Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein In-vitro- Einhaltung Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fähigkeit einer probiotischen Streptokokkenzelle levarius zu untersuchen, die Adhärenz von Pneumokokken an eine Epithelzelllinie zu hemmen. Dies wird erreicht, indem zunächst CCL 23 Epithelzell-Monoschichten hergestellt werden. In einer 24-Well-Platte werden anschließend slowakische und Pneumokokken nacheinander zur Monoschicht hinzugefügt und die Zellen inkubiert.

Im letzten Schritt werden die Vertiefungen gewaschen, um die nicht anhaftenden Bakterien zu entfernen. Die Epithelzellen von CCL 23 werden lysiert und der Inhalt der Vertiefung wird geerntet. Letztendlich kann der Einfluss des Speichels auf die Pneumokokken-Adhärenz durch Quantifizierung der Anzahl der zellassoziierten Pneumokokken bewertet werden.

Diese Methode hilft bei der Beantwortung zentraler Fragen im Bereich der Infektionskrankheiten, z. B. ob Probiotika die Anhaftung von bakteriellen Krankheitserregern wie dem Pneumokokken hemmen können. Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir begannen, die mögliche Verwendung von Lactobacillus hypnosis, GG und anderen Probiotika in den Atemwegen zu untersuchen. Am Tag vor dem Experiment werden CCL 23 Epithelzellen in Kultur von Konfluenzzellen aufgeteilt und dann in Prewarm-Medien auf eine Konzentration von 150.000 Zellen pro Milliliter in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchen verdünnt.

Als nächstes säen Sie einen Milliliter der Zellen pro Vertiefung in eine behandelte 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Zellen über Nacht. Dann mit einer 10-Mikroliter-Schlaufe 10 bis 12 gut getrennte Kolonien jeder Bakterienkultur in ein 10-Milliliter-Aliquot aus Todd-Hewitt-Brühe plus 0,5 % Hefeextrakt impfen. Die Kulturen am Tag des Experiments kurz vortexen und 14 bis 16 Stunden inkubieren.

Jede der Bakterienkulturen drei bis fünf Sekunden lang vorreiben, dann 100 Mikroliter Pneumokokken und 100 Mikroliter Speichel in beschriftete vorwarme Röhrchen mit 10 Millilitern Brühe geben. Wirbeln Sie die beimpften Röhrchen drei bis fünf Sekunden lang vor und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, um die Kulturen bis zur mittleren logarithmischen Phase zu züchten. Nachdem Sie bestätigt haben, dass die CCL 23-Zellkultur zu mindestens 80 % flüssig ist, verwenden Sie die Transferpipette, um das Medium aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte zu entfernen, indem Sie die Platte leicht kippen, um eine Störung der Zellmonoschicht zu vermeiden, und waschen Sie die Vertiefungen zweimal, indem Sie etwa 500 Mikroliter vorgewärmtes PBS hinzufügen und die Flüssigkeit vorsichtig mit einer Transferpipette entfernen.

Kippen Sie die Platte während der Wäschen, um die Monoschicht nach dem zweiten Waschen zu erhalten. Geben Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes Medium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, während Sie die Bakterienkulturen vorbereiten. Messen Sie zunächst die optische Dichte von einem Milliliter der Levariuskultur bei Absorptionsmittel 600.

Dann werden fünf Milliliter der Sal-Levarius-Kultur in ein 10-Milliliter-Röhrchen überführt und vier Minuten lang bei 1.870 g bei Raumtemperatur von Röhrchen zu Röhrchen zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Snat-Resus wird das Pellet in 200 bis 1000 Mikrolitern Natriumchlorid mit Punkt 85 % je nach OD-Messwert bis zu einer Endkonzentration von etwa 1,5 mal 10 bis zur neunten koloniebildenden Einheiten pro Milliliter suspendiert. Die richtige Anzahl von Bakterien hinzuzufügen ist der schwierigste Teil des Experiments, da die tatsächliche Anzahl der hinzugefügten Bakterien erst am nächsten Tag bestimmt wird, wenn die Koloniezählung durchgeführt wird.

Übertragen Sie nun das resuspendierte Speichelinokulum in ein Mikrofuge-Röhrchen mit der Bezeichnung high. Verdünnen Sie die hohe Konzentration bei eins bis 10 und eins bis 100 in mehr 85 % Natriumchlorid, um mittlere und niedrige Konzentrationen von Alvar für die Assay-Wirbelröhrchen zwischen den Verdünnungen zu erhalten, um die Heparin-Kontrollwells zu erstellen. Entfernen Sie 40 Mikroliter Medium aus jeder Kontrollvertiefung und fügen Sie 50 Mikroliter Heparin zu einer Endkonzentration von 100 Einheiten pro Milliliter und Vertiefung hinzu.

Fügen Sie 10 Mikroliter Punkt, 85 % Natriumchlorid nur zu den CCL 23-Zellen hinzu, und die CCL 23-Zellen plus Pneumokokken verströmen nur alle Konzentrationen im SIV-Bereich vollständig. Geben Sie dann 10 Mikroliter unverdünnte Konzentrationen, einen zu 10 und einen zu 100 siv in verschiedenen Konzentrationen in die entsprechenden Vertiefungen, um den bakteriellen Kontakt mit der Zelle zu fördern. Zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 114 g bei Raumtemperatur und inkubieren Sie die Platte dann eine Stunde lang, während die Zellen inkubieren, verdünnen Sie den Speichelstock in Punkt 85 % Natriumchlorid und verwenden Sie einen sterilen Spreizer, um 100 Mikroliter der Verdünnungen von 10 auf minus fünf, 10 bis minus sechs und 10 bis minus sieben in doppelter Ausführung auf Pferdeblut-Agarplatten zu dispergieren.

Kultivieren Sie die Platten in einer umgekehrten Position über Nacht gegen Ende der Monoschicht als Salbe-Inkubation. Messen Sie die optische Dichte der Pneumokokken-Kultur und schleudern Sie dann einen Milliliter der Zellen herunter. Bei der Wiederbelebung wird das Pellet in 300 bis 2000 Mikrolitern Natriumchlorid mit einem Punkt von 85 % je nach OD-Messwert bis zu einer Endkonzentration von etwa 150 Millionen koloniebildenden Einheiten pro Milliliter suspendiert.

Geben Sie dann 10 Mikroliter unverdünnte Pneumokokken in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Negativkontrollvertiefungen, zentrifugieren Sie die 24-Well-Platte erneut und inkubieren Sie dann die Co-Kulturen während des Inkubationsschritts drei Stunden lang. Den Pneumokokken-Schaft in ähnlicher Weise wie Speichel seriell verdünnen und plattieren. Überprüfen Sie die Zellen nach dreistündiger Inkubation unter dem Mikroskop auf zytopathische Wirkungen.

Entfernen Sie nun das Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Co-Kulturen vorsichtig dreimal vorsichtig mit einem XPBS, um die nicht anhaftenden Bakterien zu entfernen, wobei Sie darauf achten müssen, die Monolayer nicht zu stören. Dann werden die Zellen mit 200 Mikrolitern 0,1 % sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingegraben. Fügen Sie als Nächstes 800 Mikroliter THB zu jedem hinzu.

Pipettieren Sie einige Male auf und ab und ernten Sie die Zellsuspensionen aus jeder Vertiefung in markierte Mikrozentrifugenröhrchen. Zum Schluss verdünnen Sie die anhaftenden Pneumokokken seriell und zählen die Kolonien dann am nächsten Tag auf den entsprechenden Verdünnungsplatten. Zur Quantifizierung der Pneumokokken und Alvar in dieser Tabelle werden die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments gezeigt, in dem die Pneumokokken eine Stunde nach der Zugabe von slowakischen Zellen zu CCL 23 Zellen hinzugefügt wurden.

Die Pneumokokken-Adhärenz wurde sowohl durch die lebensfähige Anzahl als auch durch die lit. A-Q-P-C-R-Ergebnisse waren zwischen den beiden Methoden konsistent, sowohl für die absolute Anzahl der Bakterien als auch für die prozentuale Adhärenz. Normalisiert auf die Anzahl der adhärenten Pneumokokken in den Vertiefungen, die nur Pneumokokken enthalten.

Heparin wird als Kontrolle verwendet, da bekannt ist, dass es die Adhärenz von Pneumokokken hemmt. Daher ist die Verringerung der Adhärenz um etwa 40 % oder mehr in den Pneumokokken- und Heparinproben im Vergleich zu Pneumokokken allein ein Hinweis auf einen erfolgreichen Assay. Da Speichel die Pneumokokken-Adhärenz in einer dosisabhängigen Weise hemmt, wobei die hohe Speichelkonzentration von etwa 10 Speichel auf einen Pneumokokken zu der geringsten Pneumokokken-Adhärenz führte.

Diese Transplantate zeigen die Adhärenz von Pneumokokken an den CCL 23-Zellen, wenn Speichel hinzugefügt wird, eine Stunde vor den Pneumokokken gleichzeitig oder eine Stunde nach den Pneumokokken. Alvar ist wirksamer bei der Hemmung der Pneumokokken-Adhärenz, wenn es vor den Pneumokokken hinzugefügt wird, da sowohl die hohen als auch die mittleren Dosen von Alvar die Pneumokokken-Adhärenz im Pre-Edition-Assay signifikant reduzierten. Während die Coit-Ausgabe und die Nachausgabe nur die hohen Dosen der slowakisch gehemmten Pneumokokken-Adhärenz testen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen In-vitro-Assay durchführen, um die Hemmung der Pneumokokken-Adhärenz durch die probiotischen Streptokokken-Zellbereiche zu messen.