Name: Ablation von einer einzigen Zelle ab Acht-Zell-Embryonen der Amphipod Schalentier Parhyale hawaiensis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Lernen Sie die manuelle Ablationsmethode für einzelne Blastomeren bei Parhyale hawaiensis. Diese Technik ermöglicht die Entfernung von Keimbahn-Vorläuferzellen zur Untersuchung embryonaler Entwicklung.

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Wir danken Rayhan Arif und Hassaan Shahawy für Kameraführung, Tripti Gupta und Frederike Alwes für Unterstützung Verfeinerung der Zell Ablation Technik und Labor Extavour Mitglieder für Rückmeldungen über die Daten-, Video-und Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise von der Harvard Stem Cell Institute unterstützt (Seed Förderkennzeichen SG-0057-10-00) die Ellison Medical Foundation (New Scholar Awards Nummer AG-NS-07010-10) mit CGE und Harvard College Research Program Auszeichnungen an ARN.

Kommentare, die hilfreich bei der Ausführung bestimmter Schritte sein können, sind in Kursivschrift angegeben. 1. Tag 1: Herstellung von Materialien <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Materialien (siehe Tabelle der Materialien und Geräte): <ul><li> 15 cm und 22 cm Pasteur Pipetten </li><li> Diamant-Schreiber </li><li> gefiltert künstlichem Meerwasser (Salzgehalt zwischen 0,0018 bis 0,0020), die 1 mg / ml Amphotericin B (1:100 einer 100 mg / ml Stammlösung), 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin (1:50 einer Stammlösung enthaltend 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 mg / ml Streptomycin) </li><li> gefiltert künstlichem Meerwasser (Salzgehalt zwischen 0,0018 bis 0,0020) ohne Zusatzstoffe </li><li> eine große Kunststoffbehälter zur Aufnahme Paare (mindestens 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> klein (3 cm oder 5 cm) Petrischalen mit Sylgard gesäumten </li><li> klein (3 cm oder 5 cm) Petrischalen </li><li> ein Uhrglas oder Glas Multi-Well-Platte </li><li> Pinzette (wir verwenden stumpfen Pinzette abgeleitet herm alt Dumont Nr. 5 Zange, die versehentlich in anderen Laborverfahren, die wir unter Verwendung einer Pinzette Schleifstein, um sicherzustellen, daß die Enden der Zange sind glatt, dass beide Zinken haben die gleiche Länge, und daß sie nicht mehr umfunktioniert beschädigt scharfen Spitzen. Extrem feine Pinzetten, wie neue Dumont Nr. 5 Zangen, sind unerwünscht, da diese Embryonen und / oder Frauen zu verletzen.) </li><li> eine Pasteur-Pipette mit dem Ende verbreitert (siehe Schritt 1.2 unten) </li><li> ein Embryo Retrieval-Tool, bestehend aus einer dünnen, gebogenen Wolframdraht in das dünne Ende einer Pasteur-Pipette eingebettet (könnte durch eine Alternative ersetzt implementieren werden, siehe 1.3 unten) </li><li> ein Mund Pipette mit einer kleinen Öffnung (siehe Schritt 1.4 unten) </li><li> ein Glas Nadel aus einer gezogenen Glaskapillare (siehe Schritt 1.5 unten) </li></ul> Keine Materialien für den Menschen giftig sind in diesem Protokoll verwendet. Allerdings sollten die Forscher sicherstellen, dass sie Handschuhe oder andere Schutzkleidung zu tragen, da durch das Risikomanagement erforderlich guidelines ihrer Institution. </li><li> Um die erweiterten Pasteur-Pipette, um einen ersten Punktzahl 15 cm Pasteur-Pipette an der Stelle, wo die Pipette beginnt mit einer Diamant-Schreiber einzugrenzen, wickeln Sie das erzielte Region der Pipette in einer Kimwipe oder Papiertuch, um die Finger zu schützen, und dann sorgfältig machen brechen Sie die Spitze an der Markierungslinie. Halten Sie die gebrochen Ende der Pipette über einem Bunsenbrenner-Flamme für einige Sekunden, um die Kanten zu glätten. Die Öffnung ist etwas schmaler als die maximale Breite der Pipette sein. </li><li> Um die Wolframdraht Dissektionswerkzeug machen, legen Sie eine Wolframdraht in das Ende eines 15-cm-Glaspasteurpipette und kurz halten, über der Flamme eines Bunsenbrenners, um das Glas zu schmelzen, Befestigungs den Draht. Verwenden einer Pinzette vorsichtig Kurve das Ende des Drahtes in eine Hakenform. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für eine geeignete Form für dieses Werkzeug. </li><li> Um eine kleine Öffnung für den Mund Pipette zu machen, ziehen Sie das dünne Ende einer 22 cm Pasteur-Pipette in zwei Teile over eine Flamme, und brechen Sie die Spitze des kleinen Endes. Legen Sie in das Ende des Mundpipettenhalter. </li><li> Machen Sie das Glas Nadel, die verwendet werden, um die Blastomeren der Zinsen während der Ablation mit einer Nadel durchstechen Abzieher wird. A geeignet geformten Nadel ist in Abbildung 4 dargestellt. Diese Nadel wurde auf einem Sutter P97 Nadelzieher mit einem Programm mit Parametern 2x gezogen (Wärme = 566, ziehen = 100, Geschwindigkeit = 20, Zeit = 250) + 1X (Wärme = 566, ziehen = 100, Geschwindigkeit = 100, Zeit = 250). Das spezifische Programm und Instrument benutzt, um die Nadel machen kann variieren, aber die Nadel eine feine Spitze haben, aber auch stabil genug, um nicht zu brechen, wenn sie gegen das Chorion des Embryos geschoben werden. </li></ol> 2. Tag 1: Sammeln Parhyale Gegen Paare <ol><li> Verwenden Sie die erweiterten Pasteur-Pipette (Schritt 1.2) zu sammeln Paarung P. hawaiensis Paare von der großen Kultur-Container, und übertragen Sie sie auf einem separaten Behälter, clehnen künstliche Meerwasser. Es ist nicht notwendig, dass diese Meerwasser gefiltert werden. Es ist am besten passenden Paare in den späteren Nachmittag zu sammeln und lassen Sie die Paare bei Raumtemperatur (20-23 ° C) über Nacht, so dass am nächsten Morgen, die meisten Embryonen vor kurzem befruchtet haben und abgeschieden wird, und somit am frühen Teilungsstadien geeignet für Ablation. Sammeln Sie mindestens 20 Gegenpaare, um sicherzustellen, dass einige Weibchen frühen Embryonen im Teilungsstadium tragen bis zum nächsten Morgen. </li></ol> 3. Tag 2: Sammeln Parhyale Embryonen <ul><li> Am nächsten Morgen ziehen gefiltert künstlichem Meerwasser (FASW) mit CO 2. Einige der Frauen werden von ihren Männern in der Nacht frei geschwommen haben, sammeln diese getrennt Weibchen und betäuben sie in FASW / CO 2. Die verbleibenden ungepaarten Männchen aus der Paarung Paar Behälter entfernt werden und zu dem großen Kultur. Verbleibende Gegenpaare können für Embryo-Entnahme später gespeichert werdenam Tag oder am nächsten Tag. </li><li> Übertragen einer einzigen weiblichen narkotisierten Durchführung Embryonen zu einem Uhrglas in FASW / CO 2. Alle Weibchen getrennt werden wahrscheinlich haben Eier gelegt, die sichtbar mit dem Auge so blass rosa oder lila Kügelchen durch die transparenten Platten coxal der Weibchen (Abbildung 1A) sein wird. Um festzustellen, ob die Embryonen in frühen Teilungsstadien und damit für Blastomere Ablation erforderlich, wird die Forscher haben, um die Embryonen aus der Bruttasche zu entfernen und untersuchen sie unter dem Mikroskop. </li><li> Anzeigen des Verfahrens unter einem Binokular, erfassen die coxal Platten entlang einer Seite des Körpers mit einer Pinzette. Die Embryonen werden in der ventralen Bruttasche zwischen diesen coxal Platten (1B) sichtbar sein. </li><li> Legen Sie die dünnen, gebogenen Drahtwerkzeug (3; Schritt 1.3) in das hintere Ende der Bruttasche, und heben Sie den Draht zum vorderen Ende der Bruttasche, um die Brut zu trennenBeutel Beläge (diese modifizierten ventralen Anhänge oostegites 30 genannt), das Öffnen der Tasche und Lösen der Embryonen. Die Embryonen, die in der ersten Stunde oder so von der Verlegung sind alle in einem sehr dünnen, transparenten Membran, die leicht durch den Drahtwerkzeug gestört werden wird eingeschlossen sind, verschwindet diese Membran um etwa 2-3 Stunden nach der Eiablage, und Embryonen sind nicht gebunden einander oder mit dem weiblichen in irgendeiner Weise von diesem Punkt an während der Embryogenese. Wenn Forscher finden es unbequem oder schwierig, die gebogenen Drahtwerkzeug manövrieren Embryonen aus der Bruttasche zu entfernen, eine alternative Implementierung verwendet werden, solange die Bewegungen sind sanft und keine harten Druck auf die Embryonen oder der Bruttasche angewendet. Andere Tools zum Entfernen von Embryonen aus der Bruttasche geeignet sind, schließen abgestumpft Zange oder ein Glas-Kapillare mit einem verschlossenen Ende und geglättet. </li><li> Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur-Pipette, um Wasser durch das geöffnete Bruttasche zu leeren, Ausschieben ter Embryonen, die an der Unterseite des Uhrenglases absetzen sollte. Übertragen Sie die weiblichen zu reinigen FASW (ohne CO 2), um die Wiedereinführung Erholung, bevor sie in die Hauptkultur zu ermöglichen. Mehrere Weibchen können in die gleiche Erholung Schale gelegt werden, aber erlauben Frauen voll, bevor sie dann wieder in die Hauptkultur zu erholen, als sie von anderen Tieren gefressen, wenn sie teilweise noch betäubt werden. </li><li> Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur-Pipette, um die Embryonen in eine Petrischale mit sauberem FASW übertragen, und zeigen unter dem Mikroskop auf ihre embryonalen Stadium zu bestimmen. Separate Embryonen, die am dritten Spaltung (Stufe 4 5), die für dieses Verfahren geeignet sind. Es sollte auch möglich sein, dieses Protokoll zu jeder Spaltung Stufe vor Keimscheibe Bildung gelten (Stufen 7-8 Mai). </li></ul> 4. Tag 2: Abtragen Einzelzellen <ol><li> Füllen Sylgard gesäumten Petrischale mit einer flachen Schicht FASW. Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur piPette einen einzigen Embryo auf die Platte übertragen. </li><li> Mit stumpfen Pinzette vorsichtig rollen den Embryo in die Zelle, die abgetragen werden (2A und 2B) zu identifizieren. Die Keimbahn g Vorstufe kann als der kleinste micromere, die auf der Oberseite des kleinsten macromere Mav sitzt identifiziert werden. Darüber hinaus wird g nicht direkt an den Zell en, die die von micromere es ist direkt gegenüber, wie die Mesoderm-Vorläufer Mikromeren ml und mr Aktie eine Zelle Grenze in der Mitte des Embryos. Mr ist die Blastomere nach rechts von g, und ml ist die micromere links g. Die Schwester Makromeren der herr, ml, und en sind die Vorläufer Ektoderm Er, El und Ep sind. </li><li> Mit einer Pinzette in der left Seits, wenn sich der Forscher Rechtshänder (oder der rechten Hand, wenn der Forscher Linkshänder), Ausrichten der Embryo mit der interessierenden Zelle nach rechts (oder nach links, wenn sich der Forscher Linkshänder), und leicht zu begreifen, den Embryo zwischen der Zange, um es zu stabilisieren. </li><li> Mit einem Glas Nadel gezogen (Schritt 1.5 oben, Abbildung 4), sanft Punktion der Zelle von Interesse. Sie die Nadel nicht zu weit stecken, damit sie nicht, um die Nadel in die Zellen oder unterhalb der benachbarten Zelle von Interesse zu schieben. Die Nadel muss nur die Chorion und darunterliegenden Zellmembran durchstechen, und muss nicht tief in die Zelle abzutragenden erstrecken. </li><li> Tauschen Sie die Nadel verwendet werden, um den Embryo für die Glas Ende einer Pipette Mund mit einer feinen Punktion gezogen Pasteur-Pipettenspitze (Schritt 1.4). Halten Sie die Spitze der Pipette in der Nähe des Loch in der Zelle von Interesse erstellt und gelten sehr sanfte Saugwirkung. </li><li> Sehr sanft drücken den Embryo mit der Zange. Da der Inhalt des blastonur aus dem Chorion durch das Loch im Schritt 4.4 erstellt geschoben, saugen sie in den Mund Pipette auf einen freien Blick auf den Embryo zu ermöglichen. Wenn das Loch groß genug ist, kann der Kern des punktierten Zelle gesehen werden, als auch auftauchen. Dies ist eine gute Kontrolle sicherstellen, dass die gesamte Zelle Inhalte wurden entfernt und können nicht regeneriert werden. </li><li> Beachten Sie sorgfältig den Embryo als die Blastomere von Interesse wird entfernt. Der Rand der Zelle durchstochen wird auf das Loch in dem Chorion zurücktreten, so dass die Schnittpunkte der darunterliegenden Zellen sichtbar. Anwenden von Druck weiter, bis alle Blastomere von Interesse wurde entfernt. Verwenden einer Pinzette, um den Embryo von Seite zu Seite und rollen visuell zu bestätigen, dass alle von der Blastomere von Interesse ist weg. </li><li> Mit einer unveränderten 15 cm Pasteur Pipette den Embryo zu reinigen FASW + (FASW + 1 mg / ml Amphotericin B, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin). </li><li> Raise-Blastomere abgetragen Embryonen in einzelnen Wellseiner sauberen 48-Lochplatte in FASW +, 50% Veränderung der Antibiotika ergänztem FASW + täglich. In unseren Händen Embryonen überleben und gut zu entwickeln, auch nach Ablation, in einem Temperaturbereich von 18 bis 28 º C. Forscher sollten ihre Embryonen bei einer Temperatur, für die sie eine saubere (aber nicht unbedingt steril) Oberfläche, auf der die Embryonen mit minimaler Störung erhöhen haben zu erhöhen. Um den Zeitpunkt der Entwicklungs Ereignisse in Blastomere-abgetragen Embryonen mit Kontrollen vergleichen zu können, verweisen wir auf die ausführliche Entwicklungs Inszenierung Informationen, die für Embryonen bei 18 º C 4, 25 º C 4 angehoben verfügbar ist, und 26 º C 5,6. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben ein Protokoll für Hand Ablation und vollständige physische Entfernung der einzelnen Blastomeren vom frühen Teilungsstadien des Floh P. hawaiensis. Wir zeigen Verwendung dieses Protokolls durch Entfernen der einzelnen Keimbahn-Vorläuferzelle g aus einem Acht-Zell-Stadium Embryo, und zeigen, dass die Ablation wurde durch die Bestätigung Abwesenheit von g &#39;s Tochter-Zellen in der Embryogenese später erfolgreich. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine d...

Der Flohkrebstier Parhyale hawaiensis hat sich in den letzten zehn Jahren als vielversprechende Modellorganismus mit großem Potenzial für den Einsatz in der evolutionären Entwicklungsbiologie Forschungs 1 entstanden. Unter den Arthropoden, die meisten Modellsysteme sind Insekten, und die meisten von ihnen ausgiebig studiert ist die Taufliege Drosophila melanogaster. D. melanogaster ist ein Mitglied der Insektenordnung Diptera, und als solche zeigt viele embryologische Funktionen, die mit Bezug auf diejenigen der basal Verzweigungs 2 Insekten abgeleitet sind. Darüber hinaus werden Insekten in der Unterabteilung Pancrustacea 3 verschachtelt, was bedeutet, dass Insekten haben ihre nächsten Verwandten in der langjährigen &quot;natürliche&quot; Gruppe namens pancrustaceans, und dass diese Gruppe paraphyletic. Dies deutet darauf hin, dass zusätzlich zu basal abzweigInsekten Modelle werden Studien von anderen Krebstieren erforderlich, um eine umfassendere Sicht der Evolutionsgeschichte der Entwicklungsmerkmale gewinnen einnd molekularen Mechanismen, die so gut in D. untersucht worden sind melanogaster. Aber nur sehr wenige Krebstiere sind gut für experimentelle Laboranalyse der Entwicklung etabliert. Der Floh P. hawaiensis ist ein sehr gefügig Labor Modellsystem zugänglich zu einer Reihe von experimentellen Techniken. Amphipoden zeigen viele einzigartige Features in ihre Mutter Peracarida Überordnung (Strand Trichter, Scud-Raketen, und auch Garnelen) und werden daher vermutlich relativ innerhalb dieser Gruppe von Krebstieren abgeleitet werden. Dennoch ist die relative Leichtigkeit der embryologischen und funktionellen genetischen Manipulation von Parhyale angeboten machen dieses Floh eine wertvolle Ergänzung zu den aktuellen Bestand von Modellorganismen. Als Labortier, P. hawaiensis bietet viele Vorteile. Tiere sind tolerant zu einem breiten Spektrum von Temperaturen und Salzgehalte und gut überleben in großen Kulturen von künstlichem Meerwasser ein. Es ist leicht zu unterscheiden zw.een Männer und Frauen, die auf klaren morphologischen Unterschiede, vor allem, die großen, gehakt, Vorderrumpf Anhänge, die zu verwenden, um die Weibchen während der Paarung zu erfassen Männchen. Für embryologische und Entwicklungsarbeit, P. hawaiensis hat mehrere sehr ansprechende Features. Embryogenese dauert etwa 10 Tage und die Zeit bis zur Geschlechtsreife ist etwa sechs Wochen bei 28 º C (aber beachten Sie, dass Parhyale überlebt auch bei Temperaturen von ca. 20-30 ° C, und eine ausführliche Entwicklungs Inszenierung Informationen für Embryonen bei 18 º C 4 angehoben verfügbar , 25 ° C 4 und 26 º C 5,6). Erwachsene passen das ganze Jahr über im Labor, so dass Embryonen sind zu jeder Zeit des Jahres zur Verfügung. Die Weibchen legen 2-20 (je nach dem Alter der Frau) befruchteten Eier in eine Bruttasche ventralen zwischen der ersten mehrere Paar Beine (1A und 1B) gelegen, und es ist möglich, diese zu sammeln Embryos sehr früh in der Entwicklung, ohne die weibliche Töten oder Beschädigung der Embryonen (Abbildung 1C). Die Embryonen überleben in künstlichem Meerwasser gefiltert bis zum Schlüpfen können für nachfolgende Genexpression oder histologische Analyse 7 festgelegt werden, und eine detaillierte Testtabelle ermöglicht eine genaue Identifikation der Fortschritt durch Entwicklung 5. Robust Protokolle wurden zur Genexpressionsanalyse durch in situ Hybridisierung 8-15 oder Immunfärbung 4,16,17 durchzuführen, funktionelle Knockdown durch RNA-Interferenz oder 13,15 morpholinos 12, und stabile Keimbahntransgenese 18. Verwendung der Transgenese System induzierbaren Expressionsverstärker 14 und 19 abzufangen Methoden können auch verwendet werden, um die Genfunktion in P. untersuchen hawaiensis. Während ein öffentlich verfügbaren Genomsequenz ist derzeit nicht verfügbar ist, enthält eine Transkriptom-Transkripte während der Oogenese und Embryogenese hergestellte Bienenn de novo und kommentierte 20 und in einer durchsuchbaren Datenbank hinterlegt 21, die Erleichterung Gen Entdeckung. Insgesamt P. hawaiensis ist ein sehr gefügig Modellorganismus geeignet für mehrere experimentelle und genetische Ansätze zum Verständnis der Entwicklung. Im Gegensatz zu den frühen Syncytial-Spaltungen von D. melanogaster, P. hawaiensis Embryonen spalten holoblastically nach der Befruchtung (Abbildung 2A). Lineage Tracing Analyse hat gezeigt, dass durch die dritte Schnittstelle, wobei jede der dritten Spaltungs Blastomeren ist speziell dazu bestimmt, um die zu einem der drei Keimblätter oder die Keimbahn 6 (Fig. 2B) erhalten wurde. Diese Daten, zusammen mit Microarray-Daten 22, Zelllinie analysiert 6,23 und 4 Blastomere Isolationsexperimente haben vorgeschlagen, dass Entwicklungspotentiale sind getrennt, zumindest einigen Dritt Spaltung Blastomeren durch asymmetrische Vererbung von cell Schicksal Determinanten. Dementsprechend wird in Blastomere Ablation Experimenten, bei denen die Keimbahn-Vorstufe (im Parhyale Zelllinie 6 Nomenklatur als &quot;g&quot;) wurde bei der acht Zellen-Stadium entfernt fehlte Embryonen Keimzellen in späteren Entwicklungsstadien 4, wie durch die Abwesenheit von Zellen angegeben Expression des Proteins Vasa, die eine Keimbahnmarkierung in den meisten Metazoen 24 ist. Im Gegensatz dazu zeigten die somatische Blastomere Ablation Experimente, dass P. hawaiensis Embryonen besitzen auch erhebliche regulatorische Fähigkeiten, so dass die Schicksale der Mesoderm oder Ektoderm Vorläufer Blastomeren im Acht-Zell-Stadium abgetragen kann über von den Nachkommen der einige der verbleibenden 25 Blastomeren entnommen werden. Wie regulative Zellschicksal Austausch stattfinden kann, und das Ausmaß der autonomen Zellschicksal Annahme durch somatischen Blastomeren, bleibt unbekannt. Experimentelle embryologische Techniken wie Blastomere Ablation in under nützlich seinding die relative Autonomie und Unselbständigkeit des Zellschicksals 26,27 Entscheidungen und sind daher von Interesse, die in der Studie von P. hawaiensis Embryogenese. In den Experimenten, die regulative Ersatz von ektodermalen und mesodermalen Linien gezeigt wurde Blastomere Ablation durch Injektion 28 und nachfolgende Anregung der Farbstoffe phototoxische 25 durchgeführt. Während diese Technik effektiv bei der Abtötung der eingespritzten Blastomere (n) ist, ist es nicht völlig den toten Zellkörper aus dem Embryo zu entfernen. Außerdem wurden Unterschiede zwischen Zelllinie Daten bis zur Gastrulation Stufen der Embryogenese durch Injizieren Blastomeren mit fluoreszierenden Tracer Linie 28,29 gesammelt, und Daten, die durch folgende ungestörten Blastomeren durch Entwicklung derselben Embryonalstadien 23 gesammelt beobachtet. Vollständige physische Entfernung spezifischer Blastomeren kann daher ein bevorzugtes Verfahren zur Ablation für einige Anwendungen. Wir haben vorher veröffentlicht die Ergebnisse der Zelllinie Analysen von Embryonen, in denen einzelne Zellen wurden manuell abgetragen 23. Doch die zarten Operationen erforderlich, um einzelne Blastomeren vom frühen Embryonen im Teilungsstadium zu entfernen noch nicht vollständig beschrieben. Hier ein Protokoll für die Sammlung von P. präsentieren wir hawaiensis Embryonen und manuelle Ablation eines einzelnen Blastomeren aus einem Acht-Zell-Stadium Embryo. Das Ziel dieser Methode ist, um die vollständige Entfernung des Zellkörpers aus dem Embryo zu erreichen, so dass die Beobachtung der Zellverhalten und Zellschicksal Kompetenzen von den übrigen Zellen in der Embryogenese und post Embryonalentwicklung. Unser Protokoll zeigt die Entfernung von der Keimbahn-Vorläufer g (2C), aber kann auf jede beliebige Zelle in der Acht-Zellen-Stadium aufgebracht werden, oder Blastomeren früheren Teilungsstadien. Im Prinzip könnte dieses Protokoll angewandt, um einzelne Zellen aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von othe entfernenr holoblastically Spaltung wirbellose Meerestiere.

<table><tbody><tr><td>15 cm Pasteurpipette</td><td>Wheaton</td><td>53499-630 VWR</td><td>Für den Transfer von intakten und Blastomer-ablierten Embryonen von Schale zu Schale.</td></tr><tr><td>22 cm Pasteurpipette</td><td>Wheaton</td><td>53499-632 VWR</td><td>Zur Herstellung von Mundpipettenspitzen.</td></tr><tr><td>3 cm Petrischalen</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>Verwenden Sie einige unveränderte Embryonen, um Embryonen zu entnehmen und zu lagern; beschichten Sie einige mit einer Schicht Sylgard (siehe unten), um eine Arbeitsfläche für Blastomerablationen zu schaffen.</td></tr><tr><td>48-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>Für die Kultivierung von Embryonen nach der Ablation.</td></tr><tr><td>Flaschenaufsatzfilter 0,2 & Mikro; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>Für die Erstellung von FASW (Siehe unten).</td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>Zur Herstellung von Wolframdrahtwerkzeug und feiner Mundpipette.</td></tr><tr><td>Diamond Scribe</td><td>Musco Sports Lighting</td><td>52865-005 VWR</td><td>Zur Herstellung von Pasteur-Pipetten mit breitem Mund zum Sammeln von Paaren.</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10 Fine Science Tools</td><td>Zum Halten von betäubten Weibchen während der Entnahme von Embryonen aus dem Brutbeutel. Es muss sich nicht um eine feine Dumont-Pinzette handeln – die Spitzen können mindestens so stumpf sein wie die der Pinzetten, bei denen hier die Katalognummer aufgeführt ist.</td></tr><tr><td>Fungizone-Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>Geben Sie FASW auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml und verwenden Sie diese Lösung zur Kultivierung von Blastomer-ablierten Embryonen.</td></tr><tr><td>Glaskapillaren 4 Zoll lang, 1/0,58 OD/ID (mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4 World Precision Instruments</td><td>Zur Herstellung von Nadeln zum Punktieren des zu abtragenden Blastomers.</td></tr><tr><td>Glasuhrglas 300 mm Durchmesser</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>70543-30 Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>Zur Entnahme von Embryonen aus dem Brutbeutel von betäubten Weibchen.</td></tr><tr><td>Instant Ocean Künstliches Meerwasser (ASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>Stellen Sie ASW her, indem Salz in deionisiertem Wasser auf einen Salzgehalt von 1,022-1,024</td></tr> aufgelöst wird.<tr><td>Instant Ocean gefiltertes künstliches Meerwasser (FASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>verwenden 0,2 & Mikro; m Filter zur Sterilisation von ASW. Nach Bedarf in kleinen Mengen (< 250 ml) auffüllen.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>Zum sicheren Abbrechen des feinen Endes von Pasteur-Pipetten, modifiziert zum Auffangen von Paaren.</td></tr><tr><td>Mundpipettenadapter</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>Führen Sie die fein gezogene Pasteur-Pipettenspitze in dieses Ende ein, um sie zur Entfernung von extrudiertem Zellinhalt während des Ablationsvorgangs zu verwenden.</td></tr><tr><td>Mundpipettenschlauch</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich</td><td>Schneiden Sie diesen Schlauch so ab, dass er lang genug ist, um ihn während des Ablationsvorgangs bequem um Ihren Hals zu hängen.</td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P97 Sutter Instrument Company</td><td>Zur Herstellung von Nadeln aus Glaskapillaren zum Punktieren des zu abtragenden Blastomers.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>Geben Sie FASW in eine Endkonzentration von 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin und verwenden Sie diese Lösung zur Kultivierung von Blastomerablationen.</td></tr><tr><td>Gummikolben</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>100488-418 VWR</td><td>Zur Verwendung von Pasteur-Pipetten zum Transfer von Embryonen von Schale zu Schale.</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>K. R. Anderson, Inc.</td><td>NC9659604 Fisher Scientific</td><td>Make up gemäß den Anweisungen des Herstellers. Gießen Sie eine 2-5 mm dicke Schicht in eine 3 cm große Petrischale, um eine Arbeitsfläche für Blastomerablationen zu schaffen.</td></tr><tr><td>Wolframdraht 0,004 Zoll Durchmesser</td><td>A-M Systems</td><td>719000 A-M Systems</td><td>Verwenden Sie dies, um ein Werkzeug zur Entnahme von Embryonen aus dem Brutbeutel von narkotisierten Weibchen herzustellen.</td></tr></tbody></table>

ablation von einer einzigen zelle ab acht-zell-embryonen der amphipod schalentier<em&gt; parhyale hawaiensis</em

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Der Floh Parhyale hawaiensis ist ein kleines Krustentier in Gezeiten marine Lebensräume weltweit gefunden. In den vergangenen zehn Jahren hat sich Parhyale als eine vielversprechende Modellorganismus für Laboruntersuchungen von Entwicklung entstanden, ein nützliches Fremdgruppe Vergleich zur bekannten Gliederfüßer Modellorganismus Drosophila melanogaster. Im Gegensatz zu den Syncytial-Spaltungen von Drosophila, sind die frühen Spaltungen von Parhyale holoblastisch. Fate Mapping mit Tracer-Farbstoffe in frühen Blastomeren injiziert haben gezeigt, dass alle drei Keimblätter und der Keimbahn werden von der Acht-Zell-Stadium etabliert. Zu diesem Zeitpunkt werden drei Blastomeren beschieden, die zu dem Ektoderm geben, drei sind dazu bestimmt, um die zu dem Mesoderm zu geben, und die verbleibenden zwei Blastomeren sind die Vorstufen von Endoderm und Keimbahn sind. Allerdings haben Blastomere Ablation Experimente gezeigt, dass Embryonen Parhyale signifikanten regulatorischen capabiliti besitzen auches ist, so dass die Schicksale der Blastomeren im Acht-Zell-Stadium abgetragen kann über von den Nachkommen der einige der verbleibenden Blastomeren entnommen werden. Injektion und die anschließende Aktivierung von phototoxischen Farbstoffe oder manuelle Abtragen: Blastomere Ablation wurde zuvor von einem von zwei Verfahren beschrieben worden. , Tötet jedoch photoablation Blastomeren jedoch nicht die toten Zellkörper aus dem Embryo zu entfernen. Vollständige physische Entfernung spezifischer Blastomeren kann daher ein bevorzugtes Verfahren zur Ablation für einige Anwendungen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die manuelle Entfernung von einzelnen Blastomeren aus dem Acht-Zell-Stadium des Embryos Parhyale, veranschaulicht, die Instrumente und manuellen Verfahren, die für die vollständige Entfernung der Zellkörper, während die übrigen Blastomeren lebendig und intakt. Das Protokoll kann auf jeden Parhyale Zelle im Achtzellstadium oder Blastomeren von anderen frühen Teilungsstadien angewendet werden. Darüber hinaus grundsätzlich Dieses Protokoll könnte für frühe Clea seinvage Embryonen anderer holoblastically Spaltung wirbellose Meerestiere.

Nach der erfolgreichen Ablation von Einzel dritte Spaltung P. hawaiensis Mikromeren wie in diesem Protokoll beschrieben, nach und nach die restlichen Mikromeren ihre Positionen leicht verschieben, um so den Raum früher von der abgetragenen Blastomere besetzt teilweise zu besetzen. Zum Beispiel, wenn g wird entfernt, der benachbarten Blastomeren mr ml und leicht verschoben und kommen, um die seitlichen Zellgrenzen, die früher in direktem Kontakt mit g (vgl. <str...

Der Floh Parhyale hawaiensis ist eine vielversprechende Modellorganismus für die Untersuchung der Krustentier Embryologie und vergleichende Arthropoden Entwicklung und Evolution. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die manuelle Entfernung der einzelnen Blastomeren aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von Parhyale.

Ablation von einer einzigen Zelle ab Acht-Zell-Embryonen der Amphipod Schalentier<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Diese Demonstration zeigt die Technik zum Entfernen der Keimbahnvorläuferzelle aus frühen Embryonen in der Hülle. Crustacean parli sys parli ist ein aufstrebender Modellorganismus mit großem Potenzial für die Anwendung in der evolutionären und entwicklungsgeschichtlichen Forschung. Die meisten Modellarthropoden sind Insekten, und die am intensivsten untersuchten davon sind die Fruchtfliegen Glip Melanogaster. Insekten sind innerhalb des Unterstamms Panc cresta eingebettet, und die Untersuchung anderer Krebstiere außerhalb der Insekten bietet einen umfassenderen Einblick in die evolutionäre Geschichte der Entwicklungseigenschaften und molekularen Mechanismen, die in Drosophila bereits gut untersucht wurden.Jedoch wurden nur sehr wenige Krebstiere für die experimentelle Laboranalyse der Entwicklung gut etabliert. Parelli ist ein äußerst gut handhabbares Labormodellsystem und stellt somit eine wertvolle Ergänzung zum Bestand an Modellorganismen dar. Als Labororganismus ist parli sehr einfach zu pflegen und zu handhaben.Es gedeiht gut in großen Kulturen aus künstlichem Meerwasser, und es ist einfach, anhand klarer morphologischer Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen zu unterscheiden. Vor allem fallen die großen, hakenförmigen vorderen Anhänge auf, mit denen die Männchen die Weibchen während der Paarung festhalten, was für Entwicklungsstudien von Vorteil ist. Parelli weist mehrere sehr attraktive Merkmale auf: Die Paarung erfolgt das ganze Jahr über, sodass Embryonen jederzeit gewonnen werden können.Weibchen legen Embryonen in die Bruttasche zwischen den ersten paar Beinpaaren ab, und es ist möglich, die Embryonen bereits in einem sehr frühen Entwicklungsstadium zu gewinnen, ohne das Weibchen zu töten oder die Embryonen zu beschädigen. Die Embryonen überleben in filtriertem künstlichem Meerwasser bis zum Schlüpfen, und es gibt eine detaillierte Stadienübersicht, die eine genaue Bestimmung des Entwicklungsfortschritts ermöglicht. Gezeigt ist hier eine Auswahl von Entwicklungsstadien von Paral bis zum Schlüpfen, beginnend mit dem Acht-Zellen-Stadium der Entwicklung.Jede der Zellen im Paral-Embryo ist spezifisch zu einer der drei Keimblätter oder zu den primordialen Keimzellen determiniert. Von besonderem Interesse ist hierbei die Spezifikation der Keimzellpopulation. Die Zelle G für Keimbahn ist als eindeutiger Keimbahnvorläufer in der Paral-Linientracing-Experimenten bekannt, die zeigen, dass die Nachkommen von G alle Keimzellen bilden und keine Nachkommen zu anderen Keimblättern gehören.Außerdem wurden Experimente durchgeführt, bei denen G aus dem Embryo entfernt wurde, ohne die übrigen Zellen zu schädigen. In diesen Experimenten fehlten bei den Embryonen, denen G entfernt wurde, während der gesamten weiteren Embryogenese Keimzellen, wie durch das Fehlen von Zellen belegt wird, die das Protein Vasa exprimieren, welches ein Keimbahn-Marker in Modellorganismen innerhalb der Metazoen ist. Wir werden nun demonstrieren, wie man Parli-Embryonen sammelt und G manuell aus einem Acht-Zellen-Embryo entfernt.Dieses Video zeigt das Entfernen von G, kann jedoch auf jede Zelle im Acht-Zellen-Stadium angewendet werden. Für diesen Teil des Verfahrens benötigen wir eine Pasteurpipette mit verbreitertem Ende, eine zweite unveränderte Pasteurpipette, filtriertes künstliches Meerwasser, einen großen Behälter zur Unterbringung von Paaren, kleine Petrischalen, eine Glas-Vertiefungsplatte, eine Pinzette und ein Dissektionswerkzeug, das aus einem dünnen, gebogenen Draht am Ende einer Pasteurpipette besteht. In dieser Demonstration werden keine Pipettierhandschuhe verwendet, denken Sie jedoch daran, Schutzausrüstung gemäß den Risikomanagementvorschriften Ihrer Einrichtung hinzuzufügen, um zunächst die Pasteurpipette mit einem Diamantschneider einzuritzen und dann die Spitze vorsichtig abzubrechen.Mehrere Sekunden über eine Flamme halten, um die Kanten zu glätten. Die Öffnung sollte etwas schmaler sein als die maximale Breite der Pipette. Um das drahtbasierte Präparationswerkzeug herzustellen, einen Wolframdraht in das Ende einer Glaspipette einführen und über eine Flamme halten, um das Glas zu schmelzen.Um den Draht an Ort und Stelle zu fixieren, verwenden Sie Pinzette, um das Ende des Drahtes leicht zu biegen, damit er mit dem Werkzeug am einfachsten zu handhaben ist. Das Hakenende sollte etwas mehr als einen halben Zentimeter lang sein. Sammeln Sie Paare mit der verbreiterten Pasteurpipette und überführen Sie sie in einen separaten Behälter mit künstlichem Meerwasser. Lassen Sie die Paare über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Morgen leiten Sie gefiltertes künstliches Meerwasser mit Kohlendioxid durch. Sammeln Sie die getrennten Weibchen und betäuben Sie sie in diesem Wasser.Überführen Sie ein einzelnes Weibchen in eine Glas-Multiwell-Platte mit filtriertem künstlichem Meerwasser unter Betrachtung mit einem Stereomikroskop bei Beleuchtung mit Kohlendioxid; fassen Sie mit einer Pinzette die Coxalplatten entlang einer Körperseite an. Die Embryonen sind im Brutbeutel sichtbar. Führen Sie das drahtförmige Präparationswerkzeug in das hintere Ende des Brutbeutels ein und heben Sie den Draht vorsichtig in Richtung vorderes Ende, um die Decke des Brutbeutels zu lösen, diesen zu öffnen und die Embryonen freizulegen.Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um Wasser durch den geöffneten Brutbeutel zu spülen und die Embryonen herauszuspülen. Überführen Sie das Weibchen in filtriertes künstliches Meerwasser ohne Kohlendioxid, um eine Erholung zu ermöglichen, bevor es wieder in die Hauptkultur eingeführt wird.Überführen Sie die Embryonen in eine Petrischale mit filtriertem künstlichem Meerwasser und betrachten Sie sie unter dem Mikroskop, um ihr Entwicklungsstadium zu bestimmen. Da es oft schwierig ist, das Entwicklungsstadium der Embryonen zu bestimmen, bevor man sie aus dem Weibchen entfernt, müssen wir häufig Embryonen von mehreren Weibchen sammeln, um genügend Embryonen des richtigen Stadiums zu erhalten. Oft ist der einfachste Weg, Embryonen im Acht-Zellen-Stadium zu erhalten, das Sammeln von Embryonen früherer Stadien und das Warten, bis sie sich zum gewünschten Stadium entwickeln.Zusätzlich zu den Embryonen, die wir bereits für den Ablationsvorgang gesammelt haben, benötigen wir eine Pasteurpipettenpinzette, gefiltertes künstliches Meerwasser, eine Petrischale mit einer Schicht aus Zigarrenpapier, eine Nadel aus einer gezogenen Glaskapillare, eine Mundpipette mit einer kleinen Öffnung, saubere Petrischalen sowie gefiltertes künstliches Meerwasser mit Amphotericin und Penicillin-Streptomycin für die Spitze der Mundpipette. Ziehen Sie eine lange Spitze an Ihrer Pasteurpipette über einer Flamme und brechen Sie die Spitze am kleinen Ende ab, das in das Ende der Mundpipette eingeführt wird. Diese Spitze hat die ideale Größe für den Eingriff.Die Glasnadel, die zum Durchstechen von G während des Ablationsverfahrens verwendet wird, muss eine feine Spitze aufweisen, gleichzeitig jedoch stabil genug sein, um nicht zu brechen, wenn sie gegen das Korion gedrückt wird. Hier ist eine gängige Form gezeigt, wie sie in unserem Labor verwendet wird. Für die Ablation müssen wir zunächst identifizieren, welche Zelle G ist. Das Embryo auf der linken Seite zeigt G, das in Schwarz umrissen ist. Im folgenden Abschnitt werden wir lernen, wie man G von den anderen Mikrospiegeln unterscheidet.Das Embryo rechts zeigt das erwartete Ergebnis einer erfolgreichen Ablation. In diesem Embryo wurde G, wie durch den schwarzen Kreis angezeigt, ablatiert, und nur drei Mikromeren verbleiben. Drehe das Embryo vorsichtig, um die Zellen zu betrachten und zu vergleichen.G kann identifiziert werden als das kleinste Micromer, das auf dem kleinsten Makromer sitzt; MAV kann identifiziert werden als das kleinste Makromer, indem man das Embryo umrollt. Außerdem berührt G nicht die Zelle EN, welche das gegenüberliegende Micromer ist. Da die Zellen el und er eine Grenzfläche zwischen G und EN teilen, erkennen wir, dass sich das kleinste Micromer auf der linken Seite befindet, und wir sehen, dass es das gegenüberliegende Micromer nicht berührt.Indem wir das Embryo umrollen, können wir bestätigen, dass dieser Mikrospiegel auf dem kleinsten Makrospiegel sitzt. Nun befindet er sich unten links im Embryo, sodass wir ihn zuverlässig als G bezeichnen können, und können zur Ablation übergehen. Kurz gesagt.Für dieses Verfahren stabilisieren wir das Embryo mit einer Pinzette, während wir G mit der gezogenen Glasnadel durchbohren. Anschließend üben wir leichtem Druck mit der Pinzette auf das Embryo aus, sodass der Inhalt von G durch das von uns angelegte Loch aus dem Embryo austritt. Wir verwenden die Mundpipette, um den Inhalt von G zu entfernen, nachdem er aus dem Embryo ausgetreten ist, damit wir erkennen können, wann G vollständig entfernt wurde.Nun im Detail: Füllen Sie die Seidenschutzplatte mit einer dünnen Schicht filtriertem künstlichem Meerwasser. Übertragen Sie ein Acht-Zell-Embryo mithilfe einer Pasteur-Pipette und einer Pinzette auf die Platte. Halten Sie mit der linken Hand den Embryo so, dass G rechts liegt, und stabilisieren Sie ihn vorsichtig, indem Sie ihn mit einer aus Glas gezogenen Nadel leicht fixieren. Stich vorsichtig in G ein, ohne die Nadel zu tief einzuführen, um zu verhindern, dass die Nadel in die Makrospiegel unterhalb von G gedrückt wird. Wechseln Sie dann in der rechten Hand die Nadel gegen eine Mundpipette mit einer aus Pasteur-Pipette gezogenen Spitze aus.Halten Sie die Pipettenspitze dicht an die Öffnung in G und erzeugen Sie sehr sanften Sog. Quetschen Sie den Embryo vorsichtig mit der Pinzette, während der Inhalt von G aus dem Keimhüllchen herausgedrückt wird. Ziehen Sie ihn in die Mundpipette, um eine ungehinderte Sicht auf den Embryo zu ermöglichen.Beobachten Sie das Embryo sorgfältig. Während G entfernt wird, zieht sich die Grenze von G in Richtung der Öffnung in der Chorion zurück, wodurch die darunterliegenden Zellen sichtbar werden. Setzen Sie den Druck fort, bis das gesamte G entfernt ist, und verwenden Sie die Pinzette, um das Embryo zu drehen und visuell zu bestätigen, dass sämtliches G entfernt wurde.Überführen Sie das Embryo mit einer Pasteurpipette in filtriertes künstliches Meerwasser mit Amphotericin und Penicillin-Streptomycin. Wechseln Sie täglich die Hälfte des Wassers um Infektionen am Embryo zu verhindern. Hier ist ein Embryo vor und nach der Ablation.Wie Sie sehen, befindet sich an der Stelle, an der zuvor G war, nun ein leerer Raum. Wenn der Eingriff behutsam durchgeführt wird und die Embryonen nach dem Verfahren gut versorgt werden, überlebt ein großer Prozentsatz bis zum Schlupf. In unserem Labor liegt die durchschnittliche Überlebensrate knapp über 50 %.

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