Simulation von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität:

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die reaktiven Veränderungen peripherer Neuronen in unterschiedlichen mikrobiellen Umgebungen des Pankreas zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Gesamtgewebelysate aus normalem menschlichem Pankreas und erkranktem Pankreasgewebe hergestellt werden. In einem zweiten Schritt werden DRG-Zellen aus neugeborenen Ratten isoliert, die anschließend mit den gewonnenen Gewebelysaten behandelt werden.

Anschließend werden die Zellen nach einer Inkubation von 48 Stunden fixiert, um eine anschließende doppelte Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen. Die Ergebnisse zeigen die Unterschiede im Verzweigungsmuster der Neuriten-Dichte sowie in der Dichte der Gliazellen von Neuronen, die in verschiedenen Gewebeextrakten kultiviert wurden. Diese Methode kann Untersuchungen im Bereich der neurogastroenterologischen Forschung unterstützen, beispielsweise zur Rolle molekularer Mediatoren oder neuroplastischer Veränderungen bei verschiedenen Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts.

Obwohl diese Methode Einblicke in die unterschiedlichen neurotrophen Eigenschaften von Pankreaserkrankungen ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise Krebserkrankungen oder entzündliche Zustände des gesamten Magen-Darm-Trakts. Die Idee, diese Methode einzusetzen, kam uns erstmals, als wir unsere Zusammenarbeit mit Forschern auf dem Gebiet neuropathischer Erkrankungen im pädiatrischen Bereich begannen, wie etwa der Ong-Krankheit, und wir sie für unsere Zwecke anpassten, um menschliches Pankreasgewebe zu homogenisieren. Überführen Sie Würfel aus Pankreasgewebe mit einer Größe von fünf mal fünf mal fünf Millimetern direkt von minus 80 Grad Celsius in flüssigen Stickstoff.

Danach die gefrorenen Gewebeproben zunächst in Homogenisiergefäße geben, die eine metallische Zerkleinerungskugel enthalten können, und anschließend im Gewebemischer homogenisieren, wobei verhindert werden muss, dass das Gewebe unmittelbar nach der Zerkleinerung auftaut. Den festen, pulverförmigen Homogenat in 300 bis 500 Mikrolitern eiskaltem 0,1× PBS resuspendieren. Kein Lysepuffer verwenden, da dies möglicherweise zu.

Lyse die Neuronen und zentrifugiere das Homogenat bei 21.130 × g bei vier Grad Celsius für mindestens 15 Minuten. Sammeln Sie das klare Überstand, das den Gewebeextrakt enthält, um Überstand von Zelllinien aus humanen Pankreas-Zelllinien zu gewinnen. Kultivieren Sie die Zellen bis mindestens 70 bis 80 % Konfluenz in normalem Wachstumsmedium.

Wenn sie bereit sind, waschen Sie die Zellen mindestens dreimal mit PBS in Zellkulturqualität und kultivieren Sie sie bis zu 48 Stunden in serumfreiem Medium. Anschließend messen Sie die Proteinkonzentration des Gewebehomogenats oder der Überstände der Zelllinie mittels des Bradford-Proteinassays. Danach portionieren Sie die Gewebeextrakte und die Überstände der Zelllinie so, dass die endgültige Konzentration des Extrakts oder des Überstands im neuronalen Medium 100 Mikrogramm pro Milliliter beträgt.

Und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie eine entkapiterte P2 bis P12 neugeborene Ratte, schneiden Sie die Haut und legen Sie die Wirbelsäule frei. Führen Sie anschließend eine anteriore Laminektomie durch, um das Rückenmark freizulegen.

Als Nächstes exponieren und entfernen Sie die Spinalganglien oder dRRGs. Legen Sie das DRG in kaltes MEM, das mit Gentamycin und Metronidazol versetzt ist. Setzen Sie die Sammlung von DRGs fort, beginnend mit den lumbalen DRGs und fortschreitend zu den oberen zervikalen DRGs.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, wurden 52 DRGs gesammelt, was für eine 24-Loch-Platte ausreicht. Anschließend trennen Sie mit einer Mikroschere die DRGs von ihren Wurzeln und Nerven. Danach entfernen Sie alle verbleibenden peripheren und zentralen Fortsätze.

Nach der Sammlung der DRGs: Diese in HBSS mit Kollagenase Typ zwei für 20 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die DRGs durch Spritzen mit abnehmendem Durchmesser pipettieren.

Beachten Sie, dass übermäßiges Tri Neuronen zerstören kann, aber weniger schädlich für Gliazellen ist. Sobald das Medium, das die DRGs enthält, trüb geworden ist, zentrifugieren Sie die Suspension bei 93,9 ×g für fünf Minuten. Danach verwerfen Sie das Medium und resuspendieren.

Suspendieren Sie die Zellen in Neuro-Basal-Medium, um die Zellen für die Kultur vorzubereiten. Schätzen Sie mithilfe eines Hämozytometers die Gesamtanzahl der Neuronen und Gliazellen. Anschließend säen Sie die Zellen auf 13 Millimeter großen vorbeschichteten Deckgläsern aus.

In einer 24-Well-Platte hängt die Beschichtung von den experimentellen Zielen ab. Danach die Wells mit Neurobasal-Medium auffüllen und die Zellen über Nacht andocken lassen. Am nächsten Tag das mit Gewebeextrakt ergänzte Medium oder das mit Zellkulturüberstand ergänzte Medium auftauen.

Als Nächstes das Ansiedlungsmedium von den DRGs abpipettieren und optional eine sehr schonende Spülung mit PBS durchführen. Anschließend das Gewebe vorsichtig pipettieren, ergänzt durch das mit Medium angereicherte Extrakt oder das aus der Zelllinien-Überstand ergänzte Medium langsam auf die Zellen aufbringen, um eine Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Die Zellen anschließend 48 Stunden bei 37 Grad Celsius in dem mit Gewebeextrakt oder Zelllinien-Überstand angereicherten Medium kultivieren.

Entfernen Sie das Medium und fixieren Sie mit 4 % Paraformaldehyd für die Immunfärbung. Verwenden Sie für die doppelte immunfluoreszierende Färbung neuronspezifische und Gliaspezifische Marker für die morphologische Geometrie. Nutzen Sie ein umgekehrtes Lichtmikroskop, ausgestattet mit einer CCD-Kamera in Kombination mit automatischer Software, um die Neuritendichte mittels 200×-Vergrößerung zu messen.

Messen Sie die Neuritendichte neuronaler Kulturen, indem Sie ein 50 mal 50 Mikrometer großes Raster überlagern und die Faserdichte pro Quadrat durch Zählen der sich schneidenden Fasern ermitteln. Wiederholen Sie diese Analyse für vier verschiedene Bereiche mit dichtestem Wachstum auf vier bis fünf repräsentativen Fotomikrografien pro Deckglas. Bestimmen Sie das mittlere Neuritauswachstum, die durchschnittliche Anzahl der Verzweigungen pro Neuron, die mittlere Verzweigungslänge und die perianale Größe anhand von 30 zufällig ausgewählten einzelnen Neuronen pro Deckglas, indem Sie die Neuriten und Perikaryen markieren. DRG-Neuronen, die mit einem Gewebeextrakt aus einem normalen Pankreas kultiviert wurden, sind hier dargestellt.

Hingegen weisen DRG-Neuronen, die mit Gewebeextrakten aus chronischer Pankreatitis oder Pankreaskrebs kultiviert wurden, eine höhere Neuritendichte auf. Hier sind Myenterikus-Plexus-Neuronen, die mit verschiedenen menschlichen Pankreasgewebe-Extrakten kultiviert wurden.

Neuronen des Myenterischen Plexus, die in Extrakten aus chronischer Pankreatitis oder Pankreaskarzinom kultiviert wurden, bilden längere Neuronen aus und weisen ein komplexeres Verzweigungsmuster auf als solche, die in Extrakten aus normalem Pankreasgewebe gezüchtet wurden. Bei der Kultivierung von DRG-Neuronen mit dem Überstand von Pankreaskrebszellen wurde ebenfalls eine Zunahme der Neurodichte beobachtet, ähnlich wie bei der Verwendung von Gewebeextrakten. Diese Zunahme war jedoch reversibel, wenn ausgewählte neurotrope Faktoren wie unser tein oder Nervenwachstumsfaktor abgereichert oder blockiert wurden.

Ggl-Zellen reagieren außerdem unterschiedlich auf verschiedene Pankreasgewebe-Extrakte, Extrakte aus chronischer Pankreatitis oder Pankreaskarzinom; Gewebe verstärkten das gliale Wachstum und die Anzahl glialer Zellen in aus DRG abgeleiteten glialen Kulturen. Obwohl die Wirkung bei Pankreaskarzinom-Extrakten stärker ausgeprägt war als bei Extrakten aus chronischer Pankreatitis, sobald die Technik beherrscht wurde. Diese Technik kann in vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird, nachdem sie etabliert wurde.

Diese Methode ebnete den Forschern auf dem Gebiet der neurogastroenterologischen Wissenschaft den Weg, um Mechanismen der Neuroplastizität bei verschiedenen gastrointestinalen Erkrankungen, einschließlich entzündlicher und maligner GI-Störungen, zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie periphere Neuronen isoliert werden, um die neuro-neuroplastischen Vorgänge im Pankreas zu untersuchen, sowie wie dieses System und andere neuronale Veränderungen und weitere Neuroplastizitäts-Assays bei gastrointestinalen Erkrankungen angewendet werden können.