Name: Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus Drosophila Hoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Testes für die Mikroskopie zur Analyse der Spermatogenese. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung zellulärer Strukturen und Proteinlokalisierungen in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren bedanken sich bei Michael Anderson für die Einrichtung in der Lee-Labor akzeptiert diese Methoden zur Untersuchung der Spermatogenese mit fachkundiger Beratung von Karen Hales danken. H. Oda und Y. Akiyama-Oda großzügig sofern die γ-Tubulin-GFP Fliegen Lager. Diese Arbeit wurde durch ein NIH R01 Zuschuss für LAL (GM074044) unterstützt.

1. Hoden Dissection <ol><li> Anesthetize Fliegen in einer Flasche oder einem Fläschchen mit einem Strom von CO 2 und übertragen, um eine Fliege Pad. </li><li> Sortieren fliegt unter einem Binokular mit einem kleinen Pinsel, und sammeln eine entsprechende Anzahl (je nach Experiment) von Drosophila Männchen der gewünschten Genotypen. Junge Männer (0-2 Tage alt) sind ideal für die Prüfung Zellen in den früheren Stadien der Spermatogenese (zB Spermatogonien, Spermatozyten und frühen postmeiotischen Spermatiden), während etwas ältere Männer (2-5 Tage alt) sind ideal für die Prüfung der Zellen in den letzten Stadien der Spermatogenese (insbesondere reifen Spermien). </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Flügel aus jeder fliegen zu entfernen (um die Fliegen aus variabel in Flüssigkeit während der Präparation zu verhindern). </li><li> Hinzufügen ~ 500 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4, PBS) in einem Tropfen auf eine silikonbeschichtete Dissektion Schale aufein schwarzer Hintergrund. Andere wässrige Lösungen wurden erfolgreich Hoden Präparation 3 verwendet. </li><li> Punkt in Richtung der vorderen Zange der Fliege, fassen Sie es durch den Brustkorb, und tauchen es in der PBS-Tropfen. Während Sie durch das Binokular, verwenden Sie eine andere Pinzette zu greifen und ziehen Sie den äußeren Genitalien (dunkelbraun Struktur am hinteren Ende des ventralen Bauch gelegen) hinten, bis es aus dem Bauch löst. In den meisten Fällen werden die Hoden, Samenblasen und Zubehör-Drüse aus dem Bauch zusammen mit der äußeren Genitalien entfernt werden, wenn nicht, kann eine einzelne Pinzette in den Bauch und necken sich die Hoden. </li><li> Separate Hoden aus dem Zubehördrüse und äußeren Genitalien mit zwei Pinzetten in der PBS-Tropfen (Abbildung 2). Wildtyp-Hoden werden leicht von benachbarten weißen Gewebe durch ihre gelbe Farbe aus. Gehen Sie sofort zu Schritt 2 über. </li><li> Um Hoden von Männern pharate (i isolieren.. E innerhalb der Puppenhülle eingeschlossen), ist ein weiterer Schritt zuerst durchgeführt, die das Entfernen der Fliege aus der Puppenhülle umfasst werden, dieser Schritt wurde bereits an anderer Stelle 31 beschrieben. Fahren Sie mit der Präparation wie bei den Erwachsenen Hoden ab Schritt 1.2. </li><li> Um Hoden von männlichen Larven zu isolieren, führen Sie eine Modifikation eines Protokolls zur Isolierung von Drosophila-Larven 32 Eierstöcke. Kurz gesagt, können männliche Larven von weiblichen Larven durch die Anwesenheit von einem Paar große, klare, ovale Strukturen (Larven Hoden) im hinteren Drittel der Fettkörper eingebettet unterschieden werden. Um Larven Hoden isolieren, teilweise die Haut abziehen öffnen die männliche Larve, die Hoden und die umgebende Fettkörper aus dem Bauch zu isolieren, wie für die Isolierung der Larven Eierstöcke beschrieben. Gehen Sie sofort zu Schritt 2 von dem hier beschriebenen Protokoll, die Hoden können später von der fetten Körper nur vor der Montage (Schritte 2.3 oder 3.14) als für den Eierstöcken 32 beschrieben, entfernt werden. </li></ol><ol><li> Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig platzieren 2-3 Paar Hoden in einem Tropfen 5.4 ml PBS auf einem quadratischen Deckglas. Beachten Sie, dass das Verhältnis der Hoden Nummer PBS Lautstärke kann angepasst werden müssen: zu viel Flüssigkeit aus Zellen richtig Ausbreitung zu verhindern, wenn gequetscht, während zu wenig Flüssigkeit führt zu Zellen platzen, wenn gequetscht. Optional: Verwenden silikonisierte Deckgläser, um die Einhaltung von Gewebe zu minimieren, um den Schlupf in Schritt 3.2 zu decken. </li><li> Verwenden Sie eine Zange, um jeden Hoden offen an einer geeigneten Stelle zu reißen, um das Vorhandensein der gewünschten Keimbahn-Zelltypen in der Vorbereitung zu maximieren (beachten Sie, dass der Inhalt des Hodens wird meist Austritt aus dem zerrissenen Region auf den Objektträger während der Quetschung Schritt aus.) Um Spermatogonien und Spermatozyten zu bereichern, aufreißen die Hoden neben seinem apikalen Spitze (Ebene 1, 2B). Um Spermatozyten und Spermatiden bereichern, Tränen öffnen Sie die Hoden bei einer posITION leicht basalen auf Stufe 1 (Ebene 2, 2B). Um reifer Keimbahnzellen zu bereichern, reißen die Hoden näher an offen, wo die Krümmung beginnt (Stufe 3, Abbildung 2B). </li><li> Sanft statt einen Glasobjektträger über das Deckglas, um die Hoden quetschen, nicht Druck manuell anwenden, wie das Gewicht des Deckglases allein ist ausreichend, um eine richtig gequetscht Probe zu erhalten. Versuchen Sie zu vermeiden Luftblasen. Optional: Verwenden Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger, um die Einhaltung des Gewebes zu fördern, um in Schritt 3.2 gleiten. </li><li> Verwenden Vorbereitung sofort (idealerweise innerhalb von 15 Minuten der Vorbereitung), um lebende Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie beobachten, für transgenen Fliegen mit der Expression von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in den Hoden, können lebende Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie in diesem Schritt untersucht werden. Alternativ fahren Sie mit der Fixierung und Antikörperfärbung (Protokoll 3). </li><li> Docht vorsichtig überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas mit einer Reinigungs wipe zu Abflachung der Vorbereitung zu ermöglichen, bis die Keimzellen sind deutlich im Fokus. </li></ol> 3. Formaldehyd-Fixierung und Antikörperfärbung <ol><li> Schnellfrost jede Folie mit Hoden gequetscht (von Protokoll Nr. 2) mit einem Paar Metallzange, um es kurz in flüssigen Stickstoff tauchen (bis flüssigem Stickstoff stoppt Blasenbildung). </li><li> Entfernen Sie das Deckglas sofort mit einer Rasierklinge. </li><li> Verwenden Metallzange, um Folien in eine vorgekühlte Glasobjektträger mit eiskaltem 95% Ethanol gefüllt (spektrophotometrische grade, Methanol-frei) zu übertragen. Lagerung bei -20 ° C für 10 min. </li><li> Verwenden Metallzangen Dias auf einen Objektträger-Rack mit 4% Formaldehyd in PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T) gefüllt übertragen. Lagern bei Raumtemperatur für 7 min. </li><li> Verwenden Metallzangen Dias auf einen Objektträger mit PBS gefüllten Rack übertragen. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen 1x. Führen Sie alle Waschungen durch Verwerfen Lösung in der Glasobjektträgergestell ( <em&gt; Dh. durch Gießen out) und Ersetzen durch frische Lösung. </li><li> Verwerfen die PBS und tauchen Folien in PBS-T für 30 min bei Raumtemperatur, Zellmembranen durchlässig zu machen. </li><li> Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. 2x wiederholen. </li><li> Blockierungsschritt (optional): Tauchen Folien in PBS plus 1% BSA für 45 min bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift einen Kreis auf der Folie herum gequetscht Gewebe (mit dem Auge gut sichtbar), um die Antikörperlösungen (in Schritten 3.9 und 3.11 hinzugefügt) beschränken zu ziehen. Das Gewebe sollte feucht zu allen Zeiten während der Durchführung Immunfärbung gehalten werden. </li><li> Hinzufügen 30-40 ml primärem Antikörper (in PBS-T, 1:400 bis 1:50 verdünnt, je Antikörper), um Gewebe innerhalb des Kreises. Wenn Sperrung durchgeführt wurde, verdünnte primäre Antikörper in PBS-T plus 1% BSA. Anti-Gamma-Tubulin-Antikörper (für die Färbung von Zentrosomen in Fig. 4) wurde 1:100 verdünnt. Inkubation in einer feuchten, dunklen Kammer (z. B. geschlossene Kunststoff-Box.mit feuchten Papiertüchern) für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur 3x. Wenn Sperrung durchgeführt wurde, zweimal waschen in PBS-T und einmal in PBS (5 min bei Raumtemperatur jeweils). </li><li> Hinzufügen 30-40 ml Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper (verdünnt 1:400 in PBS) auf das Gewebe und Inkubieren im Dunkeln für 1-2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. 2x wiederholen. </li><li> Hinzufügen 30-40 ml DAPI-Lösung (0,2 mg / ml in PBS) zu dem Gewebe innerhalb des Kreises. </li><li> Sanft statt ein Deckglas über das Gewebe, kümmert sich um Luftblasen zu vermeiden. Wenn Luftblasen erscheinen soll, sorgfältig um das Deckglas zu bewegen, ohne die Squash bis die Blasen von den Seiten des Deckglases zu entkommen. </li><li> Verwenden Sie ein Reinigungstuch, um überschüssige DAPI von den Rändern der Folie tupfen. </li><li> Dichten Sie das Deckglas auf den Objektträger mit klarem Nagellack. </li><li> Mit dieser Vorbereitunginnerhalb der nächsten 3-4 h auf immungefärbten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu sehen. Für längerfristige Speicherung von Dias (bis mindestens mehrere Wochen), verwenden Sie eine Glycerin-basierte Festmontage Medien mit DAPI und speichern Objektträger bei -20 ˚ C </li><li> Alternativ fixieren Proben in Methanol anstelle von Formaldehyd (je nach Antigen). Nach Abschluss der gesamten Protokoll über den Schritt 3.2, tauchen Dias von gequetschten Hoden in Methanol für 10 min bei -20 ° C und fahren Sie mit Schritt 3.5 weiter. </li></ol>

<ol><li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+staining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li>
<li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li>
<li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+lessons+from+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li>
<li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li>
<li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li>
<li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage%3A+Partners+behind+the+scenes%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li>
<li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li>
<li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li>
<li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tokens+of+love%3A+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li>
<li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li>
<li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila%3A+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li>
<li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+twinstar%2C+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin%2FADF+homologue%2C+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li>
<li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li>
<li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li>
<li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li>
<li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li>
<li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li>
<li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li>
<li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Obwohl die Hoden von Wildtyp-Fliegen können ohne weiteres durch ihre gelbe Farbe (im Gegensatz die benachbarten weißen Gewebe) identifiziert werden kann, sind die Hoden von weißen mutierten Fliegen weiß und kann daher gelegentlich mit dem Darm zu verwechseln. Die meisten transgenen Linien, die typischerweise in einem weißen Hintergrund, haben auch weiße Hoden, weil die Mini-white-Gen in P-Elementen funktioniert Pigmentakkumulation in den Hoden nicht fördern. Bei Drosophila Ho...

Drosophila Hoden sind eine ideale Modellsystem für die Untersuchung von vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Regulation von Stammzellen, Meiose und Samenentwicklung 13-18. Die Spermatozyten und ihre Reife Spindeln sind groß und damit praktisch für die zytologische Analyse und entspannt Zellzyklus-Kontrollpunkte während der Spermatogenese erleichtern die Untersuchung von Mutationen in Zellzyklus-Genen. Verschiedene Zelltypen können in geordneten Ablauf entlang der Länge der Hoden beobachtet werden, und jede Störung der Spermatogenese zu Änderungen in dieser Gesamtanordnung führen. Diese Eigenschaften kombiniert mit Drosophila genetische Werkzeuge haben die Mutationsanalyse der Spermatogenese 21-23 erleichtert. Die Stadien der Drosophila Spermatogenese haben gut definiert. Keimbahnzellen, die synchron in Zysten Fortschritte sequentiell durch die Stadien der Spermatogenese entlang der Länge des Hodens. Während boten der mitotischen und meiotischen Teilungen der männlichen Keimzellen, tritt Zytokinese unvollständig, so dass die Tochterzellen bleiben zytoplasmatische Brücken Ringkanäle bekannt sind (Abbildung 1). Die apikale Spitze des Hodens enthält eine Bevölkerung von Keimbahn-Stammzellen, die Anlass zu den Spermatogonien, die vier mitotische Teilungen mit unvollständiger Zytokinese unterziehen, um 16-Zellen-Zysten primären Spermatozyten generieren. Nach premeiotic S-Phase, primären Spermatozyten geben G2, eine längere Wachstumsperiode von ~ 90 Stunden, während der zellulären Volumensteigerungen ~ 25-fache. Progression durch Meiose I und Meiose II führt zur Bildung von 32-Zell-Zysten sekundären Spermatozyten und 64-Zellen-Zysten von haploiden Spermatiden sind. Die unreifen, runden Spermatiden in umfangreichen zellulären Umbau zu reifen Spermien bilden. Post-meiotischen Zellen, insbesondere die Bündel der Verlängerung und reife Spermatiden, besetzen viel von dem Volumen der Hoden. Ter erfolgreich den Transport von Funktions Spermien weibliche Fliegen erfordert die Koordination zwischen den verschiedenen Teilen des männlichen Fortpflanzungssystem, das aus mehreren gekoppelten Strukturen (die Hoden, Samenblasen und akzessorischen Drüsen) und einem Einzel Ejakulationsleitung zusammengesetzt ist (Abbildung 2). Spermien werden in den Hoden produziert und innerhalb der Samenbläschen, bis Kopulation 24 gespeichert. Die Zubehör sekretorischen Drüsen enthalten Zellen, die Samenflüssigkeit zu produzieren. Die Spermien Migration aus den Samenbläschen mit Samenflüssigkeit innerhalb des Ejakulationsleitung, die sowohl für die Samenbläschen und die Anhangsdrüsen verbunden ist gemischt. Diese Mischung von Spermien und Samenflüssigkeit wird schließlich aus dem männlichen in die Vagina der weiblichen Fliegen durch die Ejakulation Lampe am hinteren Ende des männlichen Bauch 25 angeordnet gepumpt. Proteine ​​in der Samenflüssigkeit sind für eine längere Lagerung von Spermien in spezialisierten Organen wie Spermatheken in der rep bekanntroductive Trakt von Drosophila-Weibchen 26. Ausgezeichnete Methoden zur Isolierung von Drosophila Hoden und Visualisierung von Zellen in verschiedenen Stadien der Spermatogenese sind in der wissenschaftlichen Literatur 3-12 erhältlich. Wir hier in diesem Körper von Wissen hinzufügen, indem Beispiele für diese Protokolle mit einem begleitenden Video-Demonstration. Das Protokoll für die Herstellung von Lebendproben Hoden zur Phasenkontrastmikroskopie auf einem zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis 27. Das Protokoll für die Formaldehyd-Fixierung und Immunfärbung von Hoden wird auch auf einem zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis 28. Die hier beschriebenen Ansätze wurden in vielen Studien von Drosophila Spermatogenese verwendet (zum Beispiel die Rollen von Dynein beurteilen, ein Minus-Ende gerichtet Mikrotubuli Motor während der Drosophila Spermatogenese). Zusätzlich zu den grundlegenden Protokolle werden Vorschläge für varyin bereitgestelltg der Dissektion, um für Spermatogonien, Spermatozyten, oder reifen Spermien zu bereichern. Verschiedene Verfahren zum Verarbeiten der Hoden, so daß Zysten entweder erhalten bleiben oder zerstört werden, wie nötig sind, beschrieben. Ein Vorteil bei der Verwendung Hoden Drosophila als Modellsystem ist, dass, im Vergleich zu Drosophila Eizellen und Embryonen, Antikörper und Farbstoffe können leicht eindringen Zellen nach ihrer Streuung aus den Hoden und weniger Waschschritte erforderlich sind, so können Protokolle in einer relativ durchgeführt werden kurze Zeit.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Zweikomponenten-Silikonelastomer zur Herstellung einer silikonbeschichteten Sezierschale aus Kimax Petrischale</td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Klarer Nagelschutz</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagenz mit DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Anti-Gamma-Tubulin-Antikörper (Klon GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniReine Ziege Anti-Maus-IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers zum Silikonisieren von Deckgläsern</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0,5 mg/ml in 75%igem Ethanol; lagern bei -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Feinfühler</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Molekularbiologisches</td></tr><tr><td>Coplin-Färbegefäß aus Glas, Schraubverschluss</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Einzelne mattierte Objektträger</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Optional (als Ersatz für unbehandelte Objektträger)</td></tr> <tr><td>Quadratisches Deckglas</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD-Pinzette</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Pattern 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS Stereoskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X Objektiv</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die zytologische analyse der spermatogenese: live-und fest zubereitungen aus<em&gt; drosophila</em&gt; hoden

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modellsystem, das in großem Umfang verwendet wurde, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen aufzuklären. Beispielsweise haben Studien sowohl der männlichen und weiblichen Keimlinien Drosophila zur derzeitigen Verständnis der Meiose und Stammzellenbiologie beigetragen. Ausgezeichnete Protokolle sind in der Literatur für die Isolierung und Darstellung von Drosophila Ovarien und Hoden 3-12 erhältlich. Hierin sind Verfahren für die Präparation und Herstellung von Drosophila Hoden für die mikroskopische Analyse mit einem zugehörigen Video-Demonstration beschrieben. Ein Protokoll für die Isolierung Hoden aus dem Bauch von erwachsenen Männern und Herstellung von Folien lebendes Gewebe zur Analyse durch Phasenkontrastmikroskopie als auch ein Protokoll für die Befestigung und die Immunfärbung Hoden für die Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Diese Techniken können bei der Charakterisierung von Drosophila-Mutanten, d aufweisen angewendetefects der Spermatogenese sowie der Visualisierung der subzellulären Lokalisation von Proteinen.

Ein Beispiel eines gut präpariert Paar von Drosophila männlichen Geschlechtsorgane ist in 2A gezeigt. Hoden aus dem Abdomen der erwachsenen männlichen Fliege entfernt werden typischerweise zum Ejakulationsleitung (braun, 2A &#39;) und einem Paar Anhangsdrüsen (grün, 2A&#39;) über ein Paar von Samenblasen (blau, 2A &#39;) befestigt . Die Hoden von den meisten zugehörigen somatischen Gewebe, das Ejakulationsleitung und die Anhangsdrüsen trennen s...

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Hoden von Oph zu dissezieren und für die Mikroskopie vorzubereiten. Zunächst werden die Hodenpaare aus dem Abdomen männlicher Fliegen disseziert. Im zweiten Schritt werden die Hoden auf dem geeigneten Entwicklungsstand angerissen und plattiert, um die enthaltenen Zellen freizusetzen.Anschließend werden die zerquetschten Hoden fixiert und danach in primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Der letzte Schritt besteht darin, das Gewebe auf einem Objektträger zur Bildgebung aufzubringen. Abschließend werden mit Phasenkontrast- oder Immunfluoreszenzmikroskopie Zellen in verschiedenen Stadien der Spermatogenese hinsichtlich Defekte und Morphologie sowie die subzellulären Lokalisationen verschiedener Proteine untersucht.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung entscheidender Funktionen von Proteinen während des Verlaufs der Spermatogenese. Eine visuelle Darstellung der Dissektion der Testes von RAs ist entscheidend, da ein Anfänger bei diesem Verfahren anfangs Schwierigkeiten haben könnte, die Testes im Abdomen der Fliege zu lokalisieren. Außerdem lässt sich die effektivste Methode zum Zerquetschen des Gewebes leichter demonstrieren als in Worten zu beschreiben.Um die Dissektion zu beginnen, betäuben Sie Fliegen in einer Flasche oder einem Gefäß mit einem Strom aus Kohlendioxid. Anschließend überführen Sie die betäubten Fliegen auf ein Fliegenkissen. Sortieren Sie die Fliegen unter einem Stereomikroskop mithilfe eines kleinen Pinsels, um etwa sechs bis acht Oph-Männchen des gewünschten Genotyps zu sammeln.Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette die Flügel von jeder Fliege. Dies verhindert, dass die Fliegen in der Flüssigkeit schwimmen. Geben Sie während der Präparation 500 µL gepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline oder PBS) als einzelnen Tropfen auf eine silikonbeschichtete Präparationsplatte mit schwarzem Hintergrund.Danach die Pinzette in Richtung des vorderen Endes einer der entflügelten Fliegen führen. Diese am Thorax fassen und in den PBS-Tropfen eintauchen. Die dunkelbraune Struktur am hinteren Ende des ventralen Abdomens identifizieren und mit einem weiteren Paar Pinzetten greifen und die äußeren Genitalien nach posterior ziehen, bis sie sich vom Abdomen lösen.In den meisten Fällen werden die Hoden, Samenbläschen und Nebendrüsen zusammen mit den äußeren Geschlechtsorganen aus dem Abdomen entfernt. Falls dies nicht der Fall ist, führen Sie ein Paar Pinzetten in das Abdomen ein und lösen vorsichtig die Hoden heraus. Trennen Sie die Hoden mithilfe von zwei Paar Pinzetten von den Nebendrüsen und den äußeren Geschlechtsorganen.Unterscheiden Sie Wildtyp-Testes anhand ihrer gelben Farbe von dem angrenzenden weißen Gewebe. Um die Probe für die Live-Bildgebung vorzubereiten, platzieren Sie mit einer Pinzette vorsichtig zwei bis drei Paare von Testes in einen Tropfen von vier bis fünf Mikrolitern PBS auf einem quadratischen Glas-Objektträger. Danach reißen Sie.Öffnen Sie jedes Hodenorgan mit einer Pinzette auf einer geeigneten Höhe, um die Präsenz der gewünschten Keimbahnzelltypen in der Präparation zu maximieren. Der Inhalt der Hoden tritt aus der aufgerissenen Region auf den Objektträger aus. Während des Andrückens, um Spermatogonien und Spermatocyten anzureichern, öffnen Sie die Hoden in der Nähe ihrer apikalen Spitze. Für Spermatozyten und Spermatiden öffnen Sie die Hoden an einer leicht basaleren Position zur Ebene eins, um reifere Keimbahnzellen anzureichern. Öffnen Sie die Hoden näher an der Stelle, an der die Krümmung beginnt. Der nächste Schritt besteht darin, die Hoden zu plattieren, indem Sie vorsichtig ein Objektträger über die Deckglasabdeckung legen.Üben Sie keinen manuellen Druck aus und vermeiden Sie das Einschließen von Luftblasen. Verwenden Sie die Probe innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung, um lebende Zellen zu beobachten. Wickeln Sie mittels Phasenkontrastmikroskopie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas mit einem Reinigungstuch ab, um eine Ebenung der Präparation zu ermöglichen, bis die Keimzellen scharf im Fokus sind.Kühlpräparate, die zerquetschte Hoden enthalten, mit einer Metallzange in flüssigen Stickstoff eintauchen, bis das Blubbern des flüssigen Stickstoffs aufhört, um sie schnell einzufrieren. Die Deckglasabdeckung sofort mit einem Rasiermesser entfernen. Anschließend die Objektträger mit der Metallzange in einen vorab gekühlten Glaspräparatbehälter übertragen, der mit eiskaltem 95 %igen Ethanol gefüllt ist, und die Probe 10 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius lagern.Überführen Sie die äquilibrierten Objektträger in einen Glasobjektträgerhalter, der mit 4 % Formaldehyd in PBS plus 0,1 % Triton X-100 oder PBST gefüllt ist, und lagern Sie sie sieben Minuten lang bei Raumtemperatur. Anschließend überführen Sie die Objektträger in einen Halter, der mit PBS gefüllt ist. Waschen Sie die Objektträger fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBS, indem Sie die Lösung im Halter verwerfen und durch frische PBS-Lösung ersetzen.Wiederholen Sie die Wäsche einmal. Entsorgen Sie das PBS und tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten bei Raumtemperatur in PBST ein, um die Zellmembranen zu permeabilisieren. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur. Ziehen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis um das Zerquetschungsgewebe auf dem Objektträger, um die Antikörperlösungen zu begrenzen und das Gewebe während der Immunfärbung stets feucht zu halten.Anschießend 30 bis 40 Mikroliter Primärantikörper, verdünnt in PBST, zum Gewebe innerhalb des Kreises hinzufügen. Die Probe im feuchten, dunklen Kammer zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, nach der Inkubation mit dem Primärantikörper. Die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit PBS waschen.Anschießend 30 bis 40 Mikroliter einer in PBS verdünnten, konjugierten sekundären Antikörperlösung der vierten Generation zum Gewebe hinzufügen und eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Danach die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit PBS waschen. Anschließend 30 bis 40 Mikroliter Dappy-Lösung innerhalb des Kreises auf das Gewebe geben.Platzieren Sie vorsichtig ein Deckglas über das Gewebe und achten Sie dabei besonders darauf, keine Luftblasen einzuschließen. Sollten Luftblasen entstehen, bewegen Sie das Deckglas vorsichtig, ohne die Probe zu beschädigen, bis die Blasen an den Rändern des Decks entweichen. Entfernen Sie überschüssiges Medium an den Rändern des Objektträgers mit einem Reinigungstuch.Danach die Deckglaspräparation mit Nagellack versiegeln und die immunohistologisch gefärbten Zellen innerhalb von drei bis vier Stunden mit einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen. Diese Zeichnung zeigt die Lokalisation verschiedener Stadien der Zellreifung im Drosophila-Testis. Stufe eins enthält jüngere Zellen, die sich in frühen Phasen der Spermatogenese befinden, während Stufe drei die ausgereifteren Spermienzellen umfasst.Die Ebene zwei enthält eine gemischte Population von mitotischen und postmitotischen Keimbahnzellen. Ein entsprechendes Phasenkontrastbild zeigt die Freisetzung von Spermatogonien sowie frühen und späten primären Spermatozyten, wenn der Hoden in Ebene eins aufreißt. Der gelbe Pfeil zeigt außerdem auf eine Fusion von zwei oder mehr miteinander verbundenen Zellen infolge einer unvollständigen Zytokinese.Ein Artefakt des hier gezeigten Zerquetschungsverfahrens ist ein entsprechendes Phasenkontrastbild, das die Freisetzung von späten primären Spermatocyten und postmitotischen Zellen zeigt, einschließlich runder Spermatiden, sich verlängernder Spermatiden und reifer Spermien, wenn die Testes auf der zweiten Ebene einreißen. Die Phasenkontrastmikroskopie von zerquetschten Testes kann ebenfalls verwendet werden, um Defekte in der zahlreichen runden Spermatidenphase leicht zu identifizieren. Wilde Typ-Spermatiden mit einem phasenhellen Kern sind hier angeheftet an ein phasendunkles einzelnes mitochondriales Aggregat von ungefähr gleicher Größe dargestellt.Im Gegensatz dazu enthalten die Spermatiden aus Aun-Testes mehrere kleine Kerne und ein großes mitochondriales Aggregat, was auf eine fehlgeschlagene Zytokinese und Fehler bei der Chromosomen-Segregation zurückzuführen ist. Die hier gezeigten Graustufenbilder stammen aus einer Präparation von zerdrückten Testes, die mit Reagenzien gefärbt wurden, um Mikrotubuli, DNA und Zentrosomen farblich sichtbar zu machen. Die kombinierten Bilder zeigen einen sich teilenden Spermatocyten, ein großes Feld runder Spermatiden sowie ein Bündel reifer Spermien. Nach Beherrschung der Probenvorbereitung für die Phasenkontrastmikroskopie kann die Mikroskopie innerhalb von 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden.Die Vorbereitung von Proben für die Immunfluoreszenzmikroskopie kann innerhalb von sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Zusätzlich zur Aufarbeitung von Oph-Hodengewebe für die Mikroskopie können die dissezierten Hoden alternativ für die biochemische Analyse von Proteinen verwendet werden.

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Imaging von zentrosomale Proteine ​​während der Drosophila Spermatogenese ist eine leistungsfähige Methode, um neue Proteine ​​von entscheidender Bedeutung für die Biologie Zentrosom zu identifizieren sowie die besondere Funktion der bekannten Akteure in diesem Prozess aufzuklären.

Imaging Zentrosomen in Fly Hoden

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Kultivierung von intakten Hoden und Keimbahnzysten aus Puppen von Drosophila melanogaster. Diese Methode ermöglicht die mikroskopische Beobachtung der Spermatogenese ex vivo. Des Weiteren wird ein pharmakologischer Assay zur Wirkung von Inhibitoren auf bestimmte Stadien der Keimzellentwicklung im Puppenhoden beschrieben.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

Wir präsentieren Protokolle für die Entnahme, Aufbereitung und Bildgebung von reifen Drosophila-Eizellen. Diese Methoden ermöglichen die Visualisierung des Chromosomenverhaltens sowie des Spindelaufbaus und der Funktion während der Meiose.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zellteilung im intakten Gewebe durch lebende und feste Zellmikroskopie mit Drosophila meiotischen Spermatozyten zu analysieren. Das Protokoll zeigt, wie ganze, intakte Hoden von Drosophila-Larven und frühen Pupas isoliert und wie man sie für die Mikroskopie verarbeitet und montiert.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Hier wird ein Protokoll zur Mikroinjektion und gleichzeitigen Abbildung mehrerer Drosophila-Embryonen während der embryonalen Entwicklung mit einem plattenbasierten, hochinhaltigen Imager vorgestellt.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Testes für die Mikroskopie zur Analyse der Spermatogenese. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung zellulärer Strukturen und Proteinlokalisierungen in vivo.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus

Weitere Videos entdecken