Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Hoden von Oph zu dissezieren und für die Mikroskopie vorzubereiten. Zunächst werden die Hodenpaare aus dem Abdomen männlicher Fliegen disseziert. Im zweiten Schritt werden die Hoden auf dem geeigneten Entwicklungsstand angerissen und plattiert, um die enthaltenen Zellen freizusetzen.

Anschließend werden die zerquetschten Hoden fixiert und danach in primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Der letzte Schritt besteht darin, das Gewebe auf einem Objektträger zur Bildgebung aufzubringen. Abschließend werden mit Phasenkontrast- oder Immunfluoreszenzmikroskopie Zellen in verschiedenen Stadien der Spermatogenese hinsichtlich Defekte und Morphologie sowie die subzellulären Lokalisationen verschiedener Proteine untersucht.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung entscheidender Funktionen von Proteinen während des Verlaufs der Spermatogenese. Eine visuelle Darstellung der Dissektion der Testes von RAs ist entscheidend, da ein Anfänger bei diesem Verfahren anfangs Schwierigkeiten haben könnte, die Testes im Abdomen der Fliege zu lokalisieren. Außerdem lässt sich die effektivste Methode zum Zerquetschen des Gewebes leichter demonstrieren als in Worten zu beschreiben.

Um die Dissektion zu beginnen, betäuben Sie Fliegen in einer Flasche oder einem Gefäß mit einem Strom aus Kohlendioxid. Anschließend überführen Sie die betäubten Fliegen auf ein Fliegenkissen. Sortieren Sie die Fliegen unter einem Stereomikroskop mithilfe eines kleinen Pinsels, um etwa sechs bis acht Oph-Männchen des gewünschten Genotyps zu sammeln.

Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette die Flügel von jeder Fliege. Dies verhindert, dass die Fliegen in der Flüssigkeit schwimmen. Geben Sie während der Präparation 500 µL gepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline oder PBS) als einzelnen Tropfen auf eine silikonbeschichtete Präparationsplatte mit schwarzem Hintergrund.

Danach die Pinzette in Richtung des vorderen Endes einer der entflügelten Fliegen führen. Diese am Thorax fassen und in den PBS-Tropfen eintauchen. Die dunkelbraune Struktur am hinteren Ende des ventralen Abdomens identifizieren und mit einem weiteren Paar Pinzetten greifen und die äußeren Genitalien nach posterior ziehen, bis sie sich vom Abdomen lösen.

In den meisten Fällen werden die Hoden, Samenbläschen und Nebendrüsen zusammen mit den äußeren Geschlechtsorganen aus dem Abdomen entfernt. Falls dies nicht der Fall ist, führen Sie ein Paar Pinzetten in das Abdomen ein und lösen vorsichtig die Hoden heraus. Trennen Sie die Hoden mithilfe von zwei Paar Pinzetten von den Nebendrüsen und den äußeren Geschlechtsorganen.

Unterscheiden Sie Wildtyp-Testes anhand ihrer gelben Farbe von dem angrenzenden weißen Gewebe. Um die Probe für die Live-Bildgebung vorzubereiten, platzieren Sie mit einer Pinzette vorsichtig zwei bis drei Paare von Testes in einen Tropfen von vier bis fünf Mikrolitern PBS auf einem quadratischen Glas-Objektträger. Danach reißen Sie.

Öffnen Sie jedes Hodenorgan mit einer Pinzette auf einer geeigneten Höhe, um die Präsenz der gewünschten Keimbahnzelltypen in der Präparation zu maximieren. Der Inhalt der Hoden tritt aus der aufgerissenen Region auf den Objektträger aus. Während des Andrückens, um Spermatogonien und Spermatocyten anzureichern, öffnen Sie die Hoden in der Nähe ihrer apikalen Spitze.

Für Spermatozyten und Spermatiden öffnen Sie die Hoden an einer leicht basaleren Position zur Ebene eins, um reifere Keimbahnzellen anzureichern. Öffnen Sie die Hoden näher an der Stelle, an der die Krümmung beginnt. Der nächste Schritt besteht darin, die Hoden zu plattieren, indem Sie vorsichtig ein Objektträger über die Deckglasabdeckung legen.

Üben Sie keinen manuellen Druck aus und vermeiden Sie das Einschließen von Luftblasen. Verwenden Sie die Probe innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung, um lebende Zellen zu beobachten. Wickeln Sie mittels Phasenkontrastmikroskopie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas mit einem Reinigungstuch ab, um eine Ebenung der Präparation zu ermöglichen, bis die Keimzellen scharf im Fokus sind.

Kühlpräparate, die zerquetschte Hoden enthalten, mit einer Metallzange in flüssigen Stickstoff eintauchen, bis das Blubbern des flüssigen Stickstoffs aufhört, um sie schnell einzufrieren. Die Deckglasabdeckung sofort mit einem Rasiermesser entfernen. Anschließend die Objektträger mit der Metallzange in einen vorab gekühlten Glaspräparatbehälter übertragen, der mit eiskaltem 95 %igen Ethanol gefüllt ist, und die Probe 10 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Überführen Sie die äquilibrierten Objektträger in einen Glasobjektträgerhalter, der mit 4 % Formaldehyd in PBS plus 0,1 % Triton X-100 oder PBST gefüllt ist, und lagern Sie sie sieben Minuten lang bei Raumtemperatur. Anschließend überführen Sie die Objektträger in einen Halter, der mit PBS gefüllt ist. Waschen Sie die Objektträger fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBS, indem Sie die Lösung im Halter verwerfen und durch frische PBS-Lösung ersetzen.

Wiederholen Sie die Wäsche einmal. Entsorgen Sie das PBS und tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten bei Raumtemperatur in PBST ein, um die Zellmembranen zu permeabilisieren. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur. Ziehen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis um das Zerquetschungsgewebe auf dem Objektträger, um die Antikörperlösungen zu begrenzen und das Gewebe während der Immunfärbung stets feucht zu halten.

Anschießend 30 bis 40 Mikroliter Primärantikörper, verdünnt in PBST, zum Gewebe innerhalb des Kreises hinzufügen. Die Probe im feuchten, dunklen Kammer zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, nach der Inkubation mit dem Primärantikörper. Die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit PBS waschen.

Anschießend 30 bis 40 Mikroliter einer in PBS verdünnten, konjugierten sekundären Antikörperlösung der vierten Generation zum Gewebe hinzufügen und eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Danach die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit PBS waschen. Anschließend 30 bis 40 Mikroliter Dappy-Lösung innerhalb des Kreises auf das Gewebe geben.

Platzieren Sie vorsichtig ein Deckglas über das Gewebe und achten Sie dabei besonders darauf, keine Luftblasen einzuschließen. Sollten Luftblasen entstehen, bewegen Sie das Deckglas vorsichtig, ohne die Probe zu beschädigen, bis die Blasen an den Rändern des Decks entweichen. Entfernen Sie überschüssiges Medium an den Rändern des Objektträgers mit einem Reinigungstuch.

Danach die Deckglaspräparation mit Nagellack versiegeln und die immunohistologisch gefärbten Zellen innerhalb von drei bis vier Stunden mit einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen. Diese Zeichnung zeigt die Lokalisation verschiedener Stadien der Zellreifung im Drosophila-Testis. Stufe eins enthält jüngere Zellen, die sich in frühen Phasen der Spermatogenese befinden, während Stufe drei die ausgereifteren Spermienzellen umfasst.

Die Ebene zwei enthält eine gemischte Population von mitotischen und postmitotischen Keimbahnzellen. Ein entsprechendes Phasenkontrastbild zeigt die Freisetzung von Spermatogonien sowie frühen und späten primären Spermatozyten, wenn der Hoden in Ebene eins aufreißt. Der gelbe Pfeil zeigt außerdem auf eine Fusion von zwei oder mehr miteinander verbundenen Zellen infolge einer unvollständigen Zytokinese.

Ein Artefakt des hier gezeigten Zerquetschungsverfahrens ist ein entsprechendes Phasenkontrastbild, das die Freisetzung von späten primären Spermatocyten und postmitotischen Zellen zeigt, einschließlich runder Spermatiden, sich verlängernder Spermatiden und reifer Spermien, wenn die Testes auf der zweiten Ebene einreißen. Die Phasenkontrastmikroskopie von zerquetschten Testes kann ebenfalls verwendet werden, um Defekte in der zahlreichen runden Spermatidenphase leicht zu identifizieren. Wilde Typ-Spermatiden mit einem phasenhellen Kern sind hier angeheftet an ein phasendunkles einzelnes mitochondriales Aggregat von ungefähr gleicher Größe dargestellt.

Im Gegensatz dazu enthalten die Spermatiden aus Aun-Testes mehrere kleine Kerne und ein großes mitochondriales Aggregat, was auf eine fehlgeschlagene Zytokinese und Fehler bei der Chromosomen-Segregation zurückzuführen ist. Die hier gezeigten Graustufenbilder stammen aus einer Präparation von zerdrückten Testes, die mit Reagenzien gefärbt wurden, um Mikrotubuli, DNA und Zentrosomen farblich sichtbar zu machen. Die kombinierten Bilder zeigen einen sich teilenden Spermatocyten, ein großes Feld runder Spermatiden sowie ein Bündel reifer Spermien. Nach Beherrschung der Probenvorbereitung für die Phasenkontrastmikroskopie kann die Mikroskopie innerhalb von 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden.

Die Vorbereitung von Proben für die Immunfluoreszenzmikroskopie kann innerhalb von sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Zusätzlich zur Aufarbeitung von Oph-Hodengewebe für die Mikroskopie können die dissezierten Hoden alternativ für die biochemische Analyse von Proteinen verwendet werden.