinth, besteht darin, dass Sie physiologisch aussagekräftige Ergebnisse, einen sehr hohen Durchsatz und keine Handhabung der Mäuse erhalten.

Diese Methode kann also dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der kognitiven Neurogenetik zu beantworten, wie z.B. gibt es mutierte Stämme, die quantitativ veränderte Intervall-Timing-Mechanismen aufweisen? Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose genetischer kognitiver Defizite, da sie zur Entdeckung von Genen führen kann, die kritische Komponenten dieser Mechanismen spezifizieren. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, müssen die Grundlagen der MATLAB-Programmierung verstehen und die Leistungsfähigkeit quantitativer automatisierter psychophysischer Tests verstehen.

Adam und ich hatten die Idee, dieses System zu entwickeln, als wir die arbeitsintensive und unquantitative Natur der Tests sahen, die an genetisch manipulierten Mäusen durchgeführt wurden. Richten Sie das Verhaltenstestsystem in einem Standardlaborraum mit 10 Schränken pro Raum und acht Testumgebungen pro Schrank ein. Damit können 80 Mäuse gleichzeitig gefahren werden. Jede Testumgebung besteht aus einer Mauswanne aus Polypropylen, die durch ein Acrylrohr mit einer Maustestbox verbunden ist.

Die Testbox verfügt über drei Trichter, die durch Infrarotstrahlen überwacht werden. Die beiden äußeren Trichter verfügen über angebaute Pelletzuführungen und können Futterpellets fördern, während der mittlere Trichter keine Futterpellets fördert. Kabel, die durch einen Port in einer Partywand geführt werden, verbinden die Testumgebungen mit den elektrischen Schnittstellenkarten und dedizierten Computern in einem anderen Raum, auf denen die Protokollsteuerungsprogramme ausgeführt werden.

Für jeweils zwei Schränke wird ein Computer benötigt. Diese Computer sind über ein lokales Netzwerk mit einem Server verbunden, auf dem die Datenanalyse- und Grafiksoftware ausgeführt wird. Richten Sie das lokale Netzwerk so ein, dass der Server, auf dem die Datenanalysesoftware installiert ist, auf die Festplatten der Computer zugreifen kann, die die Testumgebungen steuern.

Richten Sie als Nächstes ein Dateisynchronisierungskonto für die Datenspeicherung in der Cloud ein. Fügen Sie den TS-Systemordner und seine Unterordner zum MATLAB-Suchpfad hinzu, und stellen Sie sicher, dass es sich bei dem TS-Systemordner um einen Cloud-synchronisierten Ordner handelt. Das TS-System ist eine Open-Source-Softwarebibliothek mit über 30 in MATLAB geschriebenen High-Level-Funktionen, die die Erstellung von komplexem Datenanalyse- und Data-Graphing-Code erleichtern.

Rufen Sie im TS-Systembaukasten die Funktion Ts auf, um die hierarchische Datenstruktur zu erstellen, in die die Rohdaten und alle daraus abgeleiteten Ergebnisse von den anderen Funktionen im TS-Systembaukasten eingeordnet werden. Der nächste Aufruf ts add protocol zum Angeben von Steuerungsparametern für ein experimentelles Protokoll zum Angeben von Entscheidungscode, der die Entscheidung zum Beenden des Protokolls automatisiert und zum nächsten fortfährt und die zu verwendenden Entscheidungskriterien spezifiziert. Platzieren Sie nun die Mäuse in den 24 7 Live-in-Testumgebungen, eine Maus pro Umgebung.

Notieren Sie sich die ID-Nummer der Mäuse, die Boxnummer und den Buchstaben, der den Experimentsteuerungsrechner im lokalen Netzwerk identifiziert, sowie seine IP-Adresse. Nächster Aufruf, ts start session, um die experimentelle Sitzung zu starten. Die experimentellen Sitzungen dauern ein bis zwei Wochen, in denen verschiedene Verhaltenstestprotokolle durchlaufen werden.

Rufen Sie dann auf einem Steuercomputer das Makro auf, das alle von diesem Computer gesteuerten Boxen startet. Dieses Makro wurde von der TS-Startsitzung erstellt. Wiederholen Sie dies an den anderen Steuerrechnern.

Die Datenanalyse kann durch das Schreiben von neuem Datenanalyse- und Grafikcode mithilfe der Befehle in der TS-Systemtoolbox oder durch Verwenden oder Ändern von vorhandenem Datenanalyse- und Grafikerstellungscode erfolgen, der in der Ts-Bibliothek bereitgestellt wird. Einmal begonnen, läuft das Experiment größtenteils von selbst, obwohl während der gesamten Dauer des Experiments eine gewisse Überwachung erforderlich ist. Überwachen Sie die E-Mails auf Warnungen vom TIA-Systemdatenanalyseprogramm, die auf mögliche Gerätefehlfunktionen hinweisen, wie z. B. Stromausfälle, spontane Steuerung, Computerneustarts und Fehlfunktionen der Pelletzuführung.

Diese E-Mail-Benachrichtigungen ermöglichen eine rechtzeitige Reparatur der Störung zwei- bis viermal täglich. Die Leistungsdiagramme, die der TS-Systemdatenanalysecode jedes Mal erzeugt, wenn er vom Analysezeitgeber aufgerufen wird. Diese Flächen können von jedem Ort der Welt zu jeder Zeit überwacht werden, und bei Bedarf kann das Versuchsprotokoll online überarbeitet werden, weit entfernt von dem Ort, an dem die Mäuse getestet werden.

Verwenden Sie auch den TS-Browser, um die Daten und zusammenfassenden Statistiken in der hierarchischen Datenstruktur zu studieren, sobald sie in Quasi-Echtzeit verfügbar sind. Kumulative Ungleichgewichtsdiagramme für erhaltene Pellets, die als Einkommen bezeichnet werden, sind rot dargestellt und die Besuchsdauer ist schwarz für drei Wildtyp-Mäuse und drei L-Eins-Heterozygoten dargestellt. Eine Umkehr des Zeitplans erfolgte an dem Punkt, an dem die Hänge nach unten abbogen, markiert durch vertikale gestrichelte rote Linien für drei der Mäuse. Die Steigung des kumulativen Besuchsungleichgewichts, die schwarze Linie, folgt genau der Steigung des kumulativen Einkommensungleichgewichts.

Die rote Linie, die auf eine nahezu perfekte Übereinstimmung des Verhältnisses der durchschnittlichen Besuchsdauer mit dem Verhältnis der Einkommen hinweist. Beachten Sie, wie schnell sich das Verhältnis der Besuchsdauer an die Änderung des Verhältnisses der Einkommen an den Punkten der Abwärtswende anpasst. Auf der anderen Seite passte eine andere Maus während der zweiten Fütterungssitzungen nicht, wie die Nullsteigung des kumulativen Besuchs zeigt.

Das Diagramm des Durationsungleichgewichts ist schwarz, während die Steigung des Einkommensungleichgewichts in Rot im Wesentlichen positiv ist. In der dritten Fressphase sind die Steigungen jedoch parallel, was bedeutet, dass diese Maus zu Beginn dieser Phase abrupt damit begonnen hat, ihr Besuchsverhältnis mit dem Einkommensverhältnis abzugleichen. Es war also eindeutig in der Lage, dies zu tun, tat dies aber aus irgendeinem Grund während eines Teils der Tests nicht.

Dies zeigt, wie wichtig es ist, den gesamten Leistungsverlauf zu visualisieren, anstatt sich ausschließlich auf einige wenige zusammenfassende Statistiken zu verlassen. Diese Maus stimmte während des ersten Einkommensverhältnisses genau überein, aber als es umgekehrt wurde, kehrte die Maus eine andere Maus während der dritten Fütterungsphase nicht vollständig um. Das heißt, das Ungleichgewicht bei den durchschnittlichen Besuchen war größer als das durchschnittliche Einkommensungleichgewicht, und es hat sich nicht vollständig an die Umkehrung des Einkommensungleichgewichts angepasst.

Beachten Sie jedoch, dass alle sechs Mäuse, sowohl die drei Wildtypen als auch die drei Heterozygoten, während der allerersten vierstündigen Fütterungsphase mit Präzision übereinstimmten und eine abrupte Reaktion auf die Umkehrung des Einkommensverhältnisses zeigten. Dies zeigt die intakte Funktion vieler grundlegender Mechanismen der Kognition bei den Heterozygoten, wie z.B. Dauer, Schätzung, Anzahl, Schätzung der Schätzrate, räumliche Lokalisierung und die Fähigkeit, sich einfache abstrakte Größen zu merken. In der kognitiven Neurogenetik ist es ebenso wichtig zu bestimmen, was noch normal funktioniert, wie herauszufinden, was nicht funktioniert oder eine interessante quantitative Veränderung in seiner Funktion aufweist.

Kumulative Zyklen oder ein Besuch in Trichter eins, gefolgt von einem Besuch in Trichter zwei, gefolgt von einer Rückkehr in Trichter eins, werden als Funktion der Sitzungszeit dargestellt. Hier markieren die gestrichelten grünen Vertikalen den Beginn der Fütterungsphasen. Die durchgehende rote Vertikalenmarkierung ist markiert.

Der Versatz der Schnelligkeit, mit der die Maus zwischen den Trichtern zu wechseln beginnt, ist ein Maß für das, was man ihre Kühnheit oder Neigung zur Erkundung nennen könnte. Fünf der sechs Tiere zeigten vor Beginn der ersten Fütterungsphase eine gewisse Erkundung und begannen abrupt, zwischen den Trichtern zu wechseln, sobald sie begann. Eine Maus zeigte jedoch überhaupt kein exploratives Verhalten, keinen einzigen Zyklus bis zur Mitte der zweiten Fütterungsphase, dann begann sie abrupt zwischen den Trichtern zu wechseln.

Die Analyse von instrumentellen und klassischen Konditionierungsexperimenten liefert kumulative Aufzeichnungen über die Geschwindigkeit der Studienbeginne. Diese Experimente maßen die Lernrate, d.h. die Anzahl der Paarungen vor dem Auftreten des konditionierten Verhaltens. Die vertikalen Strichlinien markieren den Akquisitionsversuch in jedem Datensatz.

Der Akquisitionsversuch ist der erste Versuch, bei dem es zu einer signifikanten Erhöhung der Versuchsstartgeschwindigkeit kommt, vorausgesetzt, die neue höhere Geschwindigkeit ist größer als die Geschwindigkeit im ersten Segment. Diese Leiterregelung ist erforderlich, da es manchmal vor dem ersten signifikanten Anstieg zu einem deutlichen Rückgang kommt. Die kumulativen Verteilungen der Latenzen bei der Studieneinleitung sind hier dargestellt.

Der Punkt oberhalb der X-Achse, an dem die horizontale Linie bei 0,5 die kumulative Verteilung schneidet, ist die mittlere Latenz zum Initiieren eines Versuchs. Hier sind kumulative Aufzeichnungen der Unterschiede zwischen der Stoßrate während des Einsatzes eines Futtertrichters und der Stoßrate während des vorhergehenden Versuchsintervalls dargestellt. Anfangs ist die Steigung dieses Rekords null oder negativ, da die Maus während der Trichterbeleuchtung weniger stochert als während des Versuchsintervalls.

Die Steigung wird positiv, wenn die Maus in Erwartung der bevorstehenden Auslieferung des Appellates in den beleuchteten Trichter zu stochern beginnt. Die durchgezogenen Punkte markieren den Punkt, an dem die Steigung positiv wird, d. h. den Versuch, bei dem die konditionierte Antwort zum ersten Mal zuverlässig in diesen Diagrammen erscheint. Die blauen Linien sind empirische kumulative Verteilungsfunktionen, die die kumulative Verteilung der Schaltlatenzen für eine Maus bei drei verschiedenen Einstellungen der Futterlatenz am Long Hopper zeigen.

Die dünnen roten Kurven, die die empirischen Funktionen fast genau überlagern, sind die sechs Parameter, die die Belga-Funktionen an diese Daten angepasst haben. Die dicken roten Linien sind die entsprechenden Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen für die Belga-Mischungsverteilungen. Die Verkürzung der Long-Feed-Latenz führte dazu, dass die Maus den Mittelwert ihrer Schaltlatenzen verkürzte und deren Präzision erhöhte.

Es verursachte auch das Auftreten einiger impulsiver Schalter, wie die Unebenheit im linken Ende der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion im unteren Diagramm zeigt. Das Maß für diese Impulsivität ist der Anteil des Gemisches, der der Weibel-Komponente durch die am besten passende Version der Weibel-Gauß-Mischungsverteilung zugeschrieben wird. In dieser Analyse sind die kurzen Versuche mit winzigen roten Pluspunkten am unteren Rand des Diagramms markiert, während die langen Versuche mit winzigen roten Pluspunkten am oberen Rand des Diagramms markiert sind.

Die Änderung der Dichte der resultierenden roten Streifen am unteren und oberen Rand zeigt die Änderung der relativen Häufigkeit der kurzen und langen Versuche an. Die Schaltlatenzen sind durch kleine offene Kreise gekennzeichnet. Beachten Sie, dass, wenn das Rot am unteren Rand dichter wird, was bedeutet, dass die kurzen Versuche wahrscheinlicher sind, sich die kleinen Kreise nach oben verschieben und wenn das Rot am oberen Rand dichter wird, was eine Erhöhung der Wahrscheinlichkeit für lange Versuche bedeutet, verschieben sich die Kreise nach unten.

Die blauen Linien sind die Mediane der Verteilungen. Hier wird ein 24-Stunden-Rasterdiagramm von Verhaltens- und Umweltereignissen über einen 90-tägigen Testzeitraum gezeigt. Die schwarzen Punkte zeichnen Stöße auf und die roten und grünen Punkte zeichnen die Pelletabgabe an den beiden Einfülltrichtern auf.

Die ersten schwarzen Dreiecke zeichnen das Ausschalten der Lichter auf, während die zweiten schwarzen Dreiecke die Lichter in der ersten Spalte der cyanfarbenen Dreiecke aufzeichnen und den Beginn des Fütterungsintervalls in der Dämmerung aufzeichnen, das eine Stunde vor der Dämmerung selbst stattfindet, und die zweite Spalte der cyanfarbenen Dreiecke den Versatz des Fütterungsintervalls in der Dämmerung, das drei Stunden nach dem Ausschalten der Lichter auftritt. Diese magentafarbenen Dreiecke zeichnen den unsignierten Beginn der Fütterungsintervalle in der Morgendämmerung auf, der zwei Stunden vor dem Einschalten der Lichter erfolgt, und die letzte Spalte der magentafarbenen Dreiecke zeichnet die Versätze der Fütterungen in der Morgendämmerung auf. Der Beginn der antizipatorischen Aktivität der Fütterung vor der Dämmerung ist mit blauen Sternchen zwischen sechs und 15 Tagen gekennzeichnet.

Nach Beginn der Tests beginnen die Mäuse in der Stunde vor dem Fütterungsintervall in der Dämmerung, eine antizipatorische Stoßaktivität zu zeigen, was auf die Etablierung eines zirkadianen Gedächtnisses hinweist. Heterozygoten, die eine Mutation im L-1-Gen enthalten, zeigen eine höhere Genauigkeit des Intervall-Timings als ihre Wildtyp-Wurfgefährtenkontrollen. Diese Abbildung zeigt die kumulativen Verteilungen der Präzisionsschätzungen für die Wildtyp-Kontrollen als durchgezogene Linien und ihre zygotischen Wurfpartner als gestrichelte Linien, wenn sie in Versuchsblöcken mit immer engeren Abständen zwischen den temporalen Torpfosten durchgeführt werden, was durch die Farbunterschiede gezeigt wird.

Im Gegensatz dazu zeigen Heterozygoten, die die fledermausgesichtige oder BFC-Mutation tragen, eine geringere Intervall-Timing-Genauigkeit als ihre Wildtyp-Ate-Kontrollen. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann der Test in nur einem Tag oder nur wenigen Wochen durchgeführt werden. Für das Matching braucht es nur einen Tag Nahrung.

Das vorausschauende Lernen dauert zwei bis drei Wochen.