Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine ​​Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Diffusionskoeffizienten von Membranproteinen in lebenden Zellen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen gezüchtet werden, die das mit GFP markierte Protein exprimieren, und anschließend eine zeitaufgelöste Bildsequenz auf einem Spinning-Disk-Mikroskop aufgenommen wird, wobei der Fokus auf die Plasmamembran eingestellt ist. Der zweite Schritt besteht darin, einen Ausschnitt im Bildstapel auszuwählen, in dem die Membran flach verläuft und sich keine beweglichen Organellen befinden.

Anschließend wird der Ausschnitt mithilfe einer fallbasierten Bild-Korrelations-Spektroskopie-Software analysiert. Im letzten Schritt werden die Diffusionskurven in Excel gemittelt. Letztendlich kommt die Live-Cell-Mikroskopie in Kombination mit Kicks zum Einsatz, um den Diffusionskoeffizienten eines Membranproteins zu bestimmen.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Membran-Biophysik beantworten, beispielsweise die Ermittlung der Diffusionskoeffizienten von Membranproteinen unter verschiedenen Bedingungen. Wenn der Kicks-Code zum ersten Mal verwendet wird, öffnen Sie MATLAB und klicken Sie auf „Datei“. Anschließend wählen Sie „Pfad festlegen“, dann „Hinzufügen mit Unterordnern“ und suchen den Ordner auf dem Computer, in dem sich der Kicks-Code befindet.

Klicken Sie auf „Okay“. Bevor Sie MATLAB während der Datenaufnahme speichern und schließen, ist es wichtig, die Membran während der gesamten Dauer der Bildaufnahme scharf zu halten. Wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI) im flachen Bereich der Membran, wo die Fluoreszenz gleichmäßig verteilt ist.

Schließen Sie bewegliche Zellorganellen und vorstehende Membranbereiche aus. Die Zuschneidegröße wird so gewählt, dass ausreichend Statistiken für gute K-Quadrat-Diagramme generiert werden. Schneiden Sie den Bereich zu und speichern Sie den Ausschnitt als TIFF.

Datei in einem geeigneten Ordner ablegen. Wenn mehrere Ausschnitte aus demselben Film stammen, verwenden Sie eine fortlaufende Nummerierung, beispielsweise „Stack eins Ausschnitt“, „do tiff“, „Stack eins“, „Ausschnitt zwei“, „tif“ usw. Um die Analyse durchzuführen, öffnen Sie zunächst MatLab, geben im Befehlsfenster „ICS gooey“ ein und drücken die Eingabetaste ICS.

GUI ist der ausführbare Name für das Bild-Korrelationsspektroskopie-Grafikbenutzerinterface-Programm in der ICS-Gooey-Oberfläche. Klicken Sie auf den Reiter „Kicks“. Suchen Sie den Ordner mit dem Ordnernamen „MATLAB-Code“.

Scrollen Sie zur Datei mit dem Dateinamen „scripts“ und öffnen Sie diese durch Doppelklicken. Diese Datei heißt editor. Im.Editor.

Scrollen Sie, um Kick-Datensätze zu laden. Kopieren Sie anschließend den Dateinamen und den Ordnerpfad in die Befehlszeile. Geben Sie in der Befehlszeile unterhalb des Ordnerpfads den Befehl ein.

Legen Sie die Anzahl der zu analysierenden Einzelbilder fest. Verwenden Sie dieselben Einstellungen für alle aufeinanderfolgenden Filme in der Datenserie. Falls in späteren Einzelbildern eine Fokusdrift auftritt.

Diese sollten von der Analyse im Editor ausgeschlossen werden. Klicken Sie auf „Speichern“ und anschließend auf „Auswerten“. Der Datensatz ist nun in der Analyse-Software im Kick-Analyse-Fenster der grafischen Benutzeroberfläche geladen.

Geben Sie die Einstellungen für die Analyse ein, indem Sie zuerst die T-Zell-Kästchen deaktivieren. Geben Sie anschließend die Anzahl der zu analysierenden Zeitverzögerungen ein. Geben Sie das maximale K-Quadrat ein.

Die Zahl liegt gewöhnlich zunächst zwischen 20 und 50. Die Analyse sollte so lange wiederholt werden, bis die optimalen Werte bestimmt sind, und anschließend sollten diese Einstellungen für alle aufeinanderfolgenden Aufnahmen der Datenserie verwendet werden. Prüfen Sie stets, ob die gewählten Einstellungen eine gute Anpassung an die Daten ermöglichen, wie durch gute Chi-Quadrat-Diagramme und ein lineares Diffusionsdiagramm belegt.

Klicken Sie anschließend auf „Store Settings“ und fahren Sie fort. Klicken Sie dann auf „Ja“, um alle Diagramme anzuzeigen. Klicken Sie auf „Load Image Series“ und danach auf „Workspace“.

Wählen Sie vor dem Klicken auf „Import aus Arbeitsbereich“ den Bildserien-Ausschnitt aus. Geben Sie nun im Feld Pixelgröße die Sammelparameter des Abbildungssystems ein. Tragen Sie die projizierte Pixelgröße des Abbildungssystems ein, mit dem die Bildstapel aufgenommen wurden.

Klicken Sie auf „ROIs auswählen“ und wählen Sie einen aus. Klicken Sie dann auf „OK“ und verwenden Sie das gesamte Bild. Klicken Sie auf „Kick-Analyse durchführen“ und dann auf „Ja“, um die Filterung für unbewegliche Partikel durchzuführen.

Die Ergebnisse werden automatisch als Bilder geöffnet. Minimieren Sie das Einstellungsfenster, minimieren Sie das Zelleninfo-Fenster und minimieren Sie das Photophysik-Fenster im Dynamikfenster. Überprüfen Sie, ob die Dynamikdarstellung eine lineare Anpassung der Daten mit einer negativen Steigung zeigt, was bedeutet, dass die Datenpunkte korrelieren und freie Diffusion angenommen werden kann.

Notieren Sie den Diffusionskoeffizienten für die spezifische Zeitverzögerung und die K-Quadrat-Einstellungen. Die Datenpunkte in den K-Quadrat-Diagrammen müssen um die Linie für die gegebene Zeit gruppiert sein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Zeitverzögerungen, speichern Sie offene Abbildungen als Bilder und klicken Sie anschließend erneut auf „Speichern Sie offene Abbildungen als Bilder“, um die Ergebnisdateien zu speichern.

Speichern Sie in einem neuen Ordner und klicken Sie anschließend auf „aktuelle Daten löschen“, um mit der Analyse der nächsten Kultur fortzufahren. Tragen Sie unter Verwendung der zuvor festgelegten Namen der Kulturen die einzelnen Diffusionskoeffizienten aus jeder ROI in eine Tabellenkalkulation ein und notieren Sie die Anzahl der Zeitverzögerungen sowie die K-Quadrat-Werte. Berechnen Sie den mittleren Diffusionskoeffizienten und die Standardabweichung mithilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms.

Führen Sie einen MOV-Smirnoff-Test oder einen Studentschen t-Test durch, um statistische Unterschiede zu bewerten. Mithilfe eines Signifikanzniveaus von 5 % können quantitative Vergleiche zwischen Zellen offen durchgeführt werden. Die Tabellenkalkulationsversion der Diffusionsdiagramme, die von der Analysesoftware für jede Probe generiert wurde, und Mittelung der Daten für jede Bedingung für jede Zeitverzögerung.

Erzeugen Sie eine neue durchschnittliche Diffusionskurve zur Präsentation in wissenschaftlichen Arbeiten oder Vorträgen. Die hier gezeigten Ergebnisse stellen eine Zeitrafferaufnahme einer mit EGFP markierten Aquaporin-3 dar. In lebenden MDCK-Zellen, das sind renale epitheliale Zellen, aufgenommen mit einem Spinning-Disk-Mikroskop, bei dem der Fokus auf die Plasmamembran eingestellt ist.

Hier ist ein Bild der Zelle mit beispielhaften, durch Rechtecke hervorgehobenen ROI-Ausschnitten zur Auswahl der Ausschnitte dargestellt. Es ist wichtig, am Rand der Zelle zuzuschneiden, wo die Membran gleichmäßig und flach ist, damit nur eine zweidimensionale Diffusion sichtbar wird. Zellorganellen, Vesikel und Membranfortsätze sollten vermieden werden, und für die Analyse ist es entscheidend, dass während der Zeitrafferaufnahme kein Drift auftritt.

Dieser repräsentative Ausschnitt wurde von der Analyse und Kicks ausgeschlossen, da sich Vesikel bewegen, die zum Diffusionskoeffizienten beitragen können. Ein weiteres Beispiel eines ausgeschlossenen Ausschnitts, in dem eine Öffnung in der Membran vorhanden ist, wird hier gezeigt. Der Diffusionsplot eines Ausschnitts, der mit Kicks erstellt wurde, ist hier dargestellt.

Diese Methode kann verwendet werden, um den Diffusionskoeffizienten eines mit einem fluoreszierenden Protein, einem Farbstoff oder Quantenpunkten markierten Proteins zu bestimmen. Die Steigung der Kurve im Diffusionsplot entspricht einfach dem negativen Wert des Diffusionskoeffizienten. Hier ist für Aquaporin drei, das mit EGFP markiert ist, ein berechneter Diffusionsplot mit zu vielen Zeitverzögerungen dargestellt. In diesem Fall wurde die Analyse erneut durchgeführt, jedoch mit weniger Zeitverzögerungen, sodass der Diffusionsplot linear verläuft.

Hier ist ein typisches K-Quadrat-Diagramm dargestellt. Dabei handelt es sich um die radial gemittelte und logarithmisch transformierte Korrelationskurve für eine ausgewählte Zeitverzögerung aus diesen K-Quadrat-Diagrammen. Die Steigung ist in Abhängigkeit von den Zeitverzögerungen aufgetragen, und das Ergebnis ist das zuvor gezeigte Diffusionsdiagramm.

Bei der Untersuchung der K-Quadrat-Diagramme ist es wichtig, dass die Anpassung anhand dieses K-Quadrat-Diagramms bewertet wird. Es lässt sich schlussfolgern, dass die Messung zu klein war und nicht wie erforderlich ausgewertet werden konnte, da sie eine negative Steigung aufweisen und linear bis zu einer Rauschuntergrenze abfallen sollte. Dieses K-Quadrat-Diagramm muss erneut mit einem reduzierten maximalen K-Quadrat-Wert analysiert werden, da die Anpassung angesichts der zunehmenden Restabweichungen bei größeren K-Quadrat-Werten nicht mehr gut ist.

In diesem Fall muss die Analyse erneut durchgeführt werden, wobei ein niedrigerer maximaler K-Quadrat-Wert eingegeben wird. Hier ist ein Diffusionsplot dargestellt, der über 10 Ausschnitte gemittelt wurde. Der Diffusionsplot wurde aus der Excel-Datei der Analyse entnommen und darauf basierend erstellt.

Der Diffusionskoeffizient von AQUAPORIN drei EGFP wird nach folgender Vorgehensweise berechnet. Andere Methoden, wie die Messung des Diffusionskoeffizienten von Membranproteinen nach Zugabe unterschiedlicher Wirkstoffe, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise ob sich der Diffusionskoeffizient nach einer Wirkstoffbehandlung verändert und ob wahrscheinlich Veränderungen in der Lipidumgebung und/oder in Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Membran vorliegen.