Name: Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-09T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Lernen Sie die Blinddarm-Ligation und Punktion bei Mäusen zur Induktion von Sepsis und Untersuchung der Autophagie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Autophagosomen in Geweben mittels Elektronenmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse HL108801 P01, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, AMK Choi unterstützt. S. Ryter erhielt Unterstützung von der Gehalts Lovelace Respiratory Research Institute.

Hinweis: Die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Brigham and Womens Hospital / der Harvard Medical School Raums zugelassenen die folgenden Verfahren. 1. Blinddarm-Ligation und Punktion Verwenden Mäusen des gleichen Hintergrund (C57Bl / 6), männlich, 8-10 Wochen alt. Weibliche Mäuse sind widerstandsfähiger als Männer gegen die Sepsis-induzierten Letalität. Mäuse älter als 8 Wochen produzieren weniger unterschiedliche Ergebnisse als jüngere Mäuse in Bezug auf die Überlebensrate nach CLP. Etwa N = 10 Mäuse pro Gruppe sollte im Vergleich zur Überlebensanalyse verwendet werden. N = 3-5 Mäusen ist ausreichend für die Autophagie-Assays. <ol><li> Verwenden Sie sterile kleine chirurgische Instrumente (nämlich Skalpell, Schere und Pinzette stumpf anatomische), die für Nager Chirurgie geeignet sein sollte. </li><li> Bereiten Anästhesie Mischung: Um 7.95 ml PBS hinzufügen 150 ul Xylazin (AnaSed Injektion von 100 mg / ml) und 700 ul von Ketamin (Ketaset &#160; CIII, 100 mg / ml). </li><li> Um aseptischen Bedingungen während des Verfahrens zu gewährleisten, Handschuhe, Gesichtsmaske und OP-Kittel. </li><li> Wiegen Tiere. Anesthetize sie durch die Injektion intraperitoneal (ip) die in Schritt 3 in einer Dosierung von ul (10x Körpergewicht in g) genannten Mischung. Zum Beispiel für eine Maus mit einem Gewicht von 22 g, zu verwalten 10x22 = 220 ul der Mischung von Anästhetika. Somit werden die endgültigen Dosen von Xylazin und Ketamin 17 und 80 mg / kg Körpergewicht. Stellen Sie sicher, dass die Narkose ausreichend ist, keine Beugung der Extremität sollte nach Zehe Prise hergestellt werden. Hinweis: Verwenden Sie Augensalbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. </li><li> Zeigen Tiere auf eine saubere Arbeitsfläche auf dem Rücken. Tails und Hinterpfoten sind auf die Ermittler ausgerichtet. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit Alkohol (70% EtOH-Lösung). Hinweis: Chirurgische Bereich sollte komplett rasiert werden, um eine Verunreinigung der Wunde durch den Kontakt mit vermeidenFell. Auch optimal, eine zirkulierende Warmwasser-Pad sollte zur Normothermie von betäubten Mäusen während der Operation beibehalten werden. </li><li> Durch die Verwendung eines Skalpells, machen Sie einen kleinen Hautschnitt in Längsrichtung parallel und ca. 1 cm links der Mittellinie. Noch nicht eindringen in die Bauchhöhle. Verwenden Sie kleine Schere, um die anfängliche Schnitt verlängern. </li><li> Identifizieren Bauchmuskeln und zu zerlegen, den Zugang in die Bauchhöhle zu gewinnen. </li><li> Durch die Verwendung von stumpfen anatomische Pinzetten, identifizieren den Blinddarm und verschieben Sie sie aus der Bauchhöhle. Seien Sie vorsichtig, nicht zu mesenterialen Blutgefäße beschädigen (dies kann zu tödlichen Blutungen führen kann). </li><li> Ligieren 60% der Blinddarm, eine Mitte-Grade-Sepsis zu erzielen. Ligation von gleich oder mehr als 75% des Blinddarms führt in der Regel hochwertige Sepsis, während Ligation von gleich oder weniger als 25% der Blinddarm Ergebnisse in low-grade Sepsis. Achten Sie darauf, die lleozökalklappe (dies könnte die Darmkontinuität zu blockieren) zu ligieren. </li><li> Durch die Verwendung eines21 G Nadel perforieren Blinddarm von einem durch und durch Punktion (zwei Löcher) in der Nähe der Ligation. Die Richtung der Perforation sollte der mesenterialen der Anti mesenterialen Seite des Blinddarms sein. Seien Sie vorsichtig, nicht zu mesenterialen Blutgefäße durchstechen. </li><li> Entfernen Sie die Nadel. Drücken Sie vorsichtig die ligiert Blinddarm, um die Durchgängigkeit durch die beiden Löcher zu bestätigen, nur eine kleine Menge von Fäkalien sollte durch sie extrudiert werden. </li><li> Bewegen Sie den ligiert und punktiert Blinddarm in die Bauchhöhle. Hinweis: Für Schein Mäuse, überspringen Sie die Schritte von 1,10 bis 1,12. </li><li> Verwenden Seide chirurgisches Nahtmaterial 6-0 mit Schneid Nadel Bauchmuskulatur zu schließen. Verwenden Seide chirurgisches Nahtmaterial 6-0 mit Schneid Nadel Bauchhaut zu schließen. </li><li> Spritzen 1 ml vorgewärmten (37 ° C) normaler Kochsalzlösung ip, Wärme-und Flüssigkeitszufuhr während des Verfahrens verloren zu ersetzen. Legen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe, bis ihre Lungen-Wiederbelebung. Hinweis: Optimal ist ein sicherer Wärmegerät (such als zirkulierendes warmes Wasser Pad) kann anstelle einer Wärmelampe verwendet werden. </li><li> Postoperativ injizieren Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht sc). Analgesie zu erreichen. Hinweis: Ein Tier sollte nicht unbeaufsichtigt bleiben, bis er wieder zu Bewusstsein kam, um ausreichend Brustlage zu halten. Ein Tier, das eine chirurgische Behandlung unterzogen wurde, nicht auf die Firma von anderen Tieren, bis sie vollständig zurückgewonnen. </li><li> Zeigen Tiere zurück in ihre Käfige mit unbegrenztem Zugang zu Nahrung und Wasser. Mäuse eingeschläfert werden, wenn sie moribund (von klinischen Zeichen wie Fehler zu bewegen, wenn sie berührt oder Zyanose bezeichnet) zu werden. Überprüfen Mäuse alle 4 Stunden zu vermeiden, dass sie vor der Euthanasie sterben. </li></ol> 2. Tissue Ernte und Fixation <ol><li> Bereiten Sie eine 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung: Um 889 ml PBS hinzufügen 111 ml 37% PFA. </li><li> Sacrifice Mäuse entweder mit CO 2-induzierte Narkose oder Ketamin / Xylazin slösung in einer hohen Dosierung. </li><li> Immobilisieren die Mäuse auf eine saubere Arbeitsfläche. Sprühen Sie die Bauch-und Brusthaut mit 70% EtOH-Lösung, um es zu desinfizieren. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell und eine kleine Schere, um den Bauch-und Brusthaut sowie die Haut, die den Luftröhrenbereich zu entfernen. </li><li> Reveal Luftröhre durch Entfernen der umliegenden Gewebe (Muskeln und Bindegewebe). </li><li> Legen Sie eine Naht (ohne Schneid Nadel) um die Luftröhre. Weiß noch nicht festziehen. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen peripheren Venenkatheter (20 G) auf &#39;intubieren &quot;Luftröhre. Seien Sie vorsichtig, während der Katheter an Luftröhren Träne zu vermeiden. Beachten Sie, dass der größte Durchmesser der Luftröhre ist gerade unterhalb des Ringknorpels. </li><li> Ziehen Sie den Faden um die Luftröhre / Katheter. Nach Entfernen der Nadel so dass nur die Kunststoffkanüle der Katheter in die Trachea. Nadel diente nur als Führungsdraht zum Einsetzen der Kunststoffkanüle. </li><li> Nachdem die Kunststoffkanüle in die Luftröhre gesichert, schneiden the Bauchmuskulatur, öffnen Sie den Bauch und zeigen die Membran. </li><li> Mit einer Nadel punktieren die Membran Pneumothorax (dh Einsetzen von Luft in die Brusthöhle) zu produzieren. Lungen sollten dann zusammengelegt werden. </li><li> Mit einer kleinen Schere, entfernen Sie die Membran entlang des Brustbeins (Sternotomie) schneiden, entfernen Sie den Brustkorb und zeigen das Herz und die Lunge. </li><li> Durch die Kunststoffkanüle in die Trachea eingeführt, fixieren die Lungen mit der Formaldehydlösung unter 30 cm H 2 O Druck. </li><li> Entfernen Sie die Lungen und legen Sie sie in die 4% PFA für 24 h und anschließend in 70% EtOH-Lösung bis zur Verarbeitung. </li><li> Suchen und entfernen Sie Herz, Leber und Nieren. In gleicher Weise stellen sie in 4% PFA für 24 Stunden und anschließend in 70% EtOH-Lösung bis zur Verarbeitung. </li></ol> 3. GFP-Mäuse und Anzeigen von GFP Slides <ol><li> Führen CLP-und Scheinoperation auf GFP-LC3-Mäuse wie in Schritt 1 und postoperative Verfahren beschriebens wie in Schritt 2 des Protokolls beschrieben. </li><li> Betten Sie das Gewebe (insbesondere Lunge, Herz, Leber und Nieren) in Paraffin und schneiden Sie sie in Serien 5 um Abschnitte. </li><li> Wenn Sie bereit sind für GFP-Färbung, Inkubation bei 60 ° C für 30-60 Minuten, bis Paraffin schmilzt und Gewebe scheint scheinend. </li><li> Entparaffinieren mit Standard abgestufte Reihe von Xylol oder Xylol ersetzt, 5 min Xylol 1, 2 Xylol und Xylol 3 dann 3 min Inkubation in abgestuften Reihe von EtOH: 100%, 95%, 75%, und dann spülen in destilliertem Wasser. Hinweis: Nach Entparaffinierung vermeiden Gewebeaustrocknung, die Probe Hintergrund erhöht. </li><li> Antigen-Wiedergewinnung durchzuführen unter Verwendung von Zitronensäure-Puffer (10 mM Natriumcitrat Säure, 0,05% Tween 20, pH 6,0), durch die Mikrowelle für 10-20 min. Achten Sie darauf, in regelmäßigen Abständen zu ersetzen, um Puffergewebeaustrocknung zu vermeiden. </li><li> Anschließend Lösung für 20 Minuten auf der Bank zu kühlen, um Antigen-Retrieval abzuschließen. </li><li> 2-3x Waschen mit PBS. Überschüssigen Puffer und transfer gleitet von der Zahnstange in die horizontale Position in einer Dia-Box oder anderen feuchten Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Block 45-60 min bei Raumtemperatur mit 10% normalem Eselserum (auch 5% Rinderserumalbumin, oder bevorzugt Serum aus dem Tier, in dem der sekundäre Antikörper erzeugt wurde) in PBS. </li><li> Verwendung von Primär GFP Antikörper inkubieren einer Verdünnung von 1:100 in PBS über Nacht bei 4 ° C in der feuchten Kammer. Kleine Stücke von Parafilm über Gewebe sanft an mit Antikörper homogene Kontakt mit dem Gewebe fördern und verhindern, dass die Verdunstung. Hinweis: Verbleibende Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. </li><li> 5x Waschen mit PBS, um überschüssige primäre Antikörper zu entfernen. Inkubieren mit sekundärem Antikörper 1:500-1:1,000 in PBS für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> 5x Waschen mit PBS, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen. Falls gewünscht, Gegenfärbung der Objektträger bei diesem Schritt. </li><li> Wenn unter Verwendung von fluoreszierenden sekundären Antikörper, Inkubation 0,1% Sudan Schwarz in 70% EtOH foder 15-20 min auf Autofluoreszenz zu reduzieren. Wischen Sie überschüssiges Sudan Schwarz aus aller Gewebe und waschen 5x mit PBS über 20 min. </li><li> Montieren Probe mit Deckglas und horizontal zu speichern, bis Montagelösung gesetzt hat. </li></ol> 4. Alternative Protokoll: Direkter Nachweis von GFP-LC3 <ol><li> Kanülieren und blasen Lunge mit ~ 500 ml 50/50 v / v Oktober PBS. </li><li> Im Oktober, indem eine kleine Menge von Oktober in den Boden einer cryomold einbinden. </li><li> Legen Sie das seziert Lungenkomplex in der Form. </li><li> Langsam frieren unter Verwendung von Trockeneis über Methyl gekühlt. </li><li> Noch Oktober, bis das Gewebe vollständig bedeckt und eingefroren solide. Halten Sie auf Trockeneis und bei -80 ° C </li><li> Mit einem Kryomikrotom, schneiden 5-10 um dicke Schnitte Schutz der Abschnitte aus Licht. Speicherabschnitte und die verbleibenden Gewebe bei -80 ° C. </li><li> Um Folien für die Bildgebung vorzubereiten, entferne Abschnitt aus dem Gefrierschrank und einem Tropfen PBS sofort anwenden, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Fix für 30 min mit 4% PFA. Mit PBS waschen. </li><li> Bewerben DAPI / Hoechst für 10 min. 3x Waschen mit PBS. </li><li> Montieren Probe mit Deckglas und horizontal zu speichern, bis Montagelösung gesetzt hat. </li><li> Bild mit Epi-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop. Proben bei 4 ° C für bis zu einem Monat. </li></ol> 5. Herstellung von Seiden für Elektronenmikroskopie <ol><li> Schneiden Gewebe in etwa 1 mm Würfel zur Befestigung. </li><li> Fix das Gewebe in 2% Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4. </li><li> Waschen mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für 1-2 Std. Hinweis: Fest Gewebe in 0,1 M Natriumcacodylat bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Sende fix in 1% Osmiumtetroxid in 0,2 M Natriumcacodylatpuffer für 1 Stunde. </li><li> Spülen in 0,2 M Natriumkakodylat-Puffer für 10 min 3x. </li><li> Entwässern in 70% EtOH, 20 min 2x. Entwässern in 90% EtOH, 10 min 2x. Entwässern in 100% EtOH,2x 20 Minuten. </li><li> Inkubation mit Propylenoxid (Epoxy Propan) für 10 min 2x. </li><li> Inkubieren mit Propylenoxid / Epoxyharz-Mischung (50:50) für 1 Stunde. Das Epoxidharzgemisch ist: 24 g Agar 100 Harz, 13 g Dodecenylbernsteinsäureanhydrid, 13 g Methylnadinsäureanhydrid und 1 ml N-Benzyldimethylamin. Gründlich mischen in einem Einweg-Becher mit einem Holzspatel. </li><li> Inkubation mit Epoxidharz über Nacht unverschlossen in Fläschchen (dies kann jeder restliche Propylenoxid verdampfen). </li><li> Bei markiertem Kapseln mit frisch zubereiteten Harz einbetten. Polymerisation bei 60 ° C für 48 Stunden. </li><li> Foto Gewebeschnitten unter Verwendung eines Transmissions-Elektronenmikroskops bei 80 oder 60 kV auf Elektronenmikroskop Film. Drucken Sie die Bilder auf Fotopapier oder als digitale Medien zu speichern. </li><li> Analysieren Autophagosom Bildung in intakten Zellen Kern mit. Niedriger Energiefelder (e. G. 2.000-4.000 X) kann verwendet werden, um kernhaltigen Zellen zu identifizieren. Typischerweise 6,800-10,000 X Bilder für th verwendetist Autophagosom Quantifizierung. Graf Autophagosomen pro Flächeneinheit von 15 bis 30 Felder für entsprechende statistische Darstellung. Autophagosomen haben Doppel-Membran-Struktur, in der späten Phase autophogosomes glich gefüllter Vakuolen. </li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb zu erklären

Der große Vorteil des CLP ist, dass es erlaubt Forschern, Sepsis unterschiedlicher Schweregrade (dh von Low-bis Mid-und High-grade) zu untersuchen. Der Schweregrad der induzierten Sepsis wird durch die Länge der Blinddarm ligiert (was die wichtigste Determinante) betroffen, die Größe der Nadel für die Punktion verwendet, und die Anzahl der Löcher 15 durchgeführt. Darüber hinaus kann die Maus-Stamm und Geschlecht von der Schwere der Sepsis beeinflussen; mehrere Stämme sind anfälliger als andere und Mä...

Sepsis, eine systemische entzündliche Reaktion auf eine Infektion, eine der häufigsten Todesursachen bei kritisch-kranken Patienten ein. Intra-abdominale Infektionen, die oft polymikrobiellen Sepsis führen, entfallen 20% der Sepsisfälle, die erhebliche Sterblichkeit von bis zu 60% 2 haben. Sepsis-assoziierte Mortalität resultiert im Wesentlichen aus Multi-Organ-Dysfunktion mit anschließender Organversagen 3,4. Weitere Untersuchungen in den Pathomechanismus dieser Erkrankung ist dringend erforderlich, um die Entwicklung neuer und wirksamere Therapien zu fördern. Die Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Modellierung von Sepsis in vivo. Wie der Blinddarm ist voll von Bakterien, seiner Punktion ergibt polymikrobiellen Peritonitis, Translokation von Bakterien in das Blut (Bakteriämie), septischer Schock, Multi-Organ-Dysfunktion und schließlich Tod 5. Es ist allgemein anerkannt, daß CLP reflektiert klinischenRealität genauer als frühere Verfahren, wie Injektion von Endotoxin oder gereinigten Bakterien in Nagetieren Somit CLP wird als Goldstandard (wenn auch nicht ohne Einschränkungen) 6 für die experimentelle Induktion und somit die Untersuchung der Pathogenese von Sepsis. In dieser Monographie, beschreiben wir Protokolle entwickelt, um zu beurteilen, ob pathogene Mechanismen der Sepsis sind Autophagie. Autophagy eine evolutionär konservierte zelluläre Prozess erleichtert den Umsatz von beschädigten Proteinen und Organellen, wie Mitochondrien und spielt eine wichtige Rolle bei der Clearance von intrazellulären Pathogenen wie Bakterien 7,8. Während Autophagozytose sind cytosolische Proteine ​​oder Organellen in die Doppelmembran-Vesikel gebunden genannt autophagosomes, die anschließend zu den Lysosomen zum Abbau 9 geliefert werden abgetrennt. Eine Reihe von Proteinen, wie den Säugerhomologen Autophagozytose-Genen (ATG) identifiziert,ursprünglich in der Hefe, die den Prozess der Autophagie regulieren identifiziert. Die Umwandlung von Mikrotubuli-assoziierten Protein-1-Leichtketten-3B (LC3B) (Homolog Atg8) aus LC3B-I (freie Form) zu LC3B-II (Phosphatidylethanolamin-konjugierter Form) stellt einen wichtigen Schritt in Autophagosom Bildung 9. Autophagische Dysfunktion ist mit dem Altern und der menschlichen Krankheiten, darunter Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen 10 zugeordnet. Darüber hinaus wirkt sich die Autophagie angeborenen und erworbenen Immunität, wie Antigen-Präsentation, Lymphozytenentwicklung und Zytokin-Sekretion von Immunzellen 8. So scheint es sinnvoll, dass die Autophagie könnte auch in der systemischen Entzündungsreaktion auf eine Infektion (zB bei Sepsis) eine Rolle spielen. Bisher mehrere Verfahren beschrieben worden, um die Rolle der Autophagie in Gewebeverletzung in vivo zu beurteilen. Dazu gehören der Einsatz der grünen Fluoreszenz-Protein (GFP)-LC3 exprimierenden Mäusen und die Quantifizierung der AutoPhagosomen in Gewebe durch Elektronenmikroskopie (Diese beiden Verfahren werden in dieser Monographie beschrieben). Weitere Methoden sind die Quantifizierung von Autophagie-Protein-Expression in Gewebehomogenaten, und die Analyse der Autophagie Fluss (wie an anderer Stelle beschrieben), 11-13. Das Ziel dieser Überprüfung ist es, für die Beurteilung der aktuellen Protokolle Autophagie in vivo im Rahmen der experimentellen Sepsis.

<table><tbody><tr><td>GFP-LC3 Transgene Mäuse</td><td>Riken (Japan)</td><td>RBRC00806</td><td>GFP-LC3#53</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Henry-Schein</td><td>568-0606</td><td>Xylazin HCl Injektion Tierarzt</td></tr><tr><td></td><td>Ketamin Henry-Schein</td><td>995-2949</td><td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher</td><td>A405-20</td><td>Histologie</td></tr><tr><td>Grade EtOH</td><td>Fisher</td><td>A407-1</td><td>Zur Sterilisation</td></tr><tr><td>Chirurgisches Nahtmaterial aus Seide 6-0</td><td>Owens & Minor</td><td>2300-0078OG, 017624</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin-HCl</td><td>Henry-Schein</td><td>614-5157</td><td>Buprenex Ampullen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (37%) Lösung</td><td>JT Baker</td><td>S898-09</td><td></td></tr><tr><td>Xylole</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL </td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-GFP-Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Sigma</td><td>944403</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR scientific</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-203760</td><td></td></tr><tr><td>EM grade Glutaraldehyd 2,5% in Natriumcacodylat</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15960</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>Sigma</td><td>240397</td><td></td></tr><tr><td>Agar 100 Harz</td><td>Agar wissenschaftlich</td><td> R1045</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenylbernsteinsäureanhydrid</td><td>Sigma</td><td>46346</td><td></td></tr><tr><td>Methylnadsäureanhydrid</td><td>Sigma</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>N-Benzyldimethylamin</td><td>Sigma</td><td>185582</td><td></td></tr></tbody></table>

blinddarm-ligation und punktion-induzierten sepsis als modell zur autophagie in mäusen untersucht

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode, die Sepsis verursacht polymikrobiellen induziert werden. Hier wird ein Protokoll vorgesehen, um Sepsis unterschiedlichen Schweregrades in Mäusen zu induzieren mit der CLP Technik. Autophagie ist ein Grundgewebereaktion auf Stress und Krankheitserreger Invasion. Zwei Stromprotokollen zu Autophagozytose in vivo im Rahmen des experimentellen Sepsis beurteilen sind auch hier vorgestellt. (I) Transgene Mäuse, grün fluoreszierendes Protein (GFP)-LC3-Fusionsprotein exprimieren, werden CLP unterworfen. Lokalisierten Erhöhung der GFP-Signal (puncta), entweder durch immunhistochemische Assays getestet oder konfokalen kann verwendet werden, um verbesserte Bildung Autophagosom erfassen und somit verändert Aktivierung der Autophagie werden. (II) Verbesserte autophagischen Vakuole (Autophagosom)-Bildung pro Einheit Gewebebereich (als Marker der Autophagie Stimulation) kann mit Hilfe der Elektronenmikroskopie quantifiziert werden. Das Studium der Autophagie Antworten auf Sepsis ist eine kritische Layoutonent Verständnis der Mechanismen, durch die Gewebe reagieren auf eine Infektion. Forschungsergebnisse in diesem Bereich kann letztendlich zum Verständnis der Pathogenese der Sepsis, die ein großes Problem in der Intensivmedizin stellt beitragen.

Bakteriämie bei Mäusen vorhanden ist, so früh wie 6 Stunden nach der CLP-induzierten Sepsis 14. Klinische Zeichen einer Sepsis (einschließlich Schüttelfrost, Tachypnoe und eingeschränkte motorische Aktivität) erscheinen etwa 12 Stunden nach dem Eingriff. Mäuse CLP unterworfen beginnen bei rund 18 Stunden nach Induktion der Peritonitis sterben. Je schwerer ist die Sepsis die mehr erhöht ist die Letalität 15. Im Detail führt hochwertige Sepsis 100% Mortalität innerhalb von 2-3 Tagen, während Mitte-Gr...

Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ausgelöst werden. Aktuelle Protokolle Autophagozytose in vivo im Rahmen des CLP-induzierten Sepsis beurteilt werden hier vorgestellt: Ein Protokoll für die Messung unter Verwendung Autophagozytose (GFP)-LC3 Mäuse und ein Protokoll für die Messung Autophagosom Bildung durch Elektronenmikroskopie.

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Sepsis durch Ligatur und Punktion des Blinddarms bei Mäusen zu induzieren, um die Gewebeautophagie zu untersuchen, einen homöostatischen Prozess, der den Umsatz beschädigter Proteine und Organellen fördert. Dies wird erreicht, indem zunächst der Blinddarm identifiziert und aus der Bauchhöhle der anästhesierten Maus herausbewegt wird. Nach der Isolierung wird 60 % des Blinddarms ligiert und anschließend perforiert, um eine mittelschwere Peritonitis auszulösen.Das ligierte und punktierte Seum wird wieder in die Bauchhöhle zurückgelegt und das Tier darf sich erholen. Im letzten Schritt werden 24 Stunden später die Lungengewebe, Leber und Nierengewebe des septischen Tieres entnommen. Abschließend wird mittels Elektronenmikroskopie die Bildung von Autophagosomen in intakten Zellen aus den entnommenen Geweben des septischen Tieres dargestellt.Wir stellen die Sichel-Ligation und Punktur oder CLP als Methode zur Induktion von Sepsis und zur Untersuchung der Autophagie vor. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber früheren Methoden wie der Injektion von Endotoxin liegt in ihrer klinischen Relevanz. Die CLP führt zu einer Peritoni

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Mausmodell der Blinddarm Ligatur und Punktion als ein wertvolles Instrument für das Studium der menschlichen Sepsis.

Blinddarm Ligation Punktion

Sepsis bezieht sich auf eine systemische inflammatorische Reaktion, die sich aus einer mikrobiellen Infektion, und simuliert werden können durch eine Blinddarm-OP-Technik bezeichnet Ligatur und Punktion (CLP). Hier beschreiben wir eine Methode zur CLP-induzierte Tiermodell zu verwenden, um Heilkräuter für therapeutische Wirkstoffe zu screenen.

Die Verwendung Tiermodell für Sepsis zu neuartigen Therapien zu beurteilen Herbal

Um Krankheitserreger Verbreitung entgegenzuwirken, Wirtszellen neu zu organisieren, um Bakterien ihre Zellskelett compartmentalize und induzieren Autophagie. Verwendung Shigella Infektion von Gewebekulturzellen, Wirt und Pathogen Determinanten dieses Verfahren zugrunde liegen, werden identifiziert und charakterisiert. Mit Zebrafisch-Modelle von Shigella-Infektion, sind die Rolle der entdeckten Moleküle und Mechanismen in vivo untersucht.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Hier präsentiert sich ein Protokoll zum Eingang des bakteriellen abgeleitete Verbindungen nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren. Eine niedrige subletale Dosis von Lipopolysaccharid injiziert wurde systemisch in Mäuse, die 24 h nach der Injektion beobachtet wurden. Der Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten in Milz, Leber und Darm bestimmt.

Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, Eingang des mikrobiellen gewonnenen Erzeugnisse nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren

Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Messung von infektiösen Ergebnissen, die sekundären Krankenhausinfektionen im immunsuppressiven Zustand zugrunde liegen, indem sie zunächst Cecal-Ligations-/Punktionsmäuse einrichten und sie mit intranasalen Infektionen herausfordern, um ein klinisch relevantes Modell der Immunsuppressionssepsis zu erstellen.

Design von Cecal Ligation und Punktion und Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Dieses Protokoll stellt die operativen Details der Stuhlligatur und -punktion (CLP) in einem Mausmodell der Sepsis dar. CLP ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken, um ein Tiermodell für Sepsis zu erstellen. Daher ist ein standardisiertes CLP-Protokoll erforderlich, um zuverlässige Forschungsergebnisse zu erzielen.

Bewertung eines zuverlässigen Biomarkers in einem Stuhlligatur- und Punktions-induzierten Mausmodell der Sepsis

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer gramnegativen monobakteriellen Sepsis in einem Mausmodellsystem. Das Modell ist nützlich bei der Untersuchung der entzündlichen und tödlichen Wirtsreaktionen während der Sepsis.

Charakterisierung der Salmonella Typhimurium-induzierten septischen Peritonitis bei Mäusen

Dieses Mausmodell kombiniert einen septischen Insult mit dem Ausfall der Hintergliedmaßenmuskulatur, um das bettlägerige Merkmal des typischen septischen Patienten zu rekapitulieren. Das Modell stellt eine deutliche Abkehr von früheren Modellen zur Untersuchung von Muskelfunktionsstörungen bei Sepsis dar und ist ein reproduzierbarer Ansatz zur Behandlung dieser Erkrankung.

Ein präklinisches Modell der Sepsis-induzierten Myopathie mit Nichtanwendung bei Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines Maus-Sepsis-Immunsuppressionsmodells mittels intranasaler Instillation von Klebsiella pneumoniae vor und validieren das Modell anhand verschiedener Indikatoren.

Etablierung eines von Maus-Sepsis induzierten Immunsuppressionsmodells durch intranasale Instillation von Bakterien

Lernen Sie die Blinddarm-Ligation und Punktion bei Mäusen zur Induktion von Sepsis und Untersuchung der Autophagie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Autophagosomen in Geweben mittels Elektronenmikroskopie.

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

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