Name: Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein In-vitro- Einhaltung Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie Streptococcus salivarius die Adhärenz von Streptococcus pneumoniae an CCL-23-Epithelzellen hemmt. Diese In-vitro-Adhärenzassay-Methode hilft, probiotische Strategien zur Reduktion pneumokokker Kolonisation zu entwickeln.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Murdoch Childrens Research Institute und betriebliche Infrastruktur-Support-Programm der Regierung von Victoria unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Ein wichtiger Teil dieses Assays wird um die entsprechende Konzentrationen von S. salivarius und Pneumokokken in den Abschnitten 3.1.7 und 3.1.12. Die Konzentrationen werden mit OD-Werten geschätzt, aber die genaue Inokula sind nicht bestimmt, bis Platten gezählt werden am folgenden Tag. Aus diesem Grund empfehlen wir die Durchführung von Wachstumskurven auf OD und Keimzahl (CFU / ml) über die Zeit für alle Bakterienstämme im Assay verwendet, um den mittleren log-Phase zu identifizieren und helfen bei der Schät...

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist ein Gram-positive Bakterien, die Infektionen, einschließlich Lungenentzündung, Mittelohrentzündung und Hirnhautentzündung führen kann. Es ist eine der Hauptursachen der Erkrankung bei Kindern in Ländern mit niedrigem Einkommen und für geschätzte 800.000 Todesfälle von Kindern unter fünf Jahren jährlich 1 verantwortlich. Pneumokokken sind häufig in den Nasenrachenraum von Kindern durchgeführt. Obwohl dieser Kolonisation ist allgemein als asymptomatisch, sie Pneumokokkeninfektion voran und dient als Reservoir für die Bakterien in menschlichen Populationen 2. Pneumokokken-Konjugat-Impfung verringert effektiv die Beförderung der im Impfstoff enthaltenen Serotypen. Allerdings gibt es über 90 Pneumokokken-Serotypen, und die Impfung kann Serotyp Ersatz, wobei die Beseitigung der Impfstoff-Serotypen wird von einem Anstieg der Wagen und Krankheit, die durch nonvaccine Serotypen 3 verursacht, gefolgt führen. Auch in einigen Hochrisikogruppen, PneumokokkenKolonisierung tritt oft sehr früh im Leben, vor der Verabreichung der ersten Impfstoffdosis 4,5. Kürzlich wurde die Verwendung von Probiotika als zusätzliche Strategie, um Pneumokokken-Kolonisierung 6,7 hemmen, vorgeschlagen. In vitro Adhärenz-Assays wurden verwendet, um Pneumokokken Einhaltung 8,9 untersuchen. Diese Tests wurden angepasst, um die Auswirkungen des probiotischen Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) auf die Einhaltung Pneumokokken 10 zu untersuchen. Zusätzlich zu LGG und anderen Milchsäurebakterien, Streptococcus salivarius, eine gemeinsame Bewohner der Mundhöhle, wurde als potenzielle Probiotikum für die Atemwege aufgrund seiner Besiedelung Potential und die Fähigkeit, Pneumokokken und anderen respiratorischen Pathogenen in vitro hemmen, untersucht 11 - 13. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein Festhalten Assay verwendet, um die Effekte von S. untersuchen salivarius K12 auf Pneumokokken-Einhaltungauf den menschlichen Zelllinie CCL-23. Vor der Verwendung im Test wurden die Pneumokokken-Isolate für die Einhaltung Fähigkeiten ausgewertet, da Wachstum und Hafteigenschaften kann im Wesentlichen zwischen den Isolaten 10,14 variieren. Wachstumskurven von Pneumokokken und S. salivarius geführt wurden bis zur mittleren log-Phase und Schätzung Konzentration (koloniebildende Einheiten oder CFU / ml) durch die optische Dichte zu bestimmen (OD, Fig. 1). Es wird empfohlen, das Wachstum von Keimzahl und OD untersuchen für jedes Isolat vor der Verwendung im Test. Dieser Test kann in jedem Labor mit Standardgewebekultureinrichtungen und Anlagen durchgeführt werden. In diesem Protokoll werden die Wirkungen von drei Dosen von S. salivarius, verabreicht 1 Stunde vor der Zugabe von Pneumokokken auf die Einhaltung von S. pneumoniae PMP843 ein Serotyp 19F Wagen Isolat aus einem Nasen-Rachen-Abstrich gewonnen werden, untersucht. Zwei verschiedene Wege, um anhaftende Pneumokokken quantifizieren vorgestellt: Plattierung auf Blut-Agar zur AbschreckungMine Keimzahl und DNA-Extraktion und Nachweis von Pneumokokken lytA Gens durch qPCR 15. Die Grund Einhaltung Assayprotokoll können leicht modifiziert werden, um verschiedene Dosen oder Zeit der Verabreichung von Probiotika testen und kann auch mit anderen bakteriellen Stämmen oder Spezies verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Minimum an essentiellen Medien (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 Flasche</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CCL-23 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-23&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pferdeblut-Agar-Platten (HBA)</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>Schafblut-Agar-Platten auch akzeptabel</td></tr><tr><td>Todd-Hewitt Bouillon</td><td></td><td>Oxoid CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hefe-Extrakt</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Einwegküvetten</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Pfizer</td><td>2112105</td><td>wird in sterilen Ampullen mit 5.000 I.E./5 m/&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriler Spreader</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>alternativ kann ein Glasspreader vor jedem Gebrauch in 96%iges Ethanol getaucht und flammensterilisiert werden</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS 20% Lösung</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp DNA-Mini-Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F Primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Custom made</td><td>5' -> 3' Sequenz ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R Primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Custom made</td><td>5' -> 3' Sequenz&nbsp; TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA-Sonde</td><td>Eurogentec</td><td>Sonderanfertigung</td><td>5' -> 3' Sequenz Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative Fluorophore können verwendet werden</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultraschneller QPCR-Mastermix</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96 Detektionsplatte&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultraklare qPCR-Kappenstreifen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mx3005 QPCR-System</td><td>Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*Alternative Quellen sind für die meisten/alle aufgeführten</td><td></td><td></td> Produkte verfügbar<td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

untersuchung der effekte von probiotika auf pneumokokken-kolonisation mit ein<em&gt; in-vitro-</em&gt; einhaltung assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Anhaften von Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) an die epitheliale Auskleidung der Nasenrachenraum kann in Kolonisierung führen und wird als eine Voraussetzung für Pneumokokken-Infektionen wie Lungenentzündung und Mittelohrentzündung. In vitro Adhärenz-Assays können verwendet werden, um die Befestigung von Pneumokokken studieren zu Zelle epithelialen werden Monoschichten und mögliche Maßnahmen, wie der Einsatz von Probiotika untersuchen, um Pneumokokken-Kolonisierung zu verhindern. Das hier beschriebene Protokoll verwendet wird, um die Auswirkungen des probiotischen Streptococcus salivarius auf die Einhaltung von Pneumokokken an menschlichen Zelllinie CCL-23 zu untersuchen (manchmal als HEp-2-Zellen). Der Test besteht aus drei Stufen: 1) Vorbereitung der Epithel-und Bakterienzellen, 2) Zugabe von Bakterien epithelialen Zellmonoschichten, und 3) Detektion von anhaftenden Pneumokokken durch Keimzahl (serielle Verdünnung und Beschichtung) oder quantitative Echtzeit-PCR (qPCR ). Diese technique ist relativ einfach und keine Spezialgeräte außer einer Gewebekultur-Setup benötigen. Der Test kann verwendet werden, um andere probiotische Spezies und / oder potentiellen Inhibitoren der Pneumokokken-Kolonisation zu testen und können leicht geändert werden, um andere wissenschaftliche Fragen zur Pneumokokken-Adhärenz und Invasion zu adressieren.

Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, bei dem Pneumokokken (S. pneumoniae PMP843 eine Kolonisierung 19F Isolat) wurden in CCL-23-Zellen 1 h nach der Zugabe von S. hinzugefügt salivarius und Pneumokokken-Adhärenz wurde sowohl Keimzahl und lytA qPCR quantifiziert werden in Tabelle 2 gezeigt. Ergebnisse waren konsistent zwischen den beiden Methoden für sowohl die absolute Anzahl von Bakterien (wie CFU / ml dargestellt) und die Einhaltung%, normiert auf die Anzahl...

In-vitro-Assays können verwendet werden, um die Einhaltung der Befestigung von Streptococcus pneumoniae zu untersuchen, um die Zellmonoschichten epithelialen und mögliche Maßnahmen wie der Einsatz von Probiotika zur Hemmung Pneumokokken-Kolonisierung zu untersuchen.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit einer probiotischen Streptococcus-cell-Levarius-Stammzelle zu untersuchen, die Anheftung von Pneumokokken an eine epitheliale Zelllinie zu hemmen. Dies wird erreicht, indem zunächst CCL-23-Epithelzell-Monolayer hergestellt werden. In einer 24-Loch-Platte werden anschließend Slovar und Pneumokokken nacheinander dem Monolayer zugegeben und die Zellen inkubiert. Im letzten Schritt werden die Vertiefungen gewaschen, um die nicht-adsorbierenden Bakterien zu entfernen. Die CCL 23 Epithelzellen werden lysiert und der Inhalt der Vertiefungen gewonnen. Letztendlich kann der Einfluss von salivarius auf die Pneumokokken-Adhärenz bewertet werden, indem die Anzahl der zellgebundenen Pneumokokken quantifiziert wird.Diese Methode hilft dabei, zentrale Fragen im Bereich der Infektionskrankheiten zu beantworten, beispielsweise, ob Probiotika die Adhärenz bakterieller Krankheitserreger wie des Pneumokokkus hemmen können. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir die mögliche Anwendung von Lactobacillus hypnosis, GG und anderen Probiotika im Respirationstrakt zu untersuchen begannen. Den Ablauf dieses Verfahrens werden Jane Mann

investigating-effects-probiotics-on-pneumococcal-colonization-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Protokoll ist eine einfache bakterielle Adhäsion Assay aus der Zählung die Zahl der bakteriellen Kolonie bildende Einheiten, die auf kultivierten Zellen eingehalten werden. Der Test ist robust, studierte unabhängig von der Adhäsin und zahlreiche Variationen sind in den meisten Labors arbeiten bakterielle Pathogenese.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

Quelle: Jagau, H. et al. Pneumokokken-Infektion von primären menschlichen Endothelzellen in ständigem Fluss. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert die Echtzeit-Visualisierung der Pneumokokken-Bindung an Strings des Von-Willebrand-Faktors (VWF) auf Endothelzellen unter konstanten Medienströmungsbedingungen. Es beschreibt die Schritte zur Stimulierung der VWF-Freisetzung, zur Markierung der Fäden und zur Quantifizierung der bakteriellen Bindung.

Bewertung der Pneumokokken-Adhäsion an primäre humane Endothelzellen unter konstantem Medienfluss

Quelle: Calatayud Arroyo, M., et al. Bewertung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakteriellen Konsortiums an der in-vitro-Darm-Wirt-Mikroben-Schnittstelle. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video demonstriert ein in-vitro-Darm-Host-Mikroben-Modell zur Untersuchung der bakteriellen Lebensfähigkeit. Eine Kokultur von Caco-2- und HT29-MTX-Zellen wird mit Bakterien inkubiert, die unter simulierten Verdauungsbedingungen vorbehandelt wurden. Die Integrität der Epithelbarriere wird mit...

In-vitro-Darmmodell zur Bewertung bakterieller Adhäsion und Internalisierung

Das Video zeigt einen Festphasen-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Biofilmbildung. In einer Multi-Well-Platte haften Bakterien in mit Gallensalz angereicherten Medien an festen Oberflächen und bilden Biofilme, was durch Kolorimetrie durch Kristallviolettfärbung und Ethanolbehandlung bestätigt wird.

Ein Festphasen-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Biofilmbildung

Die Kolonisation des murinen Nasopharynx mit Streptococcus pneumoniae und die anschließende Extraktion von anhaftenden oder rekrutierten Zellen wird beschrieben. Diese Technik beinhaltet das Spülen des Nasopharynx und die Sammlung der Flüssigkeit durch die Nares und ist anpassungsfähig für verschiedene Auslesungen, einschließlich Differentialzellquantifizierung und Analyse der mRNA-Expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Die Konkurrenz in Streptococcus pneumoniae wird durch Bacteriocine vermittelt, kleine antimikrobielle Peptide mit inhibitorischer Aktivität gegenüber Pneumokokken und anderen verwandten Spezies. Hier beschreiben wir einen optimierten bakteriellen Overlay-Assay, der die Charakterisierung der Bakteriocinaktivität und des inhibitorischen Spektrums, der Bacteriocin-spezifischen Immunität und den Nachweis von sekretierten Quorum-Sensing-Peptiden ermöglicht.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Diese Studie beschreibt den Prozess der Gavaging genauen Mengen von Probiotika mit Neugeborenen Mäusen. Der Versuchsaufbau wurde optimiert, um gehören aber nicht beschränkt auf probiotische Dosierung, Methoden der Verwaltung und Quantifizierung der Bakterien im Darm.

Probiotische Studien an neugeborenen Mäusen mit Magensonde

Der Nachweis von Wirt-Bakterien-Pathogen-Interaktionen basierend auf phänotypischer Adhärenz mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmarkierungsbildgebung zusammen mit automatisierten statistischen Analysemethoden ermöglicht eine schnelle Bewertung potenzieller bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen.

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Diese Arbeit beschreibt ein neuartiges Mausmodell für den Übergang von Pneumokokken von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem krankheitsverursachenden Erreger während einer Virusinfektion. Dieses Modell kann leicht angepasst werden, um polymikrobielle und Wirt-Pathogen-Interaktionen während der verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs und über verschiedene Wirte hinweg zu untersuchen.

Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Krankheitserreger nach viraler Koinfektion rekapituliert altersbedingte Erkrankung

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Besiedlung von Mäusen mit pks+ Escherichia coli unter nicht-entzündlichen Bedingungen sowie nicht-invasive Methoden zur Validierung der Kolonisierung und zur Bewertung der pks+ E. coli-Expansion im Kot.

Besiedlung mit Murine pks+ Escherichia coli unter nicht-entzündlichen Bedingungen

Erfahren Sie, wie Streptococcus salivarius die Adhärenz von Streptococcus pneumoniae an CCL-23-Epithelzellen hemmt. Diese In-vitro-Adhärenzassay-Methode hilft, probiotische Strategien zur Reduktion pneumokokker Kolonisation zu entwickeln.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein

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