Question 1

Wie funktioniert RNA-Interferenz, um Gene in C. elegans zum Schweigen zu bringen?

Accepted Answer

Doppelsträngige RNA gelangt nach der Aufnahme in C. elegans-Zellen. Das Enzym Dicer spaltet dsRNA in kurze, interferierende RNA (siRNA) von 21-23 Nukleotiden Länge. Die siRNA assoziiert mit dem RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) und bindet Ziel-mRNA durch komplementäre Basenpaarung, was zum Abbau der mRNA und zur Gen-Knockdown führt.

Question 2

Was ist der erste Schritt bei der Vorbereitung von Bakterien für RNAi-Experimente?

Accepted Answer

Transformieren Sie das Plasmid, das Ihre Ziel-dsRNA kodiert, in den HT115(DE3) E. coli-Stamm, der RNA-Polymerase III entbehrt und ein IPTG-induzierbares T7-DNA-Polymerase-Gen enthält. Transformieren Sie auch Bakterien mit einem leeren Plasmid als Kontrolle. Verteilen Sie transformierte Bakterien auf LB-Agarplatten, die Tetracyclin und Carbenicillin enthalten, und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37°C.

Question 3

Warum ist die Wurmsynchronisation vor einer RNAi-Behandlung wichtig?

Accepted Answer

Die Synchronisierung der Entwicklungsstadien stellt sicher, dass beobachtete phänotypische Unterschiede aus der Gen-Knockdown-Methode und nicht aus der Entwicklungsvariation resultieren. Übertragen Sie L4-Würmer über Nacht bei 20°C auf RNAi-Platten, um junge Erwachsene zu werden, und verschieben Sie sie dann für 6-8 Stunden auf neue Platten, um Eier zu legen. Dies produziert entwicklungssynchronisierte Nachkommen für die Analyse.

Question 4

Wie verwenden Forscher RNAi, um Reverse-Genetik-Screenings durchzuführen?

Accepted Answer

Reverse genetische Screenings schalten bekannte Gene aus einer Bibliothek aus und beurteilen phänotypische Ergebnisse, um die Genfunktion zu entdecken. Forscher kultivieren Bakterien, die dsRNA für viele C. elegans Gene exprimieren, auf Multi-Well Platten und verfüttern sie an Würmer. Phänotypische Effekte offenbaren normale in vivo Genfunktionen und können für eine Hochdurchsatzanalyse von Tausenden von Genen automatisiert werden.

Question 5

Was passiert während der Phase der bakteriellen Kulturvorbereitung?

Accepted Answer

Wählen Sie eine einzelne bakterielle Kolonie aus und geben Sie sie zu 1 ml LB-Bouillon mit 100 μg/ml Ampicillin. Inkubieren Sie über Nacht bei 37°C unter Schütteln. Fügen Sie dann 5 ml frische LB-Bouillon mit Ampicillin hinzu und inkubieren Sie 4-6 Stunden bei 37°C. Diese Kultur wird dann auf RNAi-Wurmplatten gegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert, um einen bakteriellen Rasen zu erzeugen.

Question 6

Welche Phänotypen können bei der Analyse von RNAi-behandelten Würmern beobachtet werden?

Accepted Answer

Vergleichen Sie RNAi-Knockdown-Würmer mit Kontrollen und notieren Sie Unterschiede in Größe, Entwicklungsstadium, Morphologie und Lokalisationsmustern von fluoreszenzmarkierten Proteinen. Wissenschaftler können auch Entwicklungszeit-Effekte beurteilen, wie Gene, die die Entwicklung verzögern, wenn sie herunterreguliert sind, oder Gene, die an anderen biologischen Prozessen beteiligt sind.

Question 7

Wie wird ein Mikroskop-Objektträger zur Visualisierung von C. elegans vorbereitet?

Accepted Answer

Kleben Sie zwei Objektträger mit Markierungsklebeband als Abstandshalter. Platzieren Sie einen sauberen Objektträger dazwischen und pipettieren Sie 150 μl 4% geschmolzenes Agar darauf. Decken Sie mit einem senkrechten Objektträger ab, trennen Sie dann vorsichtig. Fügen Sie 10 μl Natriumazid-Anästhetikum zum Agar-Polster hinzu, übertragen Sie Würmer mit einer Platindraht-Pinzette, fügen Sie einen Deckglas hinzu und beobachten Sie unter einem Mikroskop.

RNA-Interferenz in C. elegans - Bewertungsquiz